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密级密级: 博士学位论文博士学位论文 CD146 在结直肠癌细胞干性及肿瘤发生中的功能及机制在结直肠癌细胞干性及肿瘤发生中的功能及机制 作者姓名作者姓名: 刘丹刘丹 指导教师指导教师: 阎锡蕴阎锡蕴 院士院士 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位类别学位类别: 理学理学 学科专业学科专业: 细胞生物学细胞生物学 研究所研究所: 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 二零一六二零一六 年年 五五 月月 The role of CD146 in colorectal cancer stemness and tumorigenesis By Dan Liu A Dissertation Submitted to The University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of Cell Biology Institute of Biophysics, Chinese Academy of sciences May, 2016 书脊书脊 3cm 左右 3cm 左右 CD146 在在 结 直 肠 癌 细 胞 干 性 及 肿 瘤 结 直 肠 癌 细 胞 干 性 及 肿 瘤 发 生 发 生 中 的 功 能 及 机 制 中 的 功 能 及 机 制 刘 丹 刘 丹 中 国 中 国 科 学 院 大 学 科 学 院 大 学 关于学位论文使用权声明 任何收存和保管本论文各种版本的单位和个人,未经著作权人授权,不得将本论文转 借他人并复印、抄录、拍照、或以任何方式传播。否则,引起有碍著作权人著作权益之问 题,将可能承担法律责任。 关于学位论文使用授权的说明 本人完全了解中国科学院生物物理研究所有关保存、使用学位论文的规定,即:中国 科学院生物物理研究所有权保留学位论文的副本,允许该论文被查阅;中国科学院生物物 理研究所可以公布该论文的全部或部分内容,可以采用影印、缩印或其他复制手段保存该 论文。 (涉密的学位论文在解密后应遵守此规定) 签 名: 导师签名: 日 期: 关于学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文是本人在导师指导下,独立进行研究工作所取得的 成果。尽我所知,除文中已经注明引用的内容外,本学位论文的研究成果不包含任何他人 享有著作权的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集体,均已在文中 以明确方式标明。 签 名: 导师签名: 日 期 致谢 I 致致 谢谢 本论文是在阎锡蕴院士的悉心指导下完成的。六年的研究生学习阶段即将画上句号, 在这里,衷心感谢阎老师在这六年的时间里,给予我的培养及历练。在科研工作中,阎老 师不仅在课题设计方面给予指引,同时不断帮助我提升科研素养以及逻辑思维能力;每当 面临困境, 阎老师则给予我极大的支持和鼓励, 帮我开阔科研思路, 助我克服困难。 此外, 阎老师秉承“科研是一种境界,自在使女人升华”的人生哲学以及“爱科学、爱生活、爱 美“的精神风貌,也给我树立了一个良好的女性榜样,指引我在人生道路上的扬帆远行。 忠心感谢实验室的冯静、杨东玲、王兆卿、梁敏敏、段德民、张德玺、王飞、郑继燕、 丁军等老师在科研道路上的引领及榜样力量;感谢卢迪、宋丽娜和董碧宇三位老师在细胞 培养方面给予的指导和协助;感谢邢澍师兄,在进实验室之初,给予我实验技能上的言传 身教和认真指导;感谢段红霞、罗永挺、凃涛、范克龙等师兄师姐以及吴真真、晏荟文、 张健林、陈佳楠、江冰、周萌等师弟师妹们的帮助与支持;感谢王玉春师傅为我们营造了 良好的实验室环境,实验室这个大家庭中点点滴滴的记忆和丝丝缕缕的情谊,将镌刻在我 的生命里,值得永久珍藏和回味。 十分感谢中科院动物所陈佺教授和杜蕾老师作为本课题的合作方,在起步之初给予的 帮助和指导。感谢北京安贞医院病理科陈东主任所提供的临床样本资源,让我懂得科研与 临床的合作之道。此外,还要感谢蛋白质与多肽药物中心的秦志海教授、梁伟教授、杭海 英教授、 杨福全教授及松田善卫教授对研究生考核及课题的指点和建议。 感谢范祖森教授、 杨义力教授以及叶中德老师、卜鹏程博士在文章投稿过程中给予的修改意见。感谢所科学 技术平台贾俊英、郝俊峰、陈媛媛、史想、陈宝君、田海超等老师在实验技术和动物饲养 等方面给予的帮助和支持。感谢研究生处刘勤瑞、熊勤及曾慧等老师的帮助和指导。感谢 北京迈康斯德医药技术有限公司总裁杨启成博士及公司成员王丽平等同事,在基础研究向 临床转化相关工作中对我的提携,让我有幸了解和接触药物研发等新领域和新技能。 最后特别感谢我的父母一直以来对我“严而不历,温而不愠”的教养和爱护,伴随着 我成长和成人。无论身处何方,你们始终是我最坚实的后盾,反哺之心,山高水长!感谢 我的大学恩师杨旭教授, “一日为师,终生为父”,是您的推荐和“与人为善,谨言慎行” 的人生格言,引领我从本科迈入研究生的征程!