铁蛋白纳米粒：新功能的发现及在肿瘤诊断和治疗中的应用研究

密级密级: 博士学位论文博士学位论文 铁蛋白铁蛋白纳米粒纳米粒：新功能：新功能的发现的发现及及在在肿瘤肿瘤诊断诊断和治疗中和治疗中的的 应用应用研究研究 作者姓名作者姓名： 范克龙范克龙 指导教师指导教师： 阎锡蕴阎锡蕴 研究员研究员 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位类别学位类别： 理学博士理学博士 学科专业学科专业： 细胞生物学细胞生物学 研究所研究所： 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 二零一四二零一四 年年 五五 月月 Ferritin nanoparticles: novel property and applications for tumor detection and therapy By Kelong Fan A Dissertation Submitted to University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of Cell Biology Insititute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences May, 2014 书脊书脊 铁铁 蛋蛋 白白 纳纳 米米 粒粒 ： 新新 功功 能能 的的 发发 现现 及及 在在 肿肿 瘤瘤 诊诊 断断 和和 治治 疗疗 中中 的的 应应 用用 研研 究究 范范 克克 龙龙 中中 国国 科科 学学 院院 大大 学学 3cm 左右 3cm 左右 致 谢 I 致致 谢谢 五年的时间很短，转眼间自己的研究生生涯就将画上句号；五年的时间也很 长，这期间经历的酸甜苦辣，仍旧历历在目。在这五年里，我成长了很多，收获 了很多，我所取得的每一个成绩和每一个进步，以及将来我所能达到的高度，都 离不开大家的关心和帮助。在本论文即将完成之际，我谨向关心、帮助、支持和 鼓励我的老师、同学和朋友们表示衷心的感谢。 在这里，我最想感谢的是我的导师阎锡蕴老师。本论文是在阎锡蕴老师的悉 心指导下完成的。五年来，阎老师充沛的科研热情、严谨的治学态度和勤奋的工 作精神使我敬佩，催我上进。讨论课题时，阎老师的对研究方向的准确把握；组 会上，阎老师对我的言传身教；文章写作上，阎老师对我的悉心指导等等，我所 取得的每一个进步无不渗透着她的心血和智慧。 从她的身上我学会了以积极乐观 的态度享受科研的探索过程。同时，也要感谢阎老师在日常生活中对我的关心与 帮助，她“自强、自信、自在”的三自经，教会我很多做人的道理，让我受益匪 浅。 感谢庄洁师姐，在我刚进入实验室时，对我认真的指导和帮助，带我了解并 进入了丰富多彩的纳米生物学领域， 庄师姐的勤奋、 踏实和努力是我学习的榜样。 感谢梁敏敏老师对我实验和论文上的指导和帮助。 梁老师带给了我化学生物 学和小动物成像方面的知识， 她单刀直入式分析问题的风格和透过现象看本质的 能力，对我的帮助非常大。 衷心感谢实验室的冯静、 杨东玲、 宋丽娜、 段德民、 张德玺、 郑继燕等老师， 你们的努力工作为我们提供了良好的科研平台和健康向上的工作氛围， 感谢你们 对我实验上的帮助和支持。冯老师的认真和严格，杨总的耐心和执着，张老师的 乐观和幽默，段老师的风趣和豁达、宋姐的积极和热情，郑老师的努力和负责， 从你们身上我学会很多。 感谢王玉春师傅的辛勤工作， 为我们潜心实验提供保障。 感谢和我一起朝夕相处的各位师兄师姐，师弟和师妹们，感谢罗永挺师兄、郑超 固师兄和曾启群师姐对我本科毕业设计时的耐心指导，感谢段红霞师姐、姜天霞 师姐、王平师姐和王飞师兄在实验中遇到问题时帮我出谋划策；感谢凃滔师兄， 在这五年中的互相支持与帮助；感谢刘丹、高倩、吴真真、晏荟文、陈佳楠、周 萌众师妹们以及张建林、马艳斌、江冰三位师弟，感谢你们对我实验工作的无私 帮助；感谢张豪峰和张令令医生，你们的加入为实验室添加了新的活力；感谢大 家对我的包容，鼓励和关爱，和大家在一起奋斗的快乐时光我会永远铭记。 感谢秦志海老师、张立国老师和松田善卫老师对我的课题研究提供的无私帮 致 谢 II 助； 感谢中国科学院地质与地球物理研究所的潘永信老师和曹长乾师兄在实验上 给予的支持与帮助；感谢研究生处刘勤瑞、熊勤和许琰艳等老师的关心和指导。 感谢我的父母对我的无私的爱和一直以来的支持和鼓励，他们用一言一行告 诉我踏实做人，勤奋做事。他们的爱是我不断进步的源泉，唯有辛勤的学习与工 作能够回报他们对我的培养。感谢我的姐姐弟弟和朋友们，在我成功时和我一起 分享喜悦，在我失败时给予我温暖，正是他们的关心和帮助，让我乐观从容地面 对学习和生活中的一切。最后还要感谢我的爱人，你的出现，让我的生活更加丰 富多彩，感谢你一直以来的陪伴、包容、支持和鼓励。 范克龙 2014 年 5 月 摘 要 III 摘摘 要要 本论文的研究内容涉及纳米材料学、分子生物学、药剂学以及肿瘤诊疗学等 多个学科。我们根据人体天然铁蛋白（ferritin）独特的分子结构（由 24 个 H 或 L 亚基自组装形成的蛋白质外壳和水铁矿（5Fe2O39H2O）内核两部分组成） ，利 用仿生学原理合成了一种新型铁蛋白纳米粒， 称为磁性铁蛋白 （magnetoferritin） 。 