CD146分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究

密级：密级： 博士学位论文博士学位论文博士学位论文博士学位论文 CD146CD146CD146CD146 分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究 作者姓名：作者姓名：曾曾 启启 群群 指导教师指导教师: : : :阎阎 锡锡 蕴蕴研研 究究 员员 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位类别学位类别: : : :博博 士士 学科专业学科专业: : : :细胞生物学细胞生物学 培养单位培养单位: : : :中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 2012201220122012 年年 5 5 5 5 月月 TheTheTheThe effectseffectseffectseffects andandandand molecularmolecularmolecularmolecular mechanismsmechanismsmechanismsmechanisms ofofofof CD146CD146CD146CD146 inininin breastbreastbreastbreast cancercancercancercancer invasioninvasioninvasioninvasion andandandand metastasismetastasismetastasismetastasis ByByByBy QiqunQiqunQiqunQiqun ZengZengZengZeng A A A ADissertationDissertationDissertationDissertation SubmittedSubmittedSubmittedSubmitted totototo GraduateGraduateGraduateGraduate UniversityUniversityUniversityUniversity ofofofof ChineseChineseChineseChineseAcademyAcademyAcademyAcademy ofofofof SciencesSciencesSciencesSciences InInInIn partialpartialpartialpartial fulfillmentfulfillmentfulfillmentfulfillment ofofofof thethethethe requirementrequirementrequirementrequirement ForForForForthethethethe degreedegreedegreedegree ofofofof DoctorDoctorDoctorDoctorofofofof CellCellCellCell BiologyBiologyBiologyBiology InstituteInstituteInstituteInstitute ofofofof Biophysics,Biophysics,Biophysics,Biophysics, ChineseChineseChineseChineseAcademyAcademyAcademyAcademy ofofofof SciencesSciencesSciencesSciences May,May,May,May, 2012201220122012 摘 要 1 摘摘摘摘 要要要要 侵袭转移是恶性肿瘤最致命的特征，该过程受到肿瘤细胞本身、肿瘤微环境 以及肿瘤细胞与远端脏器相互作用等一系列因素的复杂调控，并导致大于 90 肿瘤相关性死亡。我们实验室及其他实验室的研究均表明细胞黏附分子 CD146 分子与恶性肿瘤相关，可能参与肿瘤侵袭转移的过程。然而，CD146 分子在肿 瘤转移侵袭过程究竟发挥什么作用，其中涉及的机制及相关信号通路又是什么， 都不是很清楚。 在此项研究中，我们选用乳腺癌为研究模型来探索 CD146 分子在肿瘤侵袭 转移中的功能及其中涉及的机制。我们发现在上皮性质乳腺癌细胞中过表达 CD146 分子导致了上皮-间质转化（Epithelial-Mesenchymal Transition, EMT） ，细 胞形态由紧密连接的铺路石状变为长梭形，上皮细胞标记分子 E-cadherin 及 Cytokeratin 表达下调，而间质细胞标记 Vimentin 及 Fibronectin 重新表达，细胞 也因此获得极强的迁移及侵袭能力， 以及某些类似于乳腺癌干细胞的特征。 同时， 在间质性质乳腺癌细胞中下调 CD146 表达将抑制乳腺癌细胞的间质特征及恶性 转移行为。我们进一步探索了 CD146 诱导 EMT 发生的分子机制，发现 CD146 的过表达激活了小 G 蛋白 RhoA， 进而上调 EMT 重要转录因子 Slug 的表达； Slug 在转录水平抑制 EMT 关键分子 E-cadherin 的表达，从而起始整个 EMT 过程。 更重要的是，原位移植乳腺癌小鼠模型表明 CD146 诱导乳腺癌细胞发生 EMT 在体内水平促进肿瘤形成，降低肿瘤分化程度，并促进肿瘤发生原位侵袭 及远端转移。