感谢我的舞蹈老师和瑜伽老师们,助我保 持良好的精神风貌和身心健康!也感谢我的爱人以及亲朋好友,一路陪伴、包容和体贴, 同时见证我的成长与改变,祝愿你们一生平安,幸福快乐! 刘丹 2016 年 5 月 摘要 II 摘摘 要要 恶性肿瘤是当代医学面临的巨大挑战,严重威胁人类健康。肿瘤干细胞理论为肿瘤的 耐药以及复发提供了合理的解释,同时也为癌症治疗提供了新的思路。然而,目前我们对 于肿瘤细胞干性的认知仍不够全面。阐明与肿瘤干性相关的分子特征以及调控机制,一直 是肿瘤领域的研究热点。 细胞黏附分子 CD146 最初被鉴定于恶性黑色素瘤细胞上, 主要参 与血管新生及肿瘤转移。 近年来, 诸多报道提示, CD146 作为间充质干细胞的表面标记物, 可能与细胞多能性相关。也有少数研究发现,CD146 表达于人类原发肉瘤及子宫肌瘤干/ 祖细胞亚群中。此外,实验室的前期工作还发现,CD146 作为 Wnt5a 受体介导非经典 Wnt 信号传导,同时拮抗经典 Wnt 信号,从而促进细胞迁移和斑马鱼胚胎的集中延伸。经典 Wnt 通路与结直肠癌肿瘤发生有着密切关系,且在结直肠癌干细胞的自我更新中发挥关键 作用。然而,对于 CD146 是否在肿瘤细胞干性及结直肠癌的发生中发挥功能尚不清楚。 针对上述科学问题,我们以结直肠癌为模型,采用慢病毒介导的 shRNA 干扰技术, 敲低原代结直肠癌细胞系 P6C 以及结直肠癌细胞系 SW480 亚群上 CD146 表达,结合细胞 全基因组表达谱分析及临床病理信息分析, 首先探究了 CD146 对结直肠癌细胞致瘤性、 干 性分子表型及相关生物学行为的影响。连续异种移植成瘤实验结果表明,shRNA 敲低 CD146 表达的结直肠肿瘤细胞,在非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠体 内形成肿瘤的潜伏期较短,肿瘤发生率更高。此外,肿瘤细胞上 CD146 表达水平与移植瘤 及病人结直肠癌组织的恶性程度及分化水平呈负相关。体外细胞水平的研究显示,CD146 敲低表达诱使结直肠癌肿瘤细胞上调表达干性相关转录因子及细胞表面标志物,如 Sox-2、 EpCAM 等。更重要的是,敲低 CD146 表达的细胞在无血清悬浮培养中成球能力,以及在 三维软琼脂培养体系中克隆形成能力增强,体现出干细胞的自我更新能力增强。同时,我 们还发现,CD146 敲低表达引起结直肠癌细胞对化疗药物奥沙利铂 (L-OHP) 及 5-氟尿嘧 啶 (5-FU) 诱导的凋亡抵抗,进一步研究发现 CD146 低表达的细胞增殖相对缓慢,处于细 胞周期 S 期的比例较少,且高表达膜转运蛋白 ABCG2,这些结果表明,CD146 敲低表达 使得部分结直肠癌细胞进入静息期,对化疗药物的敏感性降低。为了进一步阐明上述现象 的分子机理,我们通过多株结直肠癌细胞系及临床样本分析发现,肿瘤细胞膜上 CD146 的表达水平与 Wnt/-catenin 活性以及致瘤性呈负相关。全基因组差异表达谱数据显示, CD146 的下调导致一系列 Wnt 靶基因的转录激活及蛋白表达上调。 进一步生物化学方法揭 示, CD146 下调表达能够抑制其下游 NF-B/p65 信号的激活, 进而减少 p65 依赖的 GSK-3 转录及表达, 从而抑制经典Wnt的效应因子-catenin的降解, 促进其转运入核并与TCF/LEF 形成复合体,最终激活经典 Wnt 通路下游一系列干性相关靶基因的转录。总之,我们的研 究表明, CD146 敲低表达能够激活结直肠癌细胞经典 Wnt/-catenin 信号,从而重塑干细胞 摘要 III 样分子表型、自我更新、耐药性及肿瘤起始能力。此外,我们还发现 CD146 同时介导结直 肠肿瘤细胞中非经典 Wnt/JNK 通路的激活,这一通路曾被报道促进细胞迁移和肿瘤转移, 这提示我们 CD146 可能通过调节 Wnt 通路的不同分支,进而抑制结直肠癌的发生但促进 其转移。本研究的创新点及科学意义在于:(1)首次发现 CD146 是结直肠癌细胞干性及 肿瘤发生的负调控因子,并阐明了相关的分子机制,为干细胞的可塑性提供了新的证据, 同时也为针对肿瘤干性的癌症靶向治疗策略提供了新思路;(2)揭示了黏附分子 CD146 在结直肠癌发生及转移过程中可能扮演的双重角色及相关作用机理, 为以 CD146 为靶点的 个性化药物开发以及肿瘤治疗提供参考与借鉴。 