尽管它具有类似天然铁蛋白的壳核结构，然而不同的是，其蛋白外壳仅由 H 亚 基构成，内核是磁铁矿（Fe3O4）而非水铁矿。这些改变赋予了磁性铁蛋白一些新 的特性。 我们发现磁性铁蛋白纳米粒是一种双功能分子， 具有识别肿瘤并使其可视化 的新特性。首先，我们在分子、细胞和组织三个水平上证实，H 铁蛋白可以通过 与肿瘤细胞上高表达的受体转铁蛋白受体 1（transferrin receptor 1, TfR1）结 合， 而直接靶向肿瘤。由于磁性铁蛋白的外壳为 H 铁蛋白，这个重要发现赋予该 纳米粒靶向肿瘤的新特性。因此，与其他在肿瘤诊疗学中应用的纳米颗粒相比， 磁性铁蛋白纳米粒无需任何修饰和标记，即可特异性靶向肿瘤组织。另一个重要 发现是，磁性铁蛋白纳米粒的磁铁矿内核具有过氧化物酶的活性，能够催化底物 发生显色反应，使肿瘤细胞可视化。所以，磁性铁蛋白纳米粒是一种新型的双功 能肿瘤诊断试剂。 基于这种新型试剂， 我们建立了一种肿瘤纳米诊断新方法。 通过对人体肝癌、 肺癌、结直肠癌等 10 种肿瘤的 541 例临床组织标本的筛查，我们发现这种新方 法的灵敏度为 95.77%， 特异性为 95.72%， 而且， 该方法与肿瘤诊断的“金标准” 免疫组化法的分析结果是一致的。该方法的核心是用一种双功能纳米粒子，取 代常规免疫组化所用的一抗、二抗、三抗及酶等多种试剂；用一步法取代多个操 作步骤。因此，这种新方法具有操作简便、稳定、经济及检测灵敏度高和特异性 强的特点，为癌症的诊断和治疗提供了新思路、新试剂和新技术（Fan KL et al, Nature Nanotechnology, 2012） 。 在上述发现的基础上，我们又将其用于肿瘤的治疗。利用铁蛋白亚基自组装 的特性以及化疗药物阿霉素的静电特征，我们将铁内核替换为高剂量的阿霉素， 从而将 H 铁蛋白发展为一种肿瘤靶向性纳米药物载体。在体内抗肿瘤实验中， 装载阿霉素的 H 铁蛋白（HFn-Dox）能够很好的富集在肿瘤部位，使得瘤内阿霉 素药物的浓度比游离阿霉素对照组高 10 倍以上，并且单次给药即可显著抑制三 种不同肿瘤的生长；同时，HFn-Dox 减少了健康器官的药物暴露量，与游离阿霉 素相比，HFn-Dox 使得小鼠对阿霉素的耐受剂量提高了 4 倍；与临床药物 Doxil 相比， 在给药剂量相同的前提下， HFn-Dox 治疗的三种荷瘤小鼠的平均存活时间 摘 要 IV 均大于 40 天， 体重变化小于 10%， 而 Doxil 治疗组的最长平均存活时间为 23 天， 体重变化大于 15%。 与传统的纳米药物载体不同， H 铁蛋白作为一种天然蛋白质 载体具有生物相容性好，对肿瘤组织主动靶向和被动靶向兼具，低免疫原性及易 于大批量生产和纯化的特点。这些独特的优点使 H 铁蛋白有望成为安全而有效 的抗癌药物体内靶向输送系统，解决目前药物载体所面临的生物相容性差、毒副 作用大和缺乏主动靶向性的问题。 关键词关键词：重组人铁蛋白，转铁蛋白受体 1，磁性铁蛋白，癌症诊断，药物输送， 肿瘤治疗 ABSTRACT V ABSTRACT The research field of this dissertation is focus on the leading edge interdiscipline of nanomaterial, molecular biology, pharmaceutics and cancer theranostics. Based on the unique structure of human ferritin, which is composed of a 24 H/L subunits self- assembly protein shell and an internal iron oxide core of ferrihydrite (5Fe2O39H2O), we biomimetically synthesized a new kind of ferritin nanoparticle, named magnetoferritin. Although the structure of this engineered ferritin is similar to native ferritin, with an outer protein shell and inner iron core, the components are different. The protein shell of this new nanopartilce is consisted of H subunits and the iron oxide core is in the form of magnetite (Fe3O4). These changes endow magnetoferritin with some novel properties. We found the bifunctional properties of magnetoferritin which were targeting and