CD146在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究

分类号 分类号 密级 密级 UDC UDC 编号 编号 中国科学院研究生院 硕士学位论文 CD146 在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 郑超固 郑超固 指 导 教 师 阎 锡 蕴 研究员 指 导 教 师 阎 锡 蕴 研究员 指 导 教 师指 导 教 师 中国科学院生物物理研究所 中国科学院生物物理研究所 申请学位级别 硕士 申请学位级别 硕士 学科专业名称 生物化学与分子生物学 学科专业名称 生物化学与分子生物学 论文提交日期 2009 年 5 月 论文提交日期 2009 年 5 月 论文答辩日期 2009 年 5 月 25 日 论文答辩日期 2009 年 5 月 25 日 培 养 单 位 中国科学院生物物理研究所 培 养 单 位 中国科学院生物物理研究所 学位授予单位 中国科学院研究生院 学位授予单位 中国科学院研究生院 答辩委员会主席 罗永章 答辩委员会主席 罗永章 郑超固硕士毕业论文 2009 摘要 1 摘 要 摘 要 肿瘤微环境中存在着大量促血管生成因子，其所诱导的肿瘤血管生成是肿瘤发 展和转移的重要步骤。我们实验室之前的研究以及其他实验室的研究都发现内皮细 胞粘附分子CD146可能参与血管生成的过程。然而，CD146在血管生成，特别是肿 瘤血管生成中是如何发挥作用的， 以及其是否能够介导下游信号转导， 都并不清楚。 在此项研究中，我们发现用siRNA抑制内源的内皮CD146表达可以显著的阻断 由肝癌细胞分泌物所诱导的内皮细胞形成管腔的体外血管生成作用，以及内皮细胞 的迁移。生化分析显示CD146是肿瘤分泌物所引发的p38/IKK/NF-B信号通路活化 所必需的，而且参与了IL-8、ICAM-1和MMP-9等NF-B下游促血管生成基因的诱导 表达。这些数据表明CD146通过介导肿瘤微环境引起的促血管生成的NF-B信号通 路活化，从而参与肿瘤血管生成。 更有意思的是我们发现 CD146 二聚化与其在肿瘤血管生成中的信号传导功能 可能密切相关。抗 CD146 单克隆抗体 AA98 能够同时抑制 CD146 二聚化及 CD146 介导的 p38/IKK/NF-B 信号通路和促肿瘤血管生成的作用。同样地，破坏 AA98 的 抗原表位 （即突变 AA98 识别所必需的 C452 和 C499） 也同时破坏了 CD146 二聚化 及 CD146 的介导信号传导和血管生成的功能。这些相关性指示，像很多传导信号的 膜受体一样， CD146 的二聚化可能是其介导胞外信号传导功能的必要条件， 而 C452 和 C499 之间的二硫键是 CD146 二聚化和功能的结构基础。此外，单抗 AA1 和破 坏 AA1 的识别位点 aa50-54，均不能抑制 CD146 二聚化及其在血管生成中的功能， 进一步说明了 AA98 识别的基于 C452-C499 二硫键的空间结构表位的特殊意义。 总之，此项工作首次揭示了CD146的促进血管生成的作用，并且指出了CD146 发挥信号转导功能和CD146二聚化的结构基础。这些证据都预示着CD146分子参与 肿瘤血管生成时，很可能不仅仅作为一个细胞粘附分子，也有可能充当信号受体发 挥功能。 本硕士毕业论文的另外一部分工作是对于新型抗肿瘤抗体CC4的研究。抗体 CC4是通过用活的结直肠癌细胞LS 174T免疫小鼠获得， 在体内荷瘤裸鼠实验中呈现 出良好的靶向肿瘤和抑制肿瘤的活性。 此项工作中， 我们还发现了抗体CC4能够 （1） CD146 在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 2 在体外抑制结直肠癌细胞的增殖；（2）抑制结直肠癌细胞的聚集和迁移；（3）引 起强烈的抗体介导的细胞毒反应。 为了研究抗体CC4抑瘤活性的具体机制， 我们用免疫沉淀和蛋白组学的方法鉴定 出抗体CC4的抗原蛋白是CEACAM5（也称CEA或者CD66e）。进一步的抗原表位鉴 定发现抗体CC4识别一个处于CEACAM5氨基酸序列aa42-61中的线性表位。通过分 析CEACAMs基因家族的同源性，我们发现这一表位在不同家族成员中高度保守。 随后的实验也证实了抗体CC4能够结合CEACAM1蛋白相应的aa42-61区段，并且识 别CEACAM6和CEACAM8蛋白，进一步证明了CC4识别的抗原表位在CEACAM家 族成员中高度保守，这预示着CC4的抗肿瘤活性很可能是通过影响多个CEACAM家 族成员的功能来实现的综合效应。 在研究抗体CC4抑瘤作用机理时，我们发现抗体CC4可能具有抑制CEACAMs介 导的肿瘤细胞生长、 侵袭和转移的功能之外， 还能够阻断结直肠癌细胞上CEACAM1 或者CEACAM5与NK细胞上CEACAM1的免疫抑制性结合， 从而增强NK细胞对于肿 瘤细胞的杀伤作用，抑制肿瘤免疫逃逸过程。