关键词关键词: CD146,肿瘤发生,细胞干性,Wnt 信号通路,结直肠癌 Abstract IV Abstract Cancer poses serious threat to human healthcare. Cancer stem cell (CSC) theory provides rational explanation for therapy resistance and tumor relapse. It also provides new insight into the cancer therapeutics. However, the whole portrait of cancer stemness is still poorly understood. The investigations of molecular traits and regulatory mechanism governing cancer stemness have draw much attention in cancer research. CD146 has been initially identified in malignant melanoma cells. It functionally contributes to tumor angiogenesis and metastasis. In the last few years, compelling studies have revealed that CD146 is a surface marker for mesenchymal stem cells (MSCs), implying the potential role of CD146 in pluripotency. Recently, CD146 has also been found expressed on the tumor-initiating/progenitor cells in primary human sarcoma and fibroids. Moreover, our previous study has reported that CD146 acts as a Wnt5a receptor to activate the non-canonical Wnt and antagonizing canonical Wnt signaling, thus promotes convergent extension in zebrafish embryonic development. The canonical Wnt signaling is closely related with colorectal carcinogenesis, and also plays a crucial role in self-renewal of CSC. Nevertheless, the potential role of CD146 on colorectal cancer stemness and tumorigenesis remains unclear. In our study, based on the establishment of shRNA transfected-cell lines, together with the whole-genome expression profiling and clinical pathological information, we first investigated the effects of CD146 on the tumorigenicity, stem-like phenotype and biological behaviors of CRC cells. In serial xenotransplantation, CD146 knockdown facilitates tumor initiation in NOD/SCID mice. Moreover, CD146 is negatively correlated with the malignancy and differentiation grade in xenografts and patient CRC tissues. In vitro, knockdown of CD146 in CRC cells up-regulates the stemness-related transcriptional factors and surface biomarkers, including Sox-2 and EpCAM. More importantly, CD146 knockdown cells show enhanced self-renewal capacity, as determined by sphere formation in serum-free suspension cultivation and clone-formation in soft-agar culture system. Moreover, knockdown of CD146 leads to decreased susceptibility to chemotherapeutic agent (L-OHP and 5-FU) induced-apoptosis. Further investigation reveals that the knockdown cells proliferate slowly and less of them are in S-phase cell