同时，我们对 505 例乳腺癌组织进行免疫组化分析发现，CD146 的表达与肿瘤分级高、细胞增殖标记分子 Ki-67 的表达以及患者预后差相关。 更 有意思的是，CD146 分子在恶性程度及致死率最高并具有 EMT 特征的三阴性乳 腺癌中高表达（68.9） ，并与 E-cadherin 的表达呈负相关，为我们之前的细胞 实验及动物实验提供临床依据。总而言之，我们的研究表明 CD146 分子通过诱 导乳腺癌细胞发生 EMT 的机制来促进乳腺癌的侵袭转移，因此，CD146 可以作 为治疗乳腺癌的一个新靶标，尤其是针对三阴性乳腺癌。 我们的后续工作中发现，CD146 过表达后完全间质转化的乳腺癌细胞在 Matrigel 胶上能自发形成血管样结构，或者与人脐静脉内皮细胞 HUVEC 共同形 CD146 分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究 2 成血管样结构，而靶向 CD146 的 siRNAs 则可以抑制这些功能，暗示着 CD146 分子诱导 EMT 发生可能进一步参与了肿瘤血管拟态或马赛克血管形成。也就是 说 ， CD146 分 子 可 能 促 进 乳 腺 癌 细 胞 发 生 上 皮 - 间 质 - 内 皮 转 变 （Epithelial-Mesenchymal-Endothelial Transition，EMET） 。同时，为了进一步探 索 CD146 诱导 EMT 发生下游复杂的信号调控网络，我们结合了 SILAC 标记及 Affymetrix 基因芯片的方法，试图从蛋白水平及 mRNA 水平揭示在乳腺癌细胞 中由 CD146 表达引起的信号通路及调控网络的变化，希望借此来发现 CD146 分 子的新功能及新机制。 本论文的第二部分工作为利用Cre-LoxP系统构建内皮特异性CD146基因敲 除小鼠，在体内水平探索 CD146 分子在血管生成中的功能。我们在小鼠 CD146 基因启动子区及第一个外显子区两端的内含子区插入两个 LoxP 位点，获得 CD146 条件性基因敲除小鼠(CD146floxed/floxed)， 再将该小鼠与内皮细胞特异性表达 Cre 酶的小鼠（Tie2Cre/+）进行杂交，最终获得内皮特异性 CD146 基因敲除小鼠 (CD146EC-KO)。该小鼠不会胚胎致死，且可正常繁育后代，成体中视网膜血管形 态及密度均未见异常。为了进一步探索 CD146 分子在病理血管生成中的作用， 小鼠黑色素瘤细胞 B16F10 及纤维肉瘤细胞 MCA-205 被皮下注射到 CD146EC-KO 小鼠及野生型对照小鼠（WT）体侧。16 或 24 天后，在 CD146EC-KO小鼠体内生 长的 B16F10 及 MCA-205 肿瘤体积均分别比对照小鼠小 39.1 或者 54.2， 而 CD31 标记的肿瘤血管密度也更少。 主动脉实验表明 CD146EC-KO小鼠血管重新生 成的能力也比对照小鼠更弱。这些体内实验结果说明 CD146 分子可能不参与胚 胎发育过程中的血管发生及血管生成过程， 也不影响成体中某些正常的血管生成 过程，而是在病理的血管生成过程，例如肿瘤生长，发挥着关键作用。 关键词CD146，肿瘤转移侵袭，乳腺癌，上皮-间质转化（EMT） ，E-cadherin， RhoA，Slug，三阴性乳腺癌，靶标，基因敲除小鼠，肿瘤血管生成 Abstract 3 AbstractAbstractAbstractAbstract Qiqun Zeng (Cell Biology) Directed by XiyunYan Invasion and metastasis are the most deadly features of malignant tumors, accounting for greater that 90% cancer-related mortality. Our previous studies and othersworks indicated that CD146, a cell adhesion molecule, is clinically associated with invasive tumors, and might have functions in tumor invasion and metastasis. However, its exact roles in tumor invasion and metastasis, and its potential functions of mediating downstream signaling are still unclear. In present study, we chose breast cancer as a research model to explore the exact role of CD146 in tumor invasion and metastasis and the underlying mechanisms.We first found that CD146 was a novel Epithelial-Mesenchymal Transition (EMT) inducer in breast cancer. Overexpression of CD146 