visualizing tumor tissues. Firstly, we proved H-ferritin could specifically target to tumor cells via binding its receptor TfR1 (Transferrin receprtor 1). Because the protein shell of magnetoferritin is H-ferritin, this nanoparticle can also bind to tumor cells. Compared with other nanoparticles used in cancer theranostics, magnetoferritin can specifically target to tumor cells without any modification. We further demonstrated that Fe3O4 core encapsulated inside of protein shell exhibits the peroxidase activity that visualizes the tumors in the presence of chromogenic substrates. Therefore, the magnetoferritin nanopartilce is a bifunctional reagent for cancer detection. Based on this nanoparticle, we developed a new method for cancer diagnosis. After screening 541 clinical specimens of 10 kinds of human cancer tissues including liver cancer, lung cancer and colon cancer by this method, we verified that this method can distinguish cancerous cells from normal cells with a sensitivity of 95.77% and specificity of 95.72%. And we found the results were consistent with the immunohistochemical method which is the golden standard of cancer diagnosis. This new method achieves tumors targeting and visualization in one step, avoiding multi- step incubations with expensive and unstable antibodies, and repeated washing procedures of immunohistochemistry. This new magnetoferritin nanoparticle-based method is more rapid and simpler to implement and provides new ideas, new reagents and new technologies for cancer diagnosis and therapy (Fan K et al, Nature Nanotechnology, 2012). ABSTRACT VI On the basis of these findings, we design a novel H-ferritin-based antitumor drug delivery system. The loading of foreign molecule Dox (Doxorubicin) into the H-ferritin nanocage is dependent on their electrostatic interactions and the self-assembly property of H-ferritin subunits. In vivo in mice, Dox loaded H-ferritin (HFn-Dox) exhibits high tumor targeting capability that results in more than tenfold higher intratumoral drug concentration than free Dox and significantly inhibit tumor growth with only one single dose treatment. Importantly, HFn-Dox also shows excellent safety profiles that significantly reduces healthy organ drug exposure and improves the maximum tolerated dose by fourfold than free Dox. Compared with the clinically approved liposomal Dox (Doxil), HFn-Dox exhibited a significantly longer median survival times (more than 40 days vs 23 days ) and lower toxicity (less than 6.7% weight loss vs more than 15%) at the same dose administration in three different tumor models. Compared with traditional drug delivery system, the natural H-ferritin nanocarrier owns following advantages: excellent biocompatibility, natural tumor targeting and efficient EPR (enhenced permeability and retention effect) effects, low toxicity or immune response in vivo and easily scaling-up and manufacturing with robust and reproducible procedures. Thus, these unique properties make natural H-ferritin nanocage an intrinsic vehicle for efficient anticancer drug delivery. Key Words: Recombinant human ferritin, transferrin receptor 1, magnetoferritin, cancer diagnosis, drug delivery, tumor therapy 目 录 VII 目目 录录 致 谢 .I 摘 要 III ABSTRACT V 文献综述 1 1 纳米酶的发现及其应用 1 1.1 纳米酶的发现 1 1.2 纳米酶的特点 2 1.3 纳米酶的应用 8 1.4 小结 14 2 铁蛋白的功能及其生物学应用 15 2.1 铁蛋白的分类 15 2.2 铁蛋白的理化性质 16 2.3 铁蛋白的功能 16 2.4 铁蛋白受体 17 2.5 铁蛋白与疾病 18 2.6 磁性铁蛋白的仿生合成 20 2.7 铁蛋白在生物医学中的应用 21 2.8 小结 30 3 纳米材料在癌症的诊断与治疗中的应用 31 3.1 纳米材料靶向肿瘤的策略 31 3.2 纳米材料与癌症诊断 36 3.3 纳米材料与癌症治疗 37 3.4 小结 38 研究内容 39 第一部分 发现磁性铁蛋白纳米粒子新特性特异识别肿瘤并使其可视化 39 概述 39 1 材料与方法 40 1.1 实验材料 40 1.2 实验方法 41 2 实验结果 48 目 录 VIII 2.1 仿生合成磁性铁蛋白纳米粒 48 2.2 磁性铁蛋白具有过氧化物酶的催化活性 50 2.3 H 铁蛋白识别肿瘤细胞 . 52 2.4 建立肿瘤诊断新方法 56 3 小结与讨论 62 第二部分 H 铁蛋白作为药物载体识别并杀伤肿瘤细胞 66 概述 66 1 材料与方法 67 1.1 实验材料 67 1.2 实验方法 68 2 实验结果 75 2.1 HFn-Dox 纳米颗粒的制备及表征 75 2.2 HFn-Dox 的体外稳定性研究 77 2.3 HFn-Dox 特异性识别肿瘤细胞 77 2.4 HFn-Dox 在肿瘤细胞内的药物释放机制的研究 79 2.5 HFn-Dox 的药代动力学，组织分布和体内清除 80 2.6 HFn-Dox 的最大耐受剂量 83 2.7 HFn-Dox 的抗肿瘤活性 86 3 小结与讨论 89 参考文献 93 作者简介及在学期间发表的学术论文与研究成果 111 附 录 113 附录 A 主要奖项证书 . 113 附录 B 代表性论文首页 . 115 文献综述 1 文献综述文献综述 1 纳米酶纳米酶的的发现发现及其应用及其应用 一般情况下， 无机纳米材料被认为是一种惰性物质， 欲使其具有生物学活性， 通常在纳米材料的表面引入功能性生物分子， 比如将生物酶修饰在纳米材料的表 面，使其具有催化功能。然而，最新的研究发现，一些无机纳米材料本身即具有 类似酶的催化特性，其催化效率也与天然酶极为相似，而且催化活性还可以通过 改变其粒径、形貌和组分而进行调控。因此，科学家将这种自身具有类似生物酶 催化活性的无机纳米材料命名为纳米模拟酶，简称纳米酶1-3。 1.1 纳米酶的发现纳米酶的发现 2007 年， 作者实验室首次发现无机纳米材料 Fe3O4纳米颗粒本身具有类似辣 根过氧化物酶（Horseradish Peroxidase，简称 HRP）的催化活性1，第一次把纳 米材料的催化性能与天然辣根过氧化物酶的催化性能进行了比较系统地研究。 