cycle, but express high level of transport protein ABCG2. These results demonstrate that knockdown of CD146 causes cell cycle arrest and drug resistance in CRC cells. To further elucidate the underlying mechanism, we also analysized the CRC cell lines and primary CRC specimens, both of which show the negative correlation between CD146 expression and Abstract V -catenin activity. Differential gene expression profile indicates that numerous of Wnt-targeted genes are up-regulated in CD146 knockdown cells. Mechanism studies demonstrate that knockdown of CD146 inhibits NF-B/p65-mediated GSK-3 expression and subsequently promotes the stabilization and nuclear translocation of -catenin, which ultimately leads to the transactivation of stemness-related target genes. Taken together, our studies demonstrate that knockdown of CD146 activates the canonical Wnt/-catenin signaling, thus restores stem-like phenotype, self-renewal, drug resistance and tumor-initiating capacity in CRC cells. In addition, we also found that CD146 on CRC cells simultaneously activates the non-canonical Wnt/JNK pathway, which promotes cell migration and tumor metastasis. These results imply that CD146 might suppress tumorigenesis but promote metastasis through regulating different Wnt cascades in CRC. The novelty of this study includes: (1) first discovery of CD146 as a negative regulator of CRC stemness and tumorigenesis, and elucidating the underlying molecular mechanism, which provides new evidence for stem cell plasticity and sheds new light on stemness-targeted therapeutic strategies; (2) implying the dual role of CD146 in CRC progression and the potential mechanism, which will benefit the CD146-targeted personalized drug development and cancer treatment. Key words: CD146, stemness, tumorigenesis, Wnt pathway, colorectal cancer 目录 VI 目目 录录 致 谢 I 摘 要 . II Abstract . IV 目 录 . VI 文献综述 . 1 1 肿瘤细胞干性 1 1.1 肿瘤研究历史与演进 .1 1.2 肿瘤干细胞的分子特征 .5 1.3 肿瘤干细胞的生物学特性 .8 1.4 肿瘤细胞干性的调控 .15 1.5 问题与展望 .18 2 CD146 与肿瘤发生发展 .19 2.1 CD146 分子结构及表达谱 .19 2.2 CD146 的生物学功能 .21 2.3 CD146 介导的信号通路 .25 2.4 问题与展望 27 研究内容 . 