in epithelial breast cancer cells induced cell morphological changes from a cobblestone-like phenotype to a fibroblast-likemorphology,down-regulatedepithelialmarkersE-cadherinand cytokeratin,up-regulatedmesenchymalmarkersvimentinandfibronectin, significantly promoted cell migration and invasion, and induced breast cancer stem cell-like properties. Meanwhile, CD146 silencing in mesenchymal breast cancer cells inhibited their mesenchymal phenotypes and invasive behaviors.Wefurther found that CD146 overexpression contributed to RhoA activation, which up-regulated EMT key transcription factor Slug; Slug subsequently inhibited E-cadherin transcription and eventually leaded to EMTs in breast cancer cells. Moreimportantly, anorthotopicbreasttumor modeldemonstratedthat CD146-induced EMTs promoted tumorgenesis, decreased tumor differentiation, and promoted breast cancer invasion and metastasisin vivo.Wefurther conducted an immunohistochemical analysis of 505 human primary breast tumor tissues and found that CD146 was significantly associated with high tumor stage, Ki-67 expression and CD146 分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究 4 poor prognosis. Interestingly, CD146 was expressed at abnormally high levels (68.9%), and was strongly associated with E-cadherin downregulation in the most lethal and malignant triple-negative breast cancer, providing clinical evidences for our in vitrostudies and animal studies. Our studies imply that CD146 may be used as a novel therapeutic target for breast cancer, especially for triple-negative breast cancer. In addition, we observed that CD146-induced EMTs promoted breast cancer cells alone or together with endothelial cells to form tube-like structures on Matrigel, suggesting that CD146-induced EMTs might further converted transformed breast cancer cells into endothelial-like cells, to form vasculogenic mimicry and mosaic vessels in tumor microenvironments. Besides, we combined SILAC analysis and Microarray assay to identify CD146-induced changes in both protein and mRNA levels, in order to explore the complex signal networks and novel molecular mechanisms in CD146-induced EMTs in breast cancers. Another part of this dissertation was generation of endothelial-specific CD146 knock-out mice (CD146EC-KO) to explore