这些工作部分阐明了抗体CC4的抑制 肿瘤生长的机制，并且为其可能的临床肿瘤治疗应用奠定了基础。 关键词：CD146、肿瘤血管生成、NF-B、二硫键、单克隆抗体、CEACAMs、结直 肠癌、肿瘤治疗 郑超固硕士毕业论文 2009 摘要 3 Abstract Chaogu Zheng (Biochemistry and Molecular Biology) Directed by Xiyun Yan Tumor angiogenesis, induced by tumor-secreted pro-angiogenic factors, is an essential process for cancer development and metastasis. Our previous studies and others works indicated that CD146, which is identified as an endothelial cell adhesion molecule, might be involved in blood vessel formation. However, its exact role in angiogenesis, particularly tumor angiogenesis, and its potential function of mediating downstream signaling are still unclear. In present study, we evidenced that silencing endogenous endothelial CD146 by RNAi significantly impaired hepatocarcinoma cell secretions-promoted tubular morphogenesis and -enhanced motility of endothelial cells. Biochemical studies revealed that CD146 was required for the activation of p38/IKK/NF-B signaling cascade and up-regulation of NF-B downstream pro-angiogenic genes, notably IL-8, ICAM-1 and MMP9, in response to tumor secretions. These data indicated that CD146 contributed to tumor angiogenesis by mediating the activation of pro-angiogenic NF-B signaling. Interestingly, we discovered a close correlation between CD146 dimerization and its function of mediating pro-angiogenic signaling. Anti-CD146 mAb AA98 could concurrently inhibit CD146 dimerization and CD146-mediated p38/IKK/NF-kB cascade and tumor angiogenesis. Moreover, imparing the epitope of AA98 by mutating C452 and C499, which are indispensible for AA98 recognition, also suppressed both CD146 dimerization and its pro-angiogenic role. These correlations indicated that just like typical membrane receptor, CD146 dimerization might be the prerequisite for its function of mediating “outside-in” signal transduction and disulfide bond between C452 and C499 is the structural basis for CD146 dimerization and functioning. Additionally, neither mAb AA1 nor impairing the binding site of AA1, aa50-54, could affect CD146 dimerization and its pro-angiogenic function, further confirming the special role of AA98-recognized conformational epitope based on C452-C499 disulfide bond. CD146 在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 4 Together, this study for the first time uncovered the pro-angiogenic role of CD146 and also pinpointed the key structural basis responsible for its signaling function and dimerization. These findings also suggested that CD146 might serve as not just a cell adhesion molecule but also a membrane signal receptor in tumor-induced angiogenesis. Another part of this dissertation is the study of a novel anti-CEACAMs monoclonal antibody CC4, which was previously generated by immunizing mice with living colorectal cancer cells LS 174T and exhibited great tumor-suppressing and -targeting capability in our previous works. In present study, our biological function studies found that mAb CC4 could (1) inhibit colorectal cancer cell proliferation; (2) suppress cell migration and aggregation of colorectal cancer cells in vitro; (3) raise strong antibody-dependent cell cytotoxicity (ADCC) reaction. In order to elucidate the mechanism of mAb CC4s anti-tumor activity, we have identified the antigen protein of this mAb as CEACAM5, also known as CEA and CD66e, by immunoprecipitation and proteamic methods. Further epitope mapping indicated that mAb CC4 recognized a linear epitope located within aa42-61. Homologous analysis of genes in CEACAMs family showed that this epitope is highly conserved between different family members. Further studies showed that mAb CC4 was able to bind the region of aa42-61 within the amino acid sequence of CEACAM1 and also recognized CEACAM6 and CEACAM8 proteins, supporting the idea that mAb CC4 recognized a conserved epitope among CEACAMs. It indicated that mAb CC4s function of suppressing tumor growth is a combinational effect of affecting multiple CEACAMs functions. In addition to its function of inhibiting CEACAMs-mediated tumor survival, growth, invasion and metastasis, we also found that mAb CC4 blocked the CEACAM1-CEACAM5 or CEACAM1-CEACAM1 interaction between colorectal cancer cells and NK cells, and then enhanced the NK killing of tumor cells and repressed tumor