29 概述 29 1 材料与方法 31 1.1 实验材料 .31 1.2 实验方法 .33 2 实验结果 41 2.1 建立及鉴定稳定敲低 CD146 表达的结直肠癌细胞株 .41 2.2 CD146 低表达促进结直肠癌肿瘤发生及恶性程度 .42 2.3 CD146 敲低表达诱导结直肠癌细胞再现干细胞表型 .45 2.4 CD146 敲低表达诱导结直肠癌细胞产生耐药性 .47 2.5 CD146 表达水平与结直肠癌细胞经典 Wnt 活性负相关 49 2.6 CD146 抑制结直肠癌细胞经典 Wnt 活性 52 3 小结与讨论 62 4 后续研究 66 参考文献 . 71 附录 . 87 作者简介及在读期间发表的学术论文与研究成果 . 89 文献综述 1 文献综述文献综述 1 肿瘤细胞干性肿瘤细胞干性 1.1 肿瘤研究历史与演进肿瘤研究历史与演进 从上世纪至今,癌症已经成为世界范围内由疾病导致死亡的主要病因1-3。2012 年, 世界人口死亡总数的 15%皆是由于癌症导致,至 2016 年,仅美国就有 1,685,210 个新 增癌症病例出现,恶性肿瘤给全人类的健康造成了极大的威胁4 , 5。由于癌症易于转移和 复发,癌症的预防和彻底治愈也成为医学界最大的挑战。为了全面的了解癌症的起源与发 展,进而有助于癌症的诊断及治疗,各个学科的科学家们分别从多个分支领域开展了对恶 性肿瘤的探索。综合近一个世纪的学术热点和研究进展来看,癌症的研究经历了几个不同 的历史阶段。早在 20 世纪初,随着现代遗传学的发展和家族性遗传肿瘤的发现,人们开 始意识到肿瘤是一种复杂的多基因遗传病。 随后, 化学诱变剂致癌的发现引起大量的关注。 20 世纪 70 年代,肿瘤病毒导致细胞癌变的研究迅速兴起6。20 世纪 70 至 80 年代,关于 癌基因与抑癌基因的研究推动了肿瘤遗传学的发展7。从 20 世纪 90 起,随着胚胎干细胞 及诱导多能干细胞的发现及应用研究,干细胞概念的引入开辟了肿瘤研究的新领域,同时 为癌症的靶向治疗提供了新的契机8-10。国际上著名的研究机构及科研人员已开始致力于 将癌干细胞由基础理论研究推向临床应用,然而国内在此领域的研究依然不够完善,亟待 突破技术和思维瓶颈,从而推动我国抗肿瘤药物的自主研发以及临床应用。 1.1.1 克隆演化学说克隆演化学说 关于肿瘤的起源与发展模型, 科学家们曾先后提出了两类重要学说: 克隆演化 (Clonal Evolution)学说和肿瘤干细胞(Cancer stem cell,CSC)学说11 , 12。传统的克隆演化学说 由科学家 Peter Nowell 于 1976 提出13,该学说的核心论点是:肿瘤起源于长期积累一系列 基因突变的正常体细胞,由于内外部环境的影响,正常体细胞发生突变,这些突变的细胞 又会继续产生遗传变异的子代克隆,如此循环,从而演变成多克隆,这些克隆具备不同的 生存和增殖能力,部分克隆在环境选择压力下被淘汰,另一部分克隆则得以幸存并在进化 过程中大量增殖,并具有相同的引发新生肿瘤的能力(图 1.1a)14。然而该学说的缺陷在 于:忽略了肿瘤内部非遗传异质性以及少数克隆间的相互作用。基于肿瘤细胞与正常细胞 在增殖活性上的差异,传统的抗肿瘤药物选择靶向快速增殖的肿瘤细胞,并寄望于能够杀 死全部的肿瘤细胞,从而防止肿瘤的复发。然而,临床治疗方案并没有获得到实质性的效 果,部分肿瘤甚至出现放化疗抵抗,转移或复发,病人预后情况不容乐观。肿瘤的克隆演 化模型并不能合理的解释这些现象, 因此, 该学说的正确性和广谱性开始遭到质疑与挑战。 CD146 在结直肠癌细胞干性及肿瘤发生中的功能及机制 2 1.1.2 肿瘤干细胞肿瘤干细胞学说学说 随后,科学家们在肿瘤研究领域引入了干细胞的新概念,提出肿瘤干细胞理论:肿瘤 起源于肿瘤组织中极少数积累了基因突变的干细胞,其具有自我更新、多向分化及肿瘤起 始能力,能够形成与原发瘤类似具有异质性的肿瘤(图 1.1b)。由于大多数普通肿瘤细胞 并不能够起始肿瘤的发生,因而 CSC 也是导致肿瘤耐药、转移或复发的根源15。肿瘤干 细胞学说不同于克隆演化学说之处在于:所有的肿瘤细胞间存在异质性,肿瘤内部存在分 化等级结构,突变的体细胞寿命有限,只有干细胞分裂周期缓慢且在体内大部分处于休眠 状态,因而能够存活足够长的时间来积累突变,成为肿瘤发生的种子细胞。由于其增殖缓 慢,靶向快速增殖细胞的传统放化疗方法对 CSC 并不具备杀伤作用,反而逃避药物作用, 并在后期引起肿瘤复发。因此只消灭 CSC,才能彻底的根治肿瘤。这一学说的提出为肿瘤 的耐药性提供了合理的解释,不仅弥补了克隆演化学说的不足,同时为我们打开了肿瘤发 生发展机制的新视角。 图 1.1 肿瘤起源的两种学说12。 (A)克隆演化学说:来源于单克隆的后代子细胞积累不同的基因突 变,演化成多克隆,所有类型的肿瘤细胞均具有自我更新及快速增殖能力,从而形成新生肿瘤。 (B) 肿瘤干细胞学说:在由于基因突变导致异质性的肿瘤细胞中,多数肿瘤细胞仅具备有限的增殖能力,仅 有少部分 CSC 能够实现自我更新并起始肿瘤发生。 这一学说的提出有着很长的历史渊源并且不断得到后续研究的支持。早期的学者们基 于对畸胎瘤的认识,意识到肿瘤的发生与早期胚胎发生过程有着许多共通之处,例如胚胎 细胞的定位与分化十分类似于肿瘤细胞的侵袭和转移16。