the role of CD146 in angiogenesisin vivo. CD146EC-KOmice did not show overt morphological defects in the vasculature.To further evaluate the role of CD146 in pathological angiogenesis, CD146EC-KOmice and wild type mice (WT) were subcutaneously injected with melanoma cells B16F10 and fibrosarcoma cells MCA-205. By 16 or 24 days after injection, tumor volumes of B16F10 and MCA-205 in CD146EC-KOmice were 39.1% or 54.2% smaller than that of WT mice. Vascular density of these tumors, as determined by CD31 staining, was also decreasedinCD146EC-KOmice.Aorticringassayalsoshowedless neovascularization in CD146EC-KOmice than WT mice. Thesein vivostudies suggest that CD146 has a redundant functional role in physiological angiogenesis but serves an essential role in pathological angiogenic processes such as tumor growth. KeyWordsCD146,tumorinvasionandmetastasis,breastcancer, Epithelial-Mesenchymal Transitions (EMTs), E-cadherin, RhoA, Slug, triple-negative breast cancer (TNBC), therapeutic target, gene knock-out mouse, tumor angiogenesis 目 录 5 目目目目 录录录录 摘摘 要要1 1 1 1 AbstractAbstractAbstractAbstract3 3 3 3 目目 录录5 5 5 5 文献综述文献综述6 6 6 6 第一部分第一部分 CD146CD146CD146CD146 与肿瘤转移侵袭机制与肿瘤转移侵袭机制6 6 6 6 1 肿瘤侵袭转移机制6 2 EMT 与肿瘤侵袭转移. 10 3 CD146 与肿瘤侵袭转移17 第二部分第二部分 CD146CD146CD146CD146 与血管生成机制与血管生成机制21212121 1 血管生成机制21 2 CD146 与血管生成27 研究内容研究内容29292929 第一部分第一部分 CD146CD146CD146CD146 在乳腺癌侵袭转移的作用在乳腺癌侵袭转移的作用29292929 概述29 1 材料与方法30 2 实验结果35 3 小结与讨论46 4 后续研究49 第二部分第二部分 CD146CD146CD146CD146 在肿瘤血管生成中的作用在肿瘤血管生成中的作用52525252 概述52 1 材料与方法53 2 实验结果56 3 小结与讨论61 参考文献参考文献63636363 发表文章发表文章74747474 致致 谢谢75757575 CD146 分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究 6 文献综述文献综述文献综述文献综述 第一部分第一部分第一部分第一部分 CD146CD146CD146CD146 与肿瘤转移侵袭机制与肿瘤转移侵袭机制与肿瘤转移侵袭机制与肿瘤转移侵袭机制 1 1 1 1 肿瘤侵袭转移机制肿瘤侵袭转移机制肿瘤侵袭转移机制肿瘤侵袭转移机制 侵袭转移是恶性肿瘤最恶性的特征， 并导致了大于 90的肿瘤相关性死亡(1, 2)。经典的肿瘤侵袭转移过程分为以下五个基本步骤：肿瘤细胞发生原位侵袭进 入正常组织，穿透血管或淋巴管进入循环系统，在循环系统中生存，到达远端脏 器的实质组织，进而形成新的转移瘤(3)。 一直以来，对于肿瘤侵袭转移的过程，存在两种基本学说，即线性进化模型 （ The linear progression model ） 和 平 行 进 化 模 型 (The parallel progression model)(4)。线性进化模型认为肿瘤侵袭转移是肿瘤进展过程中的一个后期事件， 原位的肿瘤细胞首先经过数轮的突变及筛选(5)，导致异质性的肿瘤细胞群体产 生，其中的一部分恶性肿瘤细胞获得发生侵袭转移所必需的突变（图 1）(6)。 肿 瘤细胞发生转移的能力可能是原位肿瘤由于选择的压力产生的， 也可能由循环肿 瘤细胞（CTCs）到达转移脏器后继续进化获得的。在临床上，肿瘤大小与肿瘤 转移的概率呈正相关(8)，手术切除直径小于 2mm 的肿瘤可以降低转移的风险， 均支持该线性进化模型。 