immune escape. These studies partially eluciadate the anti-tumor mechanism of mAb CC4 and strengthen its potential application in clinical cancer therapy. Key words: CD146, tumor angiogenesis, NF-B, disulfide-bond, dimerization, monoclonal antibody, CEACAMs, colorectal cancer, cancer therapy 郑超固硕士毕业论文 2009 目录 5 目 录 目 录 中文摘要 中文摘要 1 英文摘要 英文摘要 3 目录 目录 5 文献综述 第一部分 文献综述 第一部分 CD146与肿瘤血管生成机制 与肿瘤血管生成机制 6 1 肿瘤血管生成机制 6 2 CD146分子与肿瘤血管生成 17 第二部分 结直肠肿瘤抗体药物与第二部分 结直肠肿瘤抗体药物与CEA蛋白家族 蛋白家族 21 1 肿瘤抗体药物 21 2 CEA蛋白家族与肿瘤 26 研究内容 第一部分 研究内容 第一部分 CD146在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 32 概述 32 1 材料与方法 34 2 实验结果 46 3 小结与讨论 62 第二部分 新型结直肠癌抗体第二部分 新型结直肠癌抗体CC4的抗原鉴定及功能研究 的抗原鉴定及功能研究 65 概述 65 1 材料与方法 66 2 实验结果 73 3 小结与讨论 86 参考文献 参考文献 89 发表文章 发表文章 98 致谢 致谢 99 郑超固硕士毕业论文 2009 文献综述 6 文献综述 文献综述 第一部分 第一部分 CD146与肿瘤血管生成机制 与肿瘤血管生成机制 1. 肿瘤血管生成机制肿瘤血管生成机制 自从Judah Folkman教授于1971年提出肿瘤生长浸润依赖于肿瘤组织内血管的 形成1的观点之后，肿瘤血管生成逐渐成为近几十年肿瘤研究领域的热点问题。同 时靶向肿瘤血管生成的治疗性药物也越来越多的受到研究人员的关注，目前已有包 括Avastin、Macugen、Endostatin 等多种抗肿瘤血管生成药物上市，此外，还有大 量的针对不同靶标的抗肿瘤血管生成药物进入临床研究阶段。 1.1 肿瘤血管生成过程肿瘤血管生成过程 血管生成（angiogenesis）是指已存在的血管芽生（sprouting）和套叠式的微血 管生长（intussusceptive microvascular growth）形成新的血管的过程。虽然血管生成 和血管形成（vasculogenesis）均认为是形成原始血管的机制，但两者的概念不同， 后者主要是指胚胎细胞分化形成血管网络2。生理性的血管生成只存在于生殖系统 和伤口愈合的过程，是短暂并且受到严格控制的，失控的血管生成则导致多种疾病 如糖尿病视网膜病、风湿性关节炎等。 肿瘤生长分为两个阶段，即血管前期和血管期。血管前期肿瘤主要通过扩散作 用获得营养和氧，并运走代谢产物。当肿瘤体积增至(12)mm3以上时，如无新生 血管长入，肿瘤组织将保持静止状态或退化3。一旦血管长入肿瘤，血液供应变为 灌注，新生血管不仅为肿瘤组织提供足够的营养和氧，还提供大量的生长因子，促 使肿瘤迅速生长。 血管生成也是肿瘤转移的关键环节：在肿瘤血管前期，循环中肿瘤细胞极少， 仅在血管化后它才持续出现在循环系统中，肿瘤微血管数量越多，肿瘤细胞进入血 液循环的机会就越大4。大量的血管不仅增加了肿瘤细胞进入循环系统的机会肿瘤 新生血管不成熟，结构缺乏完整性，管壁薄弱，仅排列一层内皮细胞，基膜也不完 整，因此穿透性较高；肿瘤的血管化使间质内液体量和压力增高，加快淋巴回流， 亦是肿瘤转移的途径之一。再者，血管生成本身就具有一定的组织侵袭性，肿瘤细 CD146 在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 7 胞可以沿着新生血管所开启的胶原裂隙侵袭。另一方面，肿瘤细胞释放的血浆蛋白 酶原激活剂及胶原酶能诱导组织纤维蛋白的形成，进而形成肿瘤细胞转移所必需的 基质，使游离的肿瘤细胞通过基质迁移进入血液循环，在远离肿瘤的部位形成转移 灶5, 6。此外，肿瘤内微血管密度(MVD)与肿瘤的恶性程度有密切关系，目前肿瘤 组织内的MVD已成为预测肿瘤转移、复发及判断预后的重要指标7。 肿瘤血管与处于严格控制中的正常血管不同，其具有许多病理性的形态特征： 首先，血管粗细不均、膨胀、粗糙以及有终端。肿瘤血管不像正常血管一样分为动 脉、静脉以及毛细血管，而是高度混乱无序、血管扭曲。其次，肿瘤细胞和内皮细 胞相间排列在肿瘤血管腔内表面，形成“马赛克血管”；内皮不完整、基底膜不连 续甚至缺失、造成血管通透性高8, 9。而且，肿瘤血管缺乏功能性的淋巴系统10， 造成新生毛细血管间质高压，不仅进一步抑制淋巴管形成11，还干扰抗肿瘤药物 的运送12，同时促进肿瘤细胞的扩散和转移13。 