实 验证明，Fe3O4纳米颗粒的催化效率、反应动力曲线、催化机制和最适反应条件 都与天然辣根过氧化物酶极为相似，具有纳米模拟酶的特性。据此，首次提出纳 米酶的概念。 图 1.1 纳米酶 Fe3O4具有类似天然辣根过氧化物酶（HRP）的催化活性，能够催化 HRP 酶 三种不同底物（TMB, DAB, OPD）被 H2O2氧化，并产生相应的颜色反应3。 铁蛋白纳米粒：新功能的发现及在肿瘤诊断和治疗中的应用研究 2 纳米酶的催化特性正如图 1.1 所示，在过氧化氢存在时，Fe3O4磁性纳米颗 粒可催化 HRP 酶的三种底物发生氧化反应， 并产生与天然 HRP 酶完全相同的颜 色反应，即催化 TMB（3,3,5,5-四甲基联苯胺）氧化产生蓝色产物，催化 DAB （二氨基联苯胺） 氧化产生棕色产物， 催化 OPD （邻苯二胺） 氧化产生红色产物。 为更好的了解纳米酶的催化活性机理， Gao 等系统地研究了纳米酶的催化效 率、催化动力学曲线和催化机制1。经过与天然 HRP 酶的比较，结果发现，纳米 酶与天然酶的催化动力学和催化机理均相似。因此，Gao 等提出 Fe3O4纳米颗粒 是一类过氧化物模拟酶1。更有趣的是，这类纳米酶的催化活性是可调节的，比 如相同质量的纳米酶，粒径越小，其催化效率越高，这种尺度效应正是纳米科学 研究的核心问题。 纳米酶是一类新型的人工模拟酶，同时还是一种双功能分子，它既有纳米材 料独特的物理性能（光、电、磁等特性） ，又具有类似天然酶的高效催化功能， 而且结构稳定、经济、易于大规模制备。因此，自从纳米酶被首次报道以来，迅 速引起了物理、材料、化学、环境、生物和医学等多个领域的高度关注，成为了 多学科交叉研究的热点，也促使越来越多不同形貌、尺度和材料的纳米酶相继出 现。科学家在研究纳米酶催化机制的同时，还将其催化特性应用于医学、化工、 食品、农业、环境监测与治理等多个领域2，并逐渐形成了纳米酶研究和应用的 新领域。从图 1.2 中可以看出，无论是相关论文，还是施引文献，都是呈逐年上 升的趋势。 图 1.2 自 2007 年以来，纳米酶相关论文及其施引文献呈逐渐递增的发展趋势。 （A）纳米酶 相关论文的发表情况； （B）纳米酶施引文献逐年递增（数据来自 Web of knowledge，截止到 2013 年底） 。 1.2 纳米酶的特点纳米酶的特点 经过几年的系统研究，研究人员发现纳米酶具有以下的特点： （1）纳米酶是一种双功能分子：纳米酶具有生物酶活性和纳米材料的“双重 身份”。区别于天然酶和传统模拟酶，除了具有酶活性之外，纳米酶还具有纳米 文献综述 3 材料独特的理化特性。例如，铁磁纳米颗粒不仅具有过氧化物酶的催化功能，还 具有磁性；硫化镉纳米粒子不仅有催化活性，还可产生荧光信号。因此，纳米酶 也被视为双功能或多功能分子。 如何把纳米酶的催化活性与其理化特性巧妙地结 合起来，创造出更多奇特的新功能，将是值得进一步研究的新课题3。 （2）催化效率高：纳米酶作为一类新型的模拟酶，它所具有的高效催化活 性是之前许多传统模拟酶所不及的。传统模拟酶多是在有机复合物的基础上，利 用聚合物胶束或分子印迹技术等模拟酶催化中心的分子结构及微环境。 这些模拟 酶存在的普遍问题是催化活性和选择性均较低，而且制备成本较高，至今无法满 足实际需求。然而，纳米酶具有与天然酶相似的催化活性。以辣根过氧化物酶为 例，在其活性中心存在一个含铁的卟啉环，酶的高效催化正是通过铁原子的氧化 还原而实现的。Fe3O4纳米颗粒表面含有大量的铁原子，尽管其催化活性受诸多 因素的影响，但纳米酶表面 Fe2+/Fe3+之间的转换是纳米酶高效催化的关键，而且 相同单位质量的纳米酶，粒径越小催化活性越高，这种尺度效应是纳米酶催化活 性可调节的主要因素3。 图 1.3 Fe3O4纳米酶的最适条件及作用机理1。 （A）比较纳米酶与 HRP 的最适 pH； （B）比 较纳米酶与 HRP 的最适反应温度； （C）比较纳米酶与 HRP 的最适底物浓度； （D）纳米酶 催化反应发生在 Fe3O4颗粒的表面，而非释放到溶液中的铁离子的作用。 （3）有最适的反应条件：纳米酶的催化反应，与天然酶一样，受 pH、温度 和底物浓度的影响。比如，Fe3O4纳米酶的最适反应 pH 为 3.5（图 1.3 A） ，最适 铁蛋白纳米粒：新功能的发现及在肿瘤诊断和治疗中的应用研究 4 反应温度为 40 oC（图 1.3 B） 。纳米酶的催化活性也受底物浓度的调节。低浓度 H2O2促进 Fe3O4纳米酶的催化反应，而随着浓度的升高，催化活性受到抑制（图 1.3 C） 。与 HRP 天然酶不同的是，Fe3O4纳米酶更稳定，能适应较大范围的 pH 和温度变化，特别是经过 pH 10 或 80 oC 的条件处理后，仍然保持 80%的催化活 性1。 那么，纳米酶的催化活性是发生在纳米粒子表面，还是由于 Fe3O4纳米颗料 的铁离子释放到溶液中而引起的 Fenton 反应呢？为了回答这个问题，研究人员 首先将 Fe3O4纳米粒子放置于醋酸溶液中孵育一定时间，然后分别收集溶液上清 和纳米粒子，再分别检测这两部分的催化活性，发现只有纳米粒子可以引发相应 的颜色反应信号，而溶液上清引发的信号可以忽略不计（图 1.3 D） 。 （4）催化动力学曲线符合米氏方程：纳米酶催化底物的动力学曲线，如同 天然酶一样，也符合米氏方程。以 Fe3O4纳米酶催化双底物（H2O2与 TMB）的 颜色反应为例， 纳米酶对于底物 TMB 的米氏常数 Km 值比 HRP 天然酶小， 说明 Fe3O4纳米酶对底物 TMB 的亲和力高于 HRP (表 1.1)。 但是， 对于另一底物 H2O2 而言，Fe3O4纳米酶的 Km 值比 HRP 高。这一结果与 Fe3O4纳米酶催化反应所需 最适 H2O2浓度高于 HRP 所需浓度是一致的。除了 Fe3O4纳米酶外，其他多种纳 米酶也表现出相似的特性， 即对 TMB 具有较高的亲和力， 对 H2O2则相对较低。 这种现象可能与纳米材料表面的物理和化学性质有关， 纳米材料具有较大的比表 面积， 表面电荷丰富，相貌复杂，容易吸附带正电的 TMB，造成较高的亲和力。 表 1.1 Fe3O4纳米酶催化动力学参数1 E (M) Substrate Km(mM) Vmax (M s-1) kcat (s-1) Fe3O4 MNPs 11.4 10-13 TMB 0.098 3.44 10-2 3.02 104 Fe3O4 MNPs 11.4 10-13 H2O2 154 9.78 10-2 8.58 104 HRP 2.5 10-11 TMB 0.434 10.00 10-2 4 103 HRP 2.5 10-11 H2O2 3.7 8.71 10-2 3.48 103 注：E 酶浓度，Km 米氏常数，Vmax 最大反应速度，kcat 催化常数。 （5）催化机理符合乒乓机制：Fe3O4纳米酶的催化机理，与 HRP 酶类似， 也符合乒乓机制1。利用电子自旋共振（ESR）的方法，Zhang 等检测到在 Fe3O4 纳米酶的催化反应体系中存在典型的羟基自由基（ OH）的信号（图 1.4 A） 。然 而，在不含 Fe3O4纳米粒的溶液中未检测到羟基自由基的信号（图 1.4 B）4。对 Fe3O4纳米酶催化底物发生反应时，固定一个底物的浓度，改变另一个底物浓度 的所测得酶活性进行双倒数作图，测得的线的斜率是平行的，这个结果表明纳米 酶发挥催化作用时，先与一种底物结合反应后，再与另一种结合，符合乒乓机制 文献综述 5 理论（图 1.4 C，D）1。由此可知，Fe3O4纳米酶的催化机理符合乒乓机制，并 且催化反应过程如下：Fe3O4纳米酶首先催化 H2O2产生羟基自由基，生成 Fe3O4 纳米颗粒自由基复合物，后者再与显色底物 TMB 或 OPD 或 DAB 结合，复合 物中的羟基自由基将显色底物氧化，并产生颜色反应。 图 1.4 Fe3O4纳米酶的催化机理。 (A,B) 电子自旋共振检测 Fe3O4纳米酶催化过氧化氢产生自 由基4；(C, D) 利用双倒数法研究 Fe3O4纳米酶催化机理1。 （6）催化类型多样：纳米酶的催化反应还受溶液 pH 调控。如在酸性 pH 时 （pH=3.6） ， Fe3O4纳米酶表现强的过氧化物酶催化活性， 即催化过氧化氢产生羟 基自由基，后者能够与底物 TMB、OPD、DAB 等反应产生颜色信号。然而，当 pH 在中性或者更高时，Fe3O4纳米酶表现出过氧化氢酶的催化活性，催化过氧化 氢产生氧气和水，而不再产生羟基自由基诱发颜色反应，这是 Fe3O4纳米酶与 HRP 酶的主要区别。 （7）再生功能强：纳米酶与生物酶或者化学催化剂相比，具有更好的稳定 性，对多种极端条件比如高温、酸碱等耐受，经过回收后仍然具有良好的催化活 性， 可以反复使用。 以 Fe3O4纳米酶降解引发水污染的致癌物苯酚为例， Fe3O4纳 米酶在常温条件下，即可利用催化底物过氧化氢产生羟基自由基，高效的分解常 规方法难以降解的苯酚。在催化反应完成后，利用 Fe3O4纳米酶所独有的磁学性 能，可以快速将纳米酶从反应溶液中分离回收。回收后的纳米酶可以再次用于苯 酚降解，这样经 5 次循环使用后 Fe3O4纳米酶的催化活性仍能保持（图 1.5）4。 此项研究结果表明纳米酶具有很强的再生能力，可以多次反复使用，从而节省成 铁蛋白纳米粒：新功能的发现及在肿瘤诊断和治疗中的应用研究 6 本，符合绿色化学发展的需要。 图 1.5 Fe3O4纳米酶降解污水中的致癌物（苯酚） 。经 5 次循环使用后，仍能保持原始较高的 催化活性4。 （8）催化活性受纳米颗粒尺寸、形状及组份的影响 由于纳米粒子体积极小，所包含的原子数很少，相应的质量极小。因此，许 多现象就不能用通常有无限个原子的块状物质的性质加以说明， 这种特殊的现象 通常称之为小尺寸效应。当金属或非金属被制备成小于一定尺度的粒子时，其物 理化学性质就发生了根本的变化，表面的电子变得非常活跃。纳米酶的催化功能 与尺寸效应和表面效应密切相关。 这些为优化模拟酶的催化活性提供了可操作的 途径， 研究者可以通过控制纳米酶的粒径大小和表面修饰来提高纳米酶的催化活 性和底物选择性。例如，Fe3O4纳米酶的催化活性与其粒径的大小密切相关。有 研究表明，相同单位质量的纳米酶，粒径越小，催化效率越高。如图 1.6 所示， 催化活性由高到低依次是 30 nm、150 nm、300 nm。 图 1.6 氧化铁纳米酶的粒径尺寸影响其催化活性1 然而，对于单个纳米粒子而言，其规律是颗粒越小，表面积越小，催化能力 越小。