相反， 平行进化模型认为在肿瘤发生进展的任何阶段，肿瘤细胞都可以从原 图图 1 1 1 1 线性进化学说线性进化学说（图引自参考文献 4，并得到许可） 。以乳腺癌为例说明肿瘤晚期发生侵袭转移的模 型。原位肿瘤在长达 12 年中形成直径约 1 cm 大小的瘤体，同时侵袭性肿瘤细胞被筛选出来。在接下 来的 31 个月中，侵袭性肿瘤细胞开始转移形成初级转移瘤，在这过程中原位瘤及次生瘤细胞侵袭能力 进一步增强，并在不到 60 天的时间内迅速生成次级转移瘤及发生全身转移，最终导致患者死亡。 文献综述 7 位肿瘤分离， 在不同时间在不同脏器形成多个微小转移灶，并进一步积累基因突 变，而这些过程是独立于原位肿瘤的进化过程（图 2） 。有研究比较了原位肿瘤 及转移瘤的生长速度， 发现如果在肿瘤进展的后期肿瘤细胞才开始发生侵袭转移 的话， 转移瘤的体积不可能长到如此大，因此认为侵袭转移是肿瘤进展过程中的 一个早期事件(9)。此外，在转基因小鼠乳腺癌模型中观察到循环肿瘤细胞在早 期便从原位肿瘤脱离进入血管(10)，为该平行进化模型提供了依据。这两种相互 竞争、却不是完全对立的学说为探索肿瘤转移的进化过程提供了思路及参考， 并 对肿瘤侵袭转移的预防及治疗具有重要的提示意义(4)。 尽管大量的肿瘤细胞都可以从原位肿瘤脱离，并通过循环系统到达全身， 它 们倾向于选择特定的器官形成次生瘤，形成的时间及效率也各不相同，主要取决 于肿瘤的种类及分型(11)。例如，前列腺倾向于发生骨转移(12, 13)，而黑色素瘤 则容易发生脑转移(13)； 肺癌及乳腺癌一般均倾向于转移到骨、 肺、 肝及大脑(14, 15)。Steven Paget 的假说“土壤与种子”理论很好地解释上述现象，循环肿瘤细 胞是随机散发的“种子” ，只有在合适的微环境中，也就是“土壤”中，才能继 续支持它们后续的生长(16)。尽管这一假说形象地揭示了肿瘤侵袭转移的两大要 素，肿瘤细胞和微环境，但是这一复杂过程所涉及的分子及细胞机理，仍然不是 很清楚。 目前， 对于肿瘤侵袭转移的研究已经上升到系统生物学层面，更先进的成像 技术及实验模型为研究肿瘤侵袭转移的动态过程提供了前所未有的条件。因此， 图图 2 2 2 2 平行进化学说平行进化学说（图引自参考 文献 4，并得到许可） 。以乳腺癌 为例说明肿瘤早期发生侵袭转移 的模型。原位肿瘤的直径仅为 1-4 mm 时， 侵袭性肿瘤细胞便从原位 肿瘤中脱离出来，成为循环肿瘤 细胞。在接下来长达 6 到 12 年的 时间里，循环肿瘤细胞迁移到各 个重要脏器，归巢并形成次生瘤。 在大脑中，微环境因子的影响可 能会延缓次生瘤的生长速度。可 能在乳腺癌没有确诊时就已经存 在循环肿瘤细胞，但不是所有的 循环肿瘤细胞都可以形成次生瘤 而直接导致患者死亡。 CD146 分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究 8 我们对该过程的研究开始涉及以下五个基本问题： 原位瘤与转移瘤之间的遗传关 系(4, 17-19)，促使原位肿瘤细胞获得与宿主基质相互作用的遗传突变(20, 21)， 肿瘤微环境中不同基质细胞的独特贡献(22-24)， 不同种类及分型的肿瘤对转移器 官的倾向性(25-28)，以及在侵袭转移过程中信号通路及细胞的动态变化网络 (29-31)。探索这些基本问题，将有助于揭开肿瘤侵袭转移的“黑盒子” ，为开发 靶向转移性肿瘤细胞并拮抗肿瘤细胞与肿瘤微环境相互作用的药物提供有力线 索。接下来，我们将以肿瘤转移的三大基本过程为线索，着重讨论肿瘤细胞在其 中的变化及涉及的调控机制。 1.11.11.11.1 肿瘤细胞在原位肿瘤中的转变肿瘤细胞在原位肿瘤中的转变 研究肿瘤转移过程最基本的一个问题便是鉴定具有转移潜能的肿瘤细胞与 众不同的特征， 这些特征将成为诊断及治疗肿瘤侵袭转移的潜在靶标。原位肿瘤 细胞通过表达某些基因来获得这些独特的特征。 这些基因能够促使肿瘤细胞侵袭 到周围正常组织，并招募肿瘤微环境中的基质细胞，以便于其扩散，因此被定义 为转移起始基因（metastasis initiation gene）(21)。它们一般具有促进细胞迁移， 促进上皮-间质转化（EMT） ，促进细胞外基质降解，招募骨髓来源的干细胞， 促 进血管生成，以及逃避免疫监控等功能。例如，EMT 是肿瘤起始转移最重要的 一个机制， 赋予了上皮来源的肿瘤细胞极强的侵袭转移能力，并受到一系列转录 因子的调控，包括 Twist1，Snail1 以及 Snail2 等(32)。其他促进肿瘤细胞侵袭的 分子包括参与肝细胞生长因子（HGF）及其受体（HGFR）信号通路的成员，例 如乳腺癌中的 metadhetin (33)， 以及结肠癌中的结肠癌转移相关蛋白 1 （MACC1） 等(34)。肿瘤起始转移的过程还受到非编码 RNA 的调控，例如乳腺癌及结肠癌 中的 miR-126 和 miR-335(35, 36)。 这些转移起始基因的表达在相应的肿瘤中均与 患者预后差相关。 肿瘤微环境的基质细胞在肿瘤起始转移的过程中也发挥重要作用。首先， 血 管生成被认为是基质细胞促进肿瘤转移的最有力证据之一。 肿瘤内新生血管的高 通透性将使肿瘤细胞更容易进入血管，并开始远端转移的旅程。鉴于肿瘤血管生 成的关键分子已经被发现， 以其为靶标的靶向疗法最先被用于治疗晚期的转移性 肿瘤(37, 38)。