1.2 肿瘤血管生成机制肿瘤血管生成机制 作为病理性的肿瘤血管生成过程，被认为有以下几个阶段： （1）肿瘤细胞和浸 润在肿瘤组织中的免疫细胞分泌大量的促血管生成因子，从而打破了维持血管正常 代谢的刺激因子和抑制因子之间的平衡，促血管生成因子的释放和活性上升，进而 激活肿瘤组织附近的血管内皮细胞，刺激内皮细胞分裂和增殖，并通过趋化作用诱 导内皮细胞向肿瘤组织迁移14。（2）在肿瘤细胞和活化的内皮细胞以及肿瘤组织 周围的间质细胞和免疫细胞的共同作用下，血管基底膜中的金属蛋白酶、丝氨酸蛋 白水解酶、尿激酶型血纤溶酶原激活剂等多种水解酶类水平上调15，基底膜与细 胞外基质被降解。 （3） 受到促血管生成因子刺激的内皮细胞， 表达大量的粘附分子， 如整合素v3，同时激发钙信号调节途径，促进细胞增殖和迁移，从而导致内皮细 胞侵入周围组织的基质层16。（4）在内皮细胞上，各种促血管内皮生长因子的受 体分子如Flt-1，Flk-1，Tie-1和Tie-2等表达量也相应增高17, 18。这些受体与生长 因子结合，促使内皮细胞组装形成管腔和血管网。（5）在angiopoietin-1和 angiopoietin-2 等因子作用下， 通过促进或松弛内皮细胞与其周围支持细胞的相互作 用，完成血管重塑19。图1-1概括了血管生成的整个过程。 在肿瘤血管生成过程中存在肿瘤细胞、内皮细胞、浸润免疫细胞、间质细胞以 郑超固硕士毕业论文 2009 文献综述 8 及胞外基质之间的相互作用，同时需要众多的信号分子以及效应分子的参与，因此 是一个十分复杂的过程。 图1-1 血管生成过程概况。引自血管生成基金会网站 1.3 肿瘤血管生成的调节机制肿瘤血管生成的调节机制 目前普遍接受的血管生成的调节机制是由Hanahan博士和Folkman教授于1996 年提出的“血管生成开关（angiogenic switch）”假说，该假说认为内皮细胞增殖形 成新血管的过程中存在一个“开关”，这个“开关”的状态由促进血管生成因子 （pro-angiogenic factors）和抑制血管生成因子（anti-angiogenic factors）的水平所决 定，当正负调节因子处于平衡时“关闭”，平衡被打破而倾向于促血管生成方向时 “打开”14, 20。此外，“血管生成开关”还受到多种信号的触发，包括代谢压力 （如低pH，缺氧，低血糖）、机械压力（如细胞增殖产生的压力）、免疫/炎症反应 （如免疫/炎症细胞浸润）和遗传突变（控制血管生成调节因子表达的原癌基因的激 活和抑癌基因缺失）21, 22，其中仍有大量细节未被揭示。 CD146 在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 9 生理性的血管生成过程受到严格的调控， “血管生成开关”准确的开启何关闭， 调节着血管生成的整个过程；而肿瘤血管生成却无法受到组织水平和细胞水平的准 确调节，“血管生成开关”在肿瘤微环境中存在的大量促血管生成因子的作用下长 期处于“开启”状态，并且完全失控23。 近几十年的研究发现了很多促进血管生成因子和抑制血管生成因子，列举如表 1-1，它们一起调节着“血管生成开关”，控制着内皮细胞分裂、增殖、游走和迁移， 控制着血管基底膜和周围的细胞外间质的降解和重塑。 Pro-angiogenic Factors Anti-angiogenic Factors Angiogenin Angioarrestin Angiopoietin-1 Angiostatin (plasminogen fragment) Del-1 Antiangiogenic antithrombin III Fibroblast growth factors: acidic (aFGF) and basic (bFGF) Cartilage-derived inhibitor (CDI) Follistatin CD59 complement fragment Granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) Endostatin (collagen XVIII fragment) Hepatocyte growth factor (HGF) /scatter factor (SF) Fibronectin fragment Interleukin-8 (IL-8) Gro-beta Leptin Heparinases Midkine Heparin hexasaccharide fragment Placental growth factor Human chorionic gonadotropin (hCG) Platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF) Interferon alpha/beta/gamma Platelet-derived