比如，一个直径为 300 nm 的单颗粒的表面积是粒径为 150 nm 颗粒表面 积的 4 倍，其催化活性也是 150 nm 颗粒的 4 倍1。因此，通过控制纳米酶的尺 度是调节其催化活性的有效方法。 文献综述 7 除了尺度效应之外，纳米酶的形貌也影响其催化活性。研究人员曾经对比了 不同结构和形貌的氧化铁纳米酶的催化活性，包括 Fe3O4纳米粒子结构体、三角 片状结构、八面体结构。结果发现在相似纳米尺度下，这三种不同纳米结构的 Fe3O4模拟酶表现出不同的催化能力，其中颗粒结构的催化活性最大，八面体结 构的催化活性最小。通过分析推测，这种差别可能是由于不同的纳米结构其表面 铁原子晶格排列方式的不同所致5。因此，如何选择纳米酶的形貌，使其保持高 效的催化活性和稳定性，是值得继续深入研究的课题。 纳米酶的组份对其催化活性的影响是非常明显的。研究发现，Fe3O4纳米颗 粒中的 Fe2+/Fe3+的比例，直接影响其催化活性。其中的 Fe2+比例越高，其过氧化 物酶活性越强。为了提高纳米酶的催化活性，我们用 NaHB4处理 Fe3O4纳米颗 粒，使 Fe3+还原为 Fe2+，从而增加纳米酶分子中 Fe2+的比例，提高纳米酶的活性 1。另外，在双金属合金纳米材料中，调整两种金属的比例也可以调节其纳米酶 的活性6。 （9）催化活性受纳米颗粒表面修饰的影响 纳米酶的催化活性还受到其表面微环境的影响。表面微环境包括表面电荷、 亲水性、疏水性及其他弱相互作用等。酶反应动力学分析表明，纳米酶表面经过 一些修饰后将改变其对底物的亲和力。 例如， 在氧化铁纳米酶表面引入氨基之后， 提高了该酶对底物 ABTS 的亲和力，而引入巯基则提高了对 H2O2的亲和力7。 此外，在氧化铁纳米酶表面引入普鲁士蓝分子，提高了二价铁的比例，可极大地 提高其催化活性8。 图 1.7 纳米酶表面修饰对其催化活性的影响1 然而，在比较葡聚糖、聚乙二醇、氨基和二氧化硅修饰的纳米酶的催化活性 时， 发现葡聚糖和聚乙二醇修饰的纳米酶催化活性高于氨基和二氧化硅修饰的纳 米酶，但所有修饰的纳米酶的活性均低于无修饰的 Fe3O4纳米酶（图 1.7） 。 另外，金纳米粒子的表面修饰也影响其催化活性。经氨基或柠檬酸修饰后催 铁蛋白纳米粒：新功能的发现及在肿瘤诊断和治疗中的应用研究 8 化活性会低于未修饰的金纳米粒子9。氨基修饰的金纳米粒子对 ABTS 的底物亲 和力高于柠檬酸修饰的金纳米粒子，但若以 TMB 为底物，则正好相反。这种现 象与上面的氧化铁纳米酶修饰的结果一致， 表明纳米酶的催化活性直接来自于材 料表面的金原子，而且表面修饰的电荷会影响底物的亲和性和最终的催化活性。 1.3 纳米酶的应用纳米酶的应用 1.3.1 检测血糖和尿酸检测血糖和尿酸 葡萄糖检测在生物医学分析领域和糖尿病的监测方面起着十分重要的作用。 目前，临床上检测葡萄糖主要采用的是葡萄糖氧化酶比色法，其原理是通过双酶 联用体系，即辣根过氧化物酶和葡萄糖氧化酶联用产生颜色反应而实现的，即首 先是葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产生 H2O2，然后辣根过氧化物酶催化过氧化氢产 生羟基自由基，后者与底物 TMB 或 ABTS 反应并产生颜色10。葡萄糖的含量是 根据颜色信号的强弱而定。 图 1.8 纳米酶用于葡萄糖浓度检测2 由于 Fe3O4纳米酶同时兼具过氧化物酶的催化功能和纳米材料的理化性质， 它不仅能够取代比色法中的 HRP 酶，而且还可以把葡萄糖氧化酶（Glucose Oxidase, GOX）直接固定在铁磁纳米颗粒的表面，在葡萄糖氧化酶催化葡萄糖产 生 H2O2的同时，纳米酶便可以直接发挥其过氧化物酶的催化活性，继而与底物 TMB 或者 ABTS 产生颜色反应（图 1.8） 。这种基于 Fe3O4纳米酶的方法能够简 便、迅速地检测葡萄糖的含量10。除此之外，利用 Fe3O4纳米酶催化 H2O2反应 文献综述 9 的过程中产生电子转移的特征，可以利用电化学的方法，通过电流信号判断葡萄 糖的浓度11。这种葡萄糖检测方法具有高的灵敏度和好的选择性。 这种双酶连续反应体系还可用于半乳糖和尿酸检测。如图 1.8 B 所示，将半 乳糖氧化酶修饰到 Fe3O4纳米颗粒表面，半乳糖氧化酶氧化半乳糖的反应中会产 生 H2O2， 显色底物在后者存在的情况下， 会被 Fe3O4纳米酶催化氧化产生颜色信 号12。研究发现，上转换纳米颗粒（NaYF4Yb, Er）也具有过氧化物酶的性质 13，如果将尿酸氧化酶修饰到上转换纳米颗粒表面，即可实现尿酸的定量检测。 尿酸氧化酶氧化尿酸的过程中同样会产生 H2O2，在后者存在的条件下，上转换 纳米酶可以催化 TMB 发生显色反应，通过间接比色法检测尿酸的含量。这种检 测半乳糖及尿酸的方法具有成本更低、 稳定性较高的特征， 具有很好的应用前景。 从纳米酶在血糖和尿酸检测方面的应用上来看， 纳米酶的独特性质和功能拓 展了发展便宜、稳定、易制备的生物传感器新的思路。 1.3.2 血清免疫检测血清免疫检测 纳米酶的出现，为临床诊断提供了新思路和新方法。一方面，纳米酶如同生 物酶一样可以作为探针信号分子，应用于临床常规检测。