随着胚胎干细胞研究的深入,研 究者们又发现肿瘤细胞与干细胞在基因水平以及生物学行为等方面存在诸多类似的特征, 例如部分在胚胎干细胞维持中被甲基化抑制的基因,在肿瘤细胞中被过度激活,且肿瘤与 干细胞同样具备无限增殖的潜能17 , 18,暗示干细胞可能在肿瘤的发生发展中也扮演一定 的角色。 事实上, 肿瘤干细胞研究最早始于造血系统肿瘤及造血干细胞 (Hematopoietic stem cell, HSC)的研究。1958 年,Hewitt 团队在对白血病细胞致瘤性的研究中发现,只有极 少部分的白血病细胞能够在体外形成克隆19。另有研究发现,HSC 基因突变会导致白血病 文献综述 3 的产生,表明肿瘤细胞可能起源于突变的成体干细胞。直到 1994 年,肿瘤干细胞研究的 开山鼻祖 Dick 从人急性髓样白血病(Acute myeloid leukemia, AML)中分离并鉴定出 CD34+/CD38 -表型的细胞亚群,这一小群细胞能够在免疫缺陷小鼠体内重建 AML,首次发 现了白血病干细胞(Leukemic stem cell, LSC)的存在20。1996 年,慢性粒细胞白血病 干细胞也被分离鉴定出来,并在体外传代培养21。基于上述发现,研究者们提出肿瘤干细 胞理论,该理论的建立获得大量关注,并引发肿瘤干细胞研究热潮。随后,各类实体瘤的 CSC 亚群相继被鉴定及分离。2003 年,Al-Hajj 等发现在乳腺癌细胞中只有极少数 CD44+/CD24-的细胞在免疫缺陷小鼠模型中能够引发肿瘤,因而这群细胞被定义为乳腺癌 干细胞22。Singh 等则首次通过体外悬浮细胞球的培养及异种抑制瘤实验从脑胶质瘤细胞 中分离鉴定出胶质瘤干细胞亚群23。2007 年,Dick 和 De Maria 研究团队首次发现极少数 CD133+的结直肠癌细胞能够启动异种移植瘤的发生,进而提出 CD133+的细胞亚群具有结 直肠癌干细胞的特性24 , 25。其他被分离鉴定的实体瘤干细胞还包括前列腺癌干细胞、肝 癌干细胞和胰腺癌干细胞等26-28。这些发现为肿瘤干细胞理论的普适性提供了进一步的证 据支持。 然而,上述大部分研究都是基于表面标志物的表达,结合流式分选技术以及 PDX 模 型(patient derived xenograft model)分离鉴定了干细胞亚群,并没有找到 CSC 在体内真实 存在的实验证据,因此部分学者依然对肿瘤干细胞理论心存质疑。直到 2012,肿瘤干细胞 理论研究获得里程碑式的突破,Science 杂志首次报道了 Clevers 团队利用谱系追踪技术在 小鼠体内定位了 Lgr5+的干细胞,并证明只有这一小群细胞能够驱动肠腺瘤的形成,是所 有肿瘤细胞的祖先29 , 30,这一发现证实了 CSC 在体内的真实存在。与此同时,研究者们 利用谱系追踪技术同样在真实的鳞状皮肤肿瘤中定位到了 CSC31。随后,研究者们也利用 该技术证明了单个 Tlx+脑瘤细胞能够实现自我更新并生成 Tlx-的肿瘤细胞,并通过基因敲 除老鼠证实了原发肿瘤中干细胞对小鼠生存期的影响,因而可以作为胶质母细胞瘤的潜在 治疗靶标32。上述研究均为肿瘤干细胞理论提供了体内的支持证据。 尽管如此,随着癌症研究的广泛开展和逐步深入,肿瘤干细胞研究依然存在较多的瓶 颈。 首先针对不同类型的肿瘤, 缺少统一且特异的标志物, 能够单独用于分离及鉴定 CSC。 此外,由于干细胞在肿瘤中所占比例极小,且随肿瘤类型的改变而变化,其分离检测较为 困难,即使体外成功分离,也不一定得到纯度很高的 CSC 亚群。而且异种移植实验并不能 完全模拟人体内的肿瘤微环境,其结果的重现性很大程度上依赖具体的实验体系及操作。 这些技术上的瓶颈无疑阻碍了肿瘤干细胞研究的进程。 1.1.3 克隆演化和克隆演化和肿瘤干细胞肿瘤干细胞学说统一学说统一 近年来, 研究者也逐渐认识某些类型肿瘤的特殊性和复杂性。 例如在恶性黑色素瘤中, 有 30%的肿瘤细胞均具有类似 CSC 的功能,并不符合 CSC 比例极小的论点,因此肿瘤干 细胞学说又一次遭到质疑。而在乳腺癌中,研究人员通过单细胞基因组测序技术发现,不 CD146 在结直肠癌细胞干性及肿瘤发生中的功能及机制 4 同的乳腺癌亚型包含不同基因组变异的肿瘤亚克隆,大部分雌激素受体 ER+的乳腺癌细胞 对雌激素疗法敏感,而少部分的三阴性乳腺癌细胞具有不同的变异率,对传统放化疗不敏 感33。因此,肿瘤干细胞学说并不能完全阐明所有类型肿瘤的发生机制。我国的研究人员 高建新教授也意识到该理论的缺陷, 并分离出癌前干细胞 (precancerous stem cell, pCSC) , 改进了肿瘤干细胞模型,他认为肿瘤干细胞也可能起源于正常的体细胞,随着肿瘤的发生 发展,肿瘤起始细胞(Tumor initiating cell,TIC)会演化为 pCSC,从而进化到 CSC,肿 瘤干细胞也存在不同的发生发展阶段34。 新的研究表明克隆演变和肿瘤干细胞两种模式可能同时存在于肿瘤的发生发展过程 中,因而学者们提出有机整合肿瘤发生发展的克隆进化模型和肿瘤干细胞模型,形成新型 肿瘤进化模型,可能更为接近事实35-37。