growth factor-BB (PDGF-BB) Interferon inducible protein (IP-10) Pleiotrophin (PTN) Interleukin-12 Progranulin Kringle 5 (plasminogen fragment) Proliferin Metalloproteinase inhibitors (TIMPs) Transforming growth factor-alpha (TGF-alpha) 2-Methoxyestradiol Transforming growth factor-beta (TGF-beta) Placental ribonuclease inhibitor Tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) Plasminogen activator inhibitor Vascular endothelial growth factor (VEGF) Platelet factor-4 (PF4) Prolactin 16kD fragment Proliferin-related protein (PRP) Retinoids Tetrahydrocortisol-S Thrombospondin-1 (TSP-1) Transforming growth factor-beta (TGF-b) Vasculostatin Vasostatin (calreticulin fragment) 表1-1 促进血管生成因子与抑制血管生成因子。引自血管生成基金会网站 郑超固硕士毕业论文 2009 文献综述 10 1.3.1 促进血管生成因子促进血管生成因子 在促进血管生成因子中，VEGF及bFGF是最主要的活性因子，研究也最为深入。 VEGF基因外显子的选择性剪接，至少可产生5种VEGF变异体，即VEGF121、 VEGF165、VEGF189、VEGF145和VEGF206（其中VEGF165是主要的形式)24, 25。其 转录受多种因素调控， 包括突变的p53、 原癌基因ras、 缺氧环境和HIF、 PDGF、 EGF、 TNF-等生长因子和细胞因子26-28。 VEGF在体内能够调节血管的通透性， 在体外 能促进基质的降解、内皮细胞的增殖、迁移、运动和血管样结构的形成。VEGF的 生物活性是与其受体结合后发挥作用的。目前VEGF的受体已经发现4种：VEGFR-1 （fms-like tyrosine kinase, FLt-1）、VEGFR-2（kinase insert domain containing receptor/fetal liver kinase, KDR/Flk-1）、VEGFR-3及Soker等人发现的神经纤毛因子 -1（NP-1）29。这几种受体中，VEGFR-2在VEGF所诱导的血管生成中起到主要作 用，而VEGFR-1/Flt-1在VEGF所介导的血管生成中的作用不明。NP-1被认为是 VEGF165的一种受体，能够促进VEGF结合Flk-1而表现出丝裂原的活性。VEGF与受 体Flk-1结合后，通过PKC或者ras信号通路激活MAPK系统，引起内皮细胞增殖30。 FGF家族至少包括19个成员，分子量从1830kD不等，与肝素有很强的亲和力。 其中FGF-2（basic fibroblast growth factor, bFGF）是第一个被确定的促进血管生成因 子31。FGF能够促进内皮细胞增殖、粘附、运动、管腔结构的形成，能调节整合 素的表达，上调VEGF、Flk-1、uPAR的表达。FGF-2通过至少4种受体酪氨酸激酶而 起作用，FGFR-1在bFGF/FGFR系统中的作用最大。bFGF与FGFR1结合后，能够激 活PI3K、 PLC、 Ras等多种信号分子， 而Ras-Raf-MAPK信号途径的激活被认为是bFGF 诱导的血管生成效应所必需的31, 32。 除了表1-1中所列举的分泌型促血管生成因子之外，一些蛋白酶、粘附分子和小 分子物质（如-雌二醇、甘油一丁酸酯）也能够促进血管生成过程。 内皮细胞要运动和迁移，必须降解细胞外基质（ECM）。在ECM的降解酶系统 中，基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases, MMPs）和尿激酶型纤溶酶原 （urokinase type-plasminogen, uPA） 系统最重要， 并且两者存在着密切的联系。 MMPs 中以MMP-2和MMP-9研究最多， 它们都在血管生成中起着重要作用33-35。 MMP-2 基因敲除小鼠血管生长缓慢，肿瘤生长迟缓，因此，MMP-2被认为是肿瘤“血管生 CD146 在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 11 成开关”的一种调节因子36。MMP-9能够通过CD44结合于细胞表面从而促进血管 形成。