例如，比色法 （Colorimetry） 、酶联免疫吸附测定法（Enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA） 、胶体金免疫层析法（Gold immunochromatographic assay, GICA） 、免疫 组织化学 （Immunohistochemistry, IHC） 、 流式细胞术 （Flow Cytometry, FCM） 等。 另一方面，纳米酶还具有生物酶所不具备的物理特征（如磁性） 。这种催化和磁 性并存的双功能特性，使纳米酶的应用空间更为广阔。 双抗夹心 ELISA 法是临床上最常用的血清免疫检测方法，其基本原理是： 待测样品中的抗原首先与抗体（通常固定在 96 孔板中）结合形成复合物，再与 HRP 酶标记的抗体结合，在 HRP 酶底物存在的条件下即会产生颜色反应，通过 比色法就可以测得抗原的含量。其中 HRP 酶是免疫检测中常用的重要工具酶。 但是 HRP 酶作为一种蛋白酶，稳定性差，价格高。同时传统的双抗夹心法不能 使样品中的待测抗原富集，因此，限制了对痕迹量样品的检测。而基于纳米酶的 双抗夹心 ELISA 法，不仅能够取代 HRP 酶，更重要的是纳米酶本身还具有纳米 材料的特征， 能够富集抗原， 对提高检测灵敏度和痕迹量的检测具有巨大的优势。 比如 Fe3O4纳米酶，既具有过氧化物酶活性，又具有磁性，在外加磁场作用下能 够定向移动14。因此，将 Fe3O4纳米材料粒磁性与催化活性相结合，可以建立一 个集分离、富集和检测三功能于一体的新型酶联免疫检测方法15。 利用纳米酶建立的免疫检测方法，可对很多抗原实现快速检测。表 1.2 总结 了最近几年纳米酶在免疫检测方面的应用。 这些利用纳米酶建立的酶联免疫检测 方法，提高了对病原检测的速度和灵敏度，而且成本更低，更稳定。在临床诊断 铁蛋白纳米粒：新功能的发现及在肿瘤诊断和治疗中的应用研究 10 方面具有巨大的应用前景3。 表 1.2 基于纳米酶的免疫检测 待测抗原 纳米酶及参考文献 HBV preS1, Tn1 Fe3O4 nanoparticle1 CEA Fe3O4 nanoparticle15 Her2, Rotavirus Fe3O4 nanoparticle16 Herbicide, Bensulfuron-methyl Palladiumgold bimetallic nanostructures17 Nitrated human ceruloplasmin Ferritin nanoparticle18 Sticholysin Manganese ferrite nanoparticles19 Vibrio cholera Magnetic polymeric nanoparticle20 human thrombin Gold nanoparticle21 sulfate-reducing bacteria Manganese oxide nanowire22 EpCAM Cerium oxide nanoparticles23 EGFR Iron oxide nanoparticles24 1.3.3 体内无标记示踪体内无标记示踪 目前纳米材料已被作为药物载体和造影剂被广泛应用于体内影像和疾病治 疗。Fe3O4 磁纳米粒是第一个应用于体内影像的纳米材料。在研究纳米材料对疾 病诊断和治疗作用的同时，对于其生物安全性的讨论同样引起了极大的关注。在 纳米酶出现之前，为了研究铁磁纳米颗粒在体内的分布、代谢以及清除规律，人 们通常是以如下几个方法来实现的： （1） 放射性标记方法，是利用 59Fe 作为原 料，合成磁性纳米颗粒，该方法虽然保持了材料的原有的特性且灵敏度高，但存 在放射性污染、检测复杂、费时等缺点； （2） 荧光标记方法，是通过静电吸附 或共价偶联将荧光分子与磁性纳米颗粒结合，但荧光分子在体内不稳定，容易淬 灭，不能很好的指示材料的代谢情况；另外，通过静电吸附与磁性纳米颗粒结合 的荧光分子在体内容易从材料上脱落， 在没有到达组织前可能已经从材料上释放 出来，检测到的可能是游离的荧光分子，不能很好的示踪材料在各组织、脏器的 分布，而通过共价偶联的方法修饰磁性纳米颗粒，可能会造成材料本身特性的改 变，比如造成磁性纳米颗粒的交联； （3） 普鲁士蓝染色法，是在酸性条件下， 三价铁与亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝色的亚铁氰化铁沉淀，该方法虽然不需 对材料进行预标记，但存在检测灵敏度低的缺点。 （4） 电感耦合等离子体原子 发射光谱法(ICP-OES)，该方法是通过测定各脏器铁元素含量，分析磁性纳米颗 文献综述 11 粒在体内的分布，但是由于体内含有内源性铁离子，ICP 无法区别内源铁离子和 注射的磁性纳米颗粒，会对分析造成干扰。由此可见，传统的示踪磁性纳米颗粒 体内分布的方法存在一定的局限性。 图 1.9 纳米酶无标记体内示踪新方法25 由于纳米酶的出现，不再需要在纳米材料的表面标记任何基团，使得磁纳米 材料的体内示踪变得容易操作。研究人员借助其纳米酶的催化性质，探索了一种 无标记技术，来示踪纳米粒在体内的代谢情况。该方法仅需在小鼠体内注射入不 经标记的磁纳米粒，再由其过