在克隆演化模式下,随着肿瘤的进展,单克隆起 源的肿瘤细胞积累不同的遗传突变,形成多种不同的克隆群体,构成了肿瘤实体;在克隆 进化的平行时段,干细胞也会发生动态演化,形成具有基因型及表型异质性的 CSC 亚群, 另一方面, 不断进化的肿瘤细胞也可能获得自我更新及分化潜能, 从而产生新的 CSC 亚群 (图 1.2)。多个研究团队分别在 B 细胞淋巴瘤及 T 细胞淋巴瘤中证实了 CSC 亚克隆的遗 传多样性38 , 39。此外,Glimm 及其同事在结直肠癌干细胞池中也发现了多个功能各异的 干细胞亚群,包括具有长期自我更新能力的肿瘤起始细胞 TIC,仅具有限自我更新能力的 短暂扩增细胞以及延迟发挥致瘤作用的 TIC40。 上述研究结果间接反映了 CSC 的演化和不 同起源,为肿瘤细胞的异质性和可塑性提供了新的证据,同时提示我们用动态而非绝对的 观点去认识肿瘤干性。新的肿瘤演化模型整合了肿瘤随机进化模型和肿瘤干细胞模型,将 有助于缩小肿瘤基础研究与临床表现之间的鸿沟。 图 1.2 克隆演化与肿瘤干细胞学说统一模型36。随着时空的演进和遗传变异的积累,癌细胞由单克隆 逐步演化成多克隆,同时 CSC 亚群在在分化成普通肿瘤细胞的同时,也可能发生动态演化,形成不同 的干细胞亚群,这些亚群均具有自我更新能力,但在肿瘤中出现的频率及分化能力上表现出差异性。同 时,肿瘤细胞也可能发生逆分化回到干细胞的状态。 文献综述 5 1.2 肿瘤干细胞肿瘤干细胞的分子特征的分子特征 1.2.1 肿瘤干细胞肿瘤干细胞表面标记物表面标记物 科学家们已经发现 CSC 的存在, 但对其生物学特征的了解并不全面。 为了更好的研究 CSC,我们需要从大量的肿瘤细胞中分离此亚群,以便开展体外研究。由于 CSC 在肿瘤中 所占的比例极小, 早期的研究主要基于 CSC 标志物的表达水平, 通过流式细胞仪分选的方 法来富集干细胞亚群。 在不同的肿瘤类型中, CSC 表达多种不同的特征性标志物, 如 CD44、 CD133、EpCAM、Integrin 1 等(表 1.1)。 上述生物标志分子不仅作为 CSC 鉴定的依据, 同时在干细胞功能维持中发挥着重要作 用。例如 CD44 分子在 CSC 的研究中曾受到广泛关注。黏附分子 CD44 属于跨膜糖蛋白, 是胞外透明质酸的受体, 参与细胞黏附、 淋巴细胞的归巢和激活、 细胞迁移等过程41。 CD44 表达受 Wnt 信号的调控,且接受胞外微环境信号的刺激传导相关信号到胞内,或间接的与 细胞骨架相互作用,在肿瘤的发生和转移中发挥重要角色42。研究表明,CD44 分子在造 血系统或上皮来源的 CSC 上异常高表达。Du 等研究发现,100 个 CD44+的结直肠癌细胞 即可在裸鼠体内形成肿瘤,且单个细胞也可在体外形成细胞球,敲低 CD44 表达能够显著 抑制细胞的克隆形成及致瘤性43。在肿瘤组织中 CD44 的表达也与结直肠癌患者的不良预 后显著相关44。另有研究表明,CD44 的变异体 CD44v6 受到细胞因子刺激后上调表达, 能够促进结直肠癌的转移,低水平的 CD44v6 预示着结直肠癌病人的生存率提高45。在乳 腺癌中, CD44+CD24-/low/EpCAM+亚群细胞表现出更强的自我更新及耐药性46。 此外, CD44 也被视为前列腺癌、胰腺癌、肺癌、胃癌、卵巢癌、鼻咽癌及头颈癌干细胞的生物标记物 47。 此外,CD133 也是 CSC 研究中报道较多的黏附分子。CD133 最早被用于分离和鉴定 脑胶质瘤 CSC23。随后在结直肠癌肿瘤起始细胞中也发现其特异性表达,极少数 CD133+ 的细胞即可引发移植瘤的发生24 , 25。也有研究者发现在肝癌细胞系中,CD133+细胞亚群 与 CD133-的细胞亚群相比,表现出更强的克隆形成能力及体内致瘤性27。因此,CD133 最初被认为是特异的 CSC 表面标志物。然而,后续的研究得出不同的结论。首先,在胶质 母细胞瘤中 CD133-的细胞亚群也能起始肿瘤的发生,CD133 的表达可能与胶质瘤 CSC 的 定位有关,而与是否具备 CSC 的特性并无直接关联48。Wang 等人还发现,CD133-细胞能 够产生 CD133+的子代细胞,说明 CD133-细胞中也可能包含干细胞亚群49。此外,还有研 究报道,CD133 分子并不能严格鉴定结直肠癌 CSC,CD133+及 CD133-的转移性结直肠癌 细胞亚群均能够在体外形成细胞球,且在连续异种移植实验中起始肿瘤的发生。不同的是 CD133-亚群主要包含 CD44+CD24-细胞,更容易形成侵袭性的肿瘤,而 CD133+亚群则表现 出 CD44low/CD24+的分子表型50。上述一系列研究结果表明,CD133 并非 CSC 十分特异的 标志分子, 但可用于定义 CSC 中不同的亚群。 相对于极富争议的 CD44+CD133+分子表型, Dalerba 提出 EpCAMhigh/CD44+/CD166+表型组合更适用于结直肠癌 CSC 的分选和富集51。 CD146 在结直肠癌细胞干性及肿瘤发生中的功能及机制 6 近年来, 上皮特异性黏附分子 EpCAM 也被发现在 CSC 上高表达且参与自我更新的维 持22 , 52。