尽管抗 VEGF 的疗法在临床上已经被批准用于转移性肿瘤，但是 最近的小鼠实验表明这种靶向疗法将增加肿瘤转移的风险(39, 40)，暗示着我们 文献综述 9 可能低估了靶向肿瘤基质的潜在副作用。 而这些临床前的研究也与最近的临床实 验结果一致， 即 VEGF 抑制剂 bevacuzimab 在多种肿瘤中并不能有效地改善患者 的预后(41, 42)，将该药的医疗价值推向风口浪尖。此外，基质中的肿瘤相关性 巨噬细胞(CAMs)可能通过集落生长因子（CSFs）及上皮样生长因子（EGF）等 信号通路促进肿瘤细胞转移(43, 44)；白细胞及其他的免疫细胞也被发现在原位 肿瘤的生长及迁移中发挥关键调控作用(45, 46)；而乳腺组织中的间质细胞最近 被发现通过 CCL5 信号通路影响乳腺癌细胞的转移行为(22)。 1.21.21.21.2 肿瘤细胞在循环系统中的运输肿瘤细胞在循环系统中的运输 肿瘤细胞从原位肿瘤上脱离进入循环系统后，成为循环肿瘤细胞。这些细胞 在循环系统中存活并进入脏器实质，而促进这一过程的基因称为转移进展基因 （metastasis progression gene）(11)。这些基因可能也在原位肿瘤中表达，但在原 位瘤及转移过程中可能具有不同的功能。例如，低氧诱导的基因 Lysyl oxidase 在乳腺癌中被认为促进肿瘤细胞侵袭，并与肿瘤复发相关(47)；但最近有研究表 明 Lysyl oxidase 被分泌进入肝、肺等脏器后，可以通过影响细胞外基质来招募 CD11b+骨髓细胞， 进而促进循环肿瘤细胞在脏器中的归巢(48)。 由于不同脏器中 的血管壁及实质的结构各有差异， 不同肿瘤发生转移时就具有脏器特异性。 因此， 转移促进基因可以作为预测肿瘤特异性脏器转移的标记分子(11)。 此外，循环肿瘤细胞在血管中存活对肿瘤成功发生转移的过程至关重要。 有 一系列研究表明循环肿瘤细胞通过与血小板相互作用而在血管中存活。 有关血小 板参与肿瘤转移的最直接的证据便是在小鼠体内通过药物抑制或遗传方法去除 血小板将显著抑制肿瘤转移； 而一旦将血小板注入小鼠体内，肿瘤转移的潜力将 得到恢复(49-51)。 后续研究表明循环肿瘤细胞与血小板形成异质细胞团后，血小 板将保护循环肿瘤细胞免受免疫细胞的清除(52)。血小板同时促进循环肿瘤细胞 黏附在血管壁上(53)，并在黏附点释放 VEGF 等保护性因子，促使血管通透性增 强以利于肿瘤细胞穿透血管壁(54)。一旦循环肿瘤细胞离开血管进入脏器实质 中， 激活的血小板将释放大量促血管生成因子，以利于转移位点血管新生及肿瘤 细胞的生长(55)。此外，循环肿瘤细胞还可以模拟嗜中性粒细胞的行为，通过选 择素 （selectin）介导的细胞滚动作用而黏附在血管内壁(56)。 而在脏器微血管中， P-， L-以及 E-选择素通过调控选择素表达阳性的宿主细胞与配体表达阳性的肿瘤 CD146 分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究 10 细胞之间的相互作用，来促进肿瘤细胞发生黏附和转移(57)。 1.31.31.31.3 肿瘤细胞在远端脏器中的生长肿瘤细胞在远端脏器中的生长 循环肿瘤细胞定位到远端脏器后，有一类基因能够促进微小转移灶 (micrometastases)的生长，形成可检测到的大转移瘤(macrometastases)，被称为转 移致病基因（metastasis virulence gene）(11)。例如，破骨细胞动员因子甲状旁腺 激素相关蛋白（PTHRP） ，在原位肿瘤细胞中不提供任何生存优势，但是能明显 地促进循环肿瘤细胞形成骨转移灶(58)。转移致病基因可能是原位肿瘤基因随机 突变造成的， 由于后期为循环肿瘤细胞适应脏器微环境提供生存优势，因而被筛 选出来并稳定表达。 这些基因在原位肿瘤中可能不对肿瘤细胞早期的侵袭转移行 为产生影响，只影响后期次生瘤的生长过程(11)。 炎症因子调控了归巢的肿瘤细胞与远端脏器之间的相互作用， 因而也在该过 程中发挥关键作用。 最近有研究表明，肿瘤细胞诱导骨髓及大脑中的基质细胞分 泌白介素-6（IL-6） ，从而促进微小转移灶的生长(59, 60)。有意思的是，炎症因 子相关的信号通路可以改变肿瘤细胞表观遗传学的调控， 或者是赋予肿瘤细胞快 速生长的能力。例如，涉及 IL-6 及 NF-B 信号通路的炎症调控网络将维持原癌 基因 SRC 导致的一个表观遗传学转变， 从而促进肿瘤进展(61)。 而另一项独立的 研究表明 SRC 信号通路更容易在晚期乳腺癌细胞中活化，并在炎症因子刺激下 传导促存活的信号，以利于骨转移的形成(62)。因此，我们认为炎症引起的遗传 及表观遗传学的改变将对归巢肿瘤细胞的生存至关重要， 因而可以作为肿瘤转移 研究及靶向药物设计的一个新方向。 2 2 2 2 EMTEMTEMTEMT 与肿瘤侵袭转移与肿瘤侵袭转移与肿瘤侵袭转移与肿瘤侵袭转移 细胞形态由上皮性质向间质性质的转变，被定义为上皮 -间质转化 （Epithelial-Mesenchymal Transition， EMT） ，这种机制最初被发现在胚胎发育 过程中发挥关键作用， 最近因为其在肿瘤转移以及器官纤维化等疾病进展中的重 要作用引起广泛的关注(32, 63-65)。 上皮-间质转化的过程是一个非常复杂的过程，主要表现为上皮细胞丧失其 分化的特征，包括细胞与细胞之间的紧密连接，顶端及基底的极性，细胞几乎没 有迁移能力等；反而获得某些间质细胞的特征，例如细胞形态变为长梭形，细胞 文献综述 11 侵袭及迁移能力以及对耐受更高的细胞凋亡诱导压力等。