EpCAM 分子表达于包括结直肠癌在内的腺癌、部分鳞状细胞癌、成视网膜细胞 瘤及肝细胞肝癌上, 其参与细胞增殖和迁移等过程53。 Yamashita 等在肝细胞肝癌中发现, EpCAM 表达水平受 Wnt/-catenin 通路调节,且可作为肝癌预后的指标54。另外,Maetzel 等还发现在肿瘤中 EpCAM 分子能够介导与 E-cadherin 及 Wnt/-catenin 的交流串话,促使 被 E-cadherin 蛋白锚定在膜上的 -catenin 解离下来,与 EpCAM 胞内段形成复合物,转运 至细胞核内,激活 Wnt 下游 c-Myc、cyclins 等基因的转录,因而也可能参与肿瘤的发生及 干细胞命运决定55。另有研究报道,EpCAM 在正常的干/祖细胞中表达上调,一旦发生分 化则表达水平降低56 , 57。这些研究提示我们,作为干细胞标志物的 EpCAM 也参与胞内 信号的转导及干细胞特性维持。 表 1.1 CSC 的生物标志物 肿瘤类型肿瘤类型 标志物标志物组合组合 参考文献参考文献 白血病 CD34+/CD38- 20, 21 乳腺癌 CD44+/CD24-/low 22 ALDH-1 58 CD44+/CD24-/low/EpCAM+ 46 胶质瘤 CD133+ 23 结直肠癌 CD133+ 24, 25 CD44+ 59 EpCAMhi/CD44+/CD166+ 51 Integrin 1+ 60 ALDH1+ 61 CD24+ 62 前列腺癌 CD44+/Integrin 21hi/CD133+ 26 Scal+ 63 肝癌 CD133+ 27 胰腺癌 EpCAM+/CD44+/CD24+ 28 肺癌 CD133+/CD34+/CD44+ 64 胃癌 CD44+ 65 CD26+/CD44+ 66 卵巢癌 CD44+/CD117+ 67 鼻咽癌 CD44+ 68 CD24+ 62 头颈癌 CD44+ 69 CD133+/EpCAM+ 70 除了上述黏附分子以外, 还有诸多分子如整合素家族蛋白 Integrin、 膜转运蛋白 ABCG2 等被用于 CSC 的鉴定。然而,表面标志物的界定,一直存在诸多争议。在不同的肿瘤类型 文献综述 7 及不同的实验体系中,并没有完全统一的标志物去定义 CSC 亚群71。而且,绝大多数表 面标志物也在普通肿瘤细胞上表达,相对于单一标志物,通常采用多个标志物的组合来鉴 定和分选 CSC 亚群。迄今为止,不断有新的标志分子被发现,但相关的生物学功能还有待 进一步研究。 1.2.2 干细胞相关转录因子干细胞相关转录因子 2006 年,中山伸弥等科学家通过诱导四个关键的转录因子(Oct-4、Sox-2、Nanog、 c-Myc)表达,使成纤维细胞发生基因重编程,转变为诱导型多功能干细胞。CSC 与胚胎 干细胞具有一定的相似性,也高表达一系列的转录因子如 Oct-4、Sox-2、Nanog、c-Myc、 Bmi 等。这些转录因子调控许多基因的表达,在维持干细胞的自我更新及体细胞重编程过 程中发挥关键作用,也决定着 CSC 的命运。其中 Oct-4 与 Sox-2 及 Nanog 形成的三元复合 体是维持亚全能性的主要开关。研究发现 Oct-4 等转录因子仅在具有多能性的内细胞团、 生殖细胞中维持表达,在分化的组织中不表达,而在癌组织中又检测到微量表达,且与肿 瘤的恶性程度及分化水平密切相关,表明这些转录因子同样在肿瘤的发生和发展中发挥重 要作用。Suva 等人发现色氨酸代谢产物能够抑制 Oct-4 的转录,从而促进干细胞向癌细胞 的分化,削弱其在异种移植模型中的致瘤性72,表明该转录因子活性的下降,可能导致肿 瘤细胞干性的耗竭。 此外, 肿瘤微环境的改变, 可能刺激这些干性转录因子重新上调表达, 从而使已分化的肿瘤细胞发生重编程,重塑干细胞表型。Julie 等人发现在低氧或低氧诱导 因子 HIF 的作用下,前列腺癌、脑瘤、结直肠癌等多种细胞系,上调表达 Oct-4,Nanog, Sox-2,Klf-4,c-myc 等转录因子,重新获得成球生长等干细胞的特性73。美国麻省总医院 的研究人员还发现,在胶质母细胞瘤中 Oct-7、Sox-2、Sall-2 及 Olig-2 四种转录因子联合 作用,能够促使分化良好的肿瘤细胞脱分化形成癌干细胞74。可见,这些转录因子同样也 决定了 CSC 自我更新或分化的命运走向。因此,除了细胞表面标志物,这些转录因子的表 达水平,能更好的辅助鉴定 CSC。 1.2.3 其他其他相关相关分子分子 除上述转录因子,CSC 与普通干细胞在分化标志物的表达上也存在较大差异。以结直 肠癌为例, 分化良好的结直肠癌上皮细胞表达 CDX-2、 广谱角蛋白 CK (AE1/AE3) 、 CK-20, 但不表达 CK-7,而未分化或低分化的癌干细胞上 CDX-2、CK-20、CK-7 均不表达,广谱 角蛋白 CK(AE1/AE3)不表达或呈低表达75。这些分化标志物的表达水平,同样有助于我们 鉴别癌细胞的分化程度。此外,CSC 还表达高水平的 ABC 家族转运蛋白76-78。近年来, 新的

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