上皮 -间质转化的现象 最初是在培养的细胞中被发现的， 刚开始其与体内生理过程的相关性一直受到广 泛的争议(32, 63-65)。然而，大量的临床肿瘤组织及动物实验均有力地证明了上 皮-间质转化（EMT） ，以及其相反过程间质-上皮转化（MET） ，与正常发育过程 以及肿瘤进展的密切联系(66)。如图 3 所示，上皮-间质转化机制对肿瘤最重要的 功能为赋予上皮来源肿瘤细胞极强的细胞侵袭及迁移能力；而间质 -上皮转化机 制则在转移肿瘤细胞到达脏器后形成新次生瘤的过程中发挥重要作用(67)。 在这篇综述中，我们将重点总结肿瘤微环境中诱导上皮-间质转化发生的信 号通路等调控机制， 以及由此导致的转化对肿瘤异质性、肿瘤侵袭转移以及耐药 性的影响，并借此来探讨肿瘤靶向治疗的新策略。 2.12.12.12.1EMTEMTEMTEMT 激活的调控机制激活的调控机制 上皮细胞标记分子 E-cadherin 的缺失被认为是乳头状瘤向侵袭性乳腺癌转 化的一个关键步骤(68)，也被认为是 EMT 发生过程中最基本的一个事件。目前 已经有大量的研究关注 E-cadherin 在肿瘤发生进展过程中是如何被调控表达的， 并发现一系列 EMT 关键转录因子，包括 Snail，Slug，E47，SIP1 等直接结合 E-cadherin 的启动子区抑制其转录，或者 Twist，Zeb1，FoxC1 以及 FoxC2 等间 接抑制 E-cadherin 的转录(69, 70)。 肿瘤细胞微环境中一系列的细胞外刺激信号均 图图 3 3 3 3 上皮上皮- - - -间质状态的转变在肿瘤进展中的作用间质状态的转变在肿瘤进展中的作用（图引自参考文献 67，并得到许可） 。在上皮来源的原 位肿瘤中，上皮-间质转化机制（EMT）能促使肿瘤细胞获得极强的侵袭转移能力及类似于乳腺癌干细 胞的特征，从原位瘤中脱离出来，进入循环系统，开始远端转移旅程。除此之外，EMT 还可以促进肿 瘤细胞与肿瘤微环境中的基质细胞（肿瘤相关性成纤维细胞、白细胞等）相互作用，以肿瘤细胞存活 及侵袭。一旦循环肿瘤细胞到达远端脏器，间质-上皮转化机制（MET）则促进次生瘤的生长及形成。 CD146 分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究 12 可诱导 EMT 过程的发生，而且不同的信号通路可能共同交汇于这些 EMT 关键 转录因子发挥功能， 形成一个复杂的正反馈调控网络。而这种网络式的调控机制 将不断地加强转化后细胞的间质细胞表型，直至整个 EMT 过程的完成(71)。如 图 4 所示，这些调控机制主要包括信号通路、低氧诱导，以及 microRNAs 等。 2.1.12.1.12.1.12.1.1信号通路信号通路 肿瘤微环境中最主要且研究最为透彻的 EMT 诱导因子是转化生长因子-家 族（TGF-）的细胞因子，其主要在促进肿瘤进展以及诱导肿瘤干细胞产生的过 程中发挥关键作用(66, 72)。TGF-可以通过多种不同的效应机制来诱导 EMT 过 程的发生，包括直接磷酸化下游 SMAD 转录因子，或者胞浆内一些调控细胞极 性及细胞之间紧密连接的蛋白。例如，在乳腺上皮细胞中，TGF- 型受体定 图图 3 3 3 3 上皮上皮- - - -间质转变机制调控网络间质转变机制调控网络 （图引自参考文献 67， 并得到许可） 。 参与诱导上皮-间质转化 （EMT） 发生的主要信号通路及下游的效应分子如上所示。转化生长因子（TGP-） 、酪氨酸受体激酶（RTKs）、 Notch、Wnt、低氧诱导等因素均可通过各种不同的信号通路诱导 EMT 发生，在不同的细胞背景下各个 信号通路均有不同的重要性。EMT 的下游涉及到细胞骨架及细胞外基质的变化，两者共同作用来改变 细胞的形态。EMT 诱导的信号通路将导致破坏上皮细胞之间的 E-cadherin 等蛋白介导的紧密连接及桥 粒连接；EMT 也通过上调细胞外基质蛋白（Fibronectin 和 Collegen） 、蛋白酶（MMPs）等方式来重塑 细胞外骨架；miRNA 也可以通过调控 EMT 关键转录因子的方式来参与诱导 EMT 发生的过程。 文献综述 13 位在细胞紧密连接处， 并与调控上皮细胞极性及紧密连接的蛋白 Par6 及Occludin 相互作用；一旦 TGF-结合 TGF- 型受体并进一步磷酸化 Par6，将导致细胞 极性及细胞之间紧密连接的消失(73)。 同时，TGF-还可以影响其他诱导 EMT 发 生的信号通路，例如 Notch，Wnt 及整合素相关的信号通路，共同作用来起始整 个 EMT 过程。在狗肾上皮细胞 MDCK 中，TGF-/Smad 信号即通过与 Ras 激活 共同促进一个完整 EMT 过程的完成。 Wnt 信号通路诱导 EMT 发生主要是通过抑制糖元合成激酶-3（Glycogen synthase kinase-3，GSK-3）的磷酸化及降解胞浆内-catenin 的活性来实现的。 这将导致胞浆内-catenin 量的增多， 并进一步入核作为转录因子来激活一系列基 因的表达，尤其是诱导 EMT 发生的关键转录因子(74)。但是，仅仅依靠-catenin 可能不足以诱导 EMT 过程的发生。例如，在绝大部分APC基因失活或-catenin 过量激活的结直肠癌中均可见-catenin 在胞浆内大量聚集， 但这些肿瘤并不表现 出间质细胞表型(75)，暗示着 Wnt 信号通路对某些细胞发生 EMT 是必须的，但 是又不足以来诱导 EMT 关键因子的表达来独立完成整个过程。 由于具有诸多的受体、配体以及下游的效益分子，Notch 信号通路是非常复 杂的。因此，Notch 信号通路具有细胞特异性，对肿瘤的功能可以是促进的，也 可能是抑制的(76)。Notch 信号通路可以通过激活 NF-B 信号通路(77)，或者调 控 TGF-信号通路共同来诱导 EMT 过程的发生。似乎与干细胞相关的信号通路 都参与诱导 EMT 发生的过程，因此 Notch 信号通路对 EMT 的功能可能主要为 诱导及维持类似于肿瘤干细胞的某些性质。 此外，很多酪氨酸激酶受体（RTKs）被发现在 EMT 发生过程中发挥关键作 用，包括 Met，FGF，IGF，EGF，VEGF、PDGF 等家族的成员(32)。例如，胎 盘来源的生长因子（PDGF）在结肠癌细胞中通过不依赖于 Wnt 信号通路的方式 促进-catenin 入核，从而诱导 EMT 的发生(78)。而 FGF 则被发现通过促进 E-cadherin 发生内吞(79)，或者 Snail 及 Twist 的表达(80)，来诱导 EMT 过程的发 生。VEGF 信号通路在前列腺癌及乳腺癌细胞中通过诱导 Snail 及 Twist 的表达 来诱导 EMT 发生(81)；而 Snail1 又在腹膜纤维化的过程中诱导上皮细胞表达 VEGF(82)。因此，血管生成与 EMT 之间的正反馈可能共同促进了肿瘤的发生及 进展过程。 CD146 分子促进乳腺癌侵袭转移的机制研究 14 2.1.22.1.22.1.22.1.2低氧诱导低氧诱导 低氧可以通过多种不同的机制在肿瘤中诱导 EMT 发生，包括上调低氧诱导 因子-1（HIF-1）的表达，上调肝细胞生长因子（HGF） 、Snail1 及 Twist1，激 活 NF-B 信号通路，以及诱导 DNA 的甲基化等(83)。在多种人肿瘤细胞中，低 氧条件（氧气浓度为 3）通过抑制 GSK-3的活性来避免-catenin 被磷酸化而 降解，从而诱导 EMT 发生。与此相对应，低氧处理后的细胞获得极强的侵袭能 力，细胞内 Wnt-catenin 信号活化，从而导致 Snial1 的表达；而 Snial1 的表达 进一步在转录水平抑制 E-cadherin，导致固定在细胞膜附近的-catenin 被释放到 胞浆，进而进入细胞核激活并稳定更多的 EMT 关键转录因子(84)。这些结果说 明低氧条件可能通过这种正反馈机制进一步稳固细胞的间质特征。 2.1.32.1.32.1.32.1.3MicroRNAMicroRNAMicroRNAMicroRNA 对对 EMTEMTEMTEMT 的调控的调控 最近有研究表明 microRNA 通过调控 EMT 关键诱导分子来参与 EMT 发生 的过程，包括 miR-200 家族（miR-200a，miR-200b，miR-200c，miR-141 以及 miR-429） 及 miR-205 家族等， 在该调控过程中均涉及抑制 E-cadherin 的表达(85)。 有关 miR-200 家族及 miR-205 家族参与调控 EMT 主要有两项独立的研究并 采取不同的策略完成的(86)。其中的一项研究选择多种不同肿瘤细胞进行检测， 如果某种 microRNA 的表达与 E-cadherin mRNA 的表达具有正相关关系， 则认为 其代表了上皮细胞特征；反之，某种 microRNA 的表达与 Vimentin mRNA 的表 达具有正相关关系，则认为其代表了间质细胞特征。通过这样的普筛，研究者发 现 miR-200 家族及 miR-205 家族的表达与 Vimentin mRNA 的表达呈负相关。进 一步研究表明 miR-200 家族及 miR-205 家族的靶标为 EMT 关键转录因子 Zeb1 和 Zeb2。随后在卵巢乳头状瘤组织中的研究表明这些 microRNA 的表达与 E-cadherin 呈正相关，而与 Vimentin 呈负相关，也为上述研究提供临床依据。 而 第二项研究则在狗肾上皮细胞 MDCK 细胞中，不管是采用 TGF-刺激还是酪氨 酸磷酸酶 PEZ 处理，miR-200 家族及 miR-205 家族的表达均下调；而且下调这 些 miRNA 也足以诱导一个完整 EMT 过程发生，反之过表达这些 microRNA 则 导致 MET 发生(87)。 通过其对 EMT 或 MET 过程的调控， microRNA 已经确立在肿瘤侵袭及转移 过程中的重要地位。例如，在分析转移及非转移性乳腺癌细胞系中 microRNA 表 文献综述 15 达差异谱时，miR-10b 是一个与间质细胞特征及侵袭特征相关的 microRNA。之 后的发现表明 Twist1 可以上调 miR-10b 的表达，而 miR-10b 的表达可以进一步 抑制HOXD1的转录及上调 RhoC 蛋白表达。更重要的是，miR-10b 在侵袭性原 位乳腺癌组织中比在转移瘤中的表达更高(88)。而 miR-335 则发挥抑制乳腺癌侵 袭转移的功能，miR-335 通过调节转录因子 SOX4 及细胞外蛋白酶 tenascin C 的 表达来调控肿瘤转移的过程(36)。如今越来越多的方法已经被用来寻找更多的参