这两种明胶酶（gelatinase）除了降解ECM外，还能够参与TNF-等血管生成 因子的释放37。uPA和uPAR结合后，通过信号转导，能够导致细胞的运动和侵袭。 更为重要的是，uPA活化后，能够使纤溶酶原变成为由活性的纤溶酶，纤溶酶可使 机制中的多种成分，如纤粘连蛋白（fibronectin, FN）、层粘连蛋白（laminin, LN） 等降解，促进血管生成38。此外，纤溶酶活化可导致MMP-1、MMP-3、MMP-9的 活化39。uPA系统和MMPs的活性调控有相似之处：均受到VEGF、bFGF等血管生 长因子的调控，均以酶原的形式释放，均受到其生理性抑制剂PAI、TIMP的调控。 内皮细胞的运动和增殖不仅与血管形成有关的酶类、生长因子及其受体有关， 而且与细胞粘附分子（cell adhesion molecule）有关。内皮细胞的侵袭、运动，内皮 细胞与ECM相互作用，血管环及管腔结构的形成等血管生成过程，均需要细胞粘附 分子的参与40。细胞粘附分子分为4大类：整合素家族（intergrins）、免疫球蛋白 家族（IgSF）、选择素家族（selectin）和钙粘素家族（cadherins）。其中整合素是 最重要的粘附分子， 能与基底膜的大多数成分， 如FN、 LN等通过Arg-Gly-Asp （RGD） 三肽结构结合。一般认为整合素与ECM结合后，其信号是通过粘附斑激酶（focal adhesion kinase, FAK）转导额。在整合素中，v3在血管生成中起到重要作用，能 在内皮细胞表面引发MMP-2降解基质的活性；能够抑制内皮细胞的p53及其所诱导 的p21蛋白的活性，从而表现出抗凋亡的效应16。近年来的研究表明，应用细胞粘 附分子的拮抗剂，能够阻断血管生成、肿瘤发展和肿瘤转移，如应用v3的抗体能 够阻断bFGF所诱导的血管生成，而v5的拮抗剂却能够阻断VEGF所引发的血管生 成41。 我们实验室于2003年发现，应用粘附分子CD146的抗体AA98能够阻断了肿瘤血 管生成，并且抑制包括肝癌、胰腺癌等多种肿瘤的生长，从而揭示了CD146可能作 为粘附分子参与肿瘤血管生成，并作为新型的抗肿瘤血管生成治疗的靶标42。 1.3.2 抑制血管生成因子抑制血管生成因子 内源性血管抑制因子，包括血小板反应蛋白（throm-bospondin-1，TSP-1）、干 扰素/、 血小板因子-4 （PF-4） 、 血管抑制素 （angiostatin） 及内皮抑制素 （endostatin） 等数十种，其中新近发现的angiostatin和endostatin尤为值得关注。angiostatin 是一个 郑超固硕士毕业论文 2009 文献综述 12 分子量为38 kD的纤维蛋白溶酶原片段， 能抑制内皮细胞增殖、 血管生成和肿瘤生长 43。angiostatin通过阻断裂解纤溶酶原的酶催化位点，阻止调节血管生成的基质重 塑，选择性阻断内皮细胞对血管生成刺激的反应，抑制微转移。其作用机制可能与 干扰ATP的合成有关。Endostatin是胶原蛋白XVIII的C末端片段，首先从小鼠血管内 皮细胞中分离获得44。它能封闭内皮细胞上丝裂原活化的蛋白激酶途径，抑制内 皮细胞增殖， 阻断血管生成， 作用机制可能与调节MMP-2的活性有关。 重组Endostatin 能抑制血管生成、肿瘤的生长和发展，经Endostatin处理的肿瘤与未经处理的肿瘤增 殖速率相似，但前者的程序性细胞死亡率较后者高7倍之多。细胞内Ca2+信号通道可 能参与启动和调节这两种血管抑制剂的生物活性45。新近发现的源自IV型胶原 NC1区的小分子肽段 （tumstatin） ， 其抑制血管形成的作用约为endostatin的10倍46。 1.4 NF B信号途径与肿瘤血管生成信号途径与肿瘤血管生成 NFB蛋白家族由五个成员组成，即p65 (RelA), RelB, c-Rel, p50/p105 (NF-B1), and p52/p100 (NF-B2), 相互之间能够形成同源或者异源二聚体。IB家族蛋白由七 个成员组成，分别是IB-, IB-, BCL-3, IB-, IB-, 以及前体蛋白p100和p105。 在静息的细胞中NF-B和IB家族蛋白结合在一起，NF-B的核定位序列（NLS）被 掩盖住，因而停留在细胞质中，其转录活性被抑制。晶体研究发现IB蛋白只是能 够特异性的掩盖p65的NLS，而p50的NLS却没有被遮蔽。p50上的这一有效的NLS与 p65和IB-上的核运出序列(NES)偶联，就使得IB-/NF-B这样一个复合物能够在 细胞核和胞浆之间穿梭。这样的一种动态平衡被IB-的降解所打破，因为降解作 用去除了IB-上的NES的功能，而同时将p65上的NLS释放出来，增强了p65/p50向 核内的转移47。 在传统的细胞生物学中，将NF-B信号通路分成两类，即经典的信号通路和非 经典信号通路，如图1-2所示。NF-B信号通路可以被多种因素激活，包括反应性氧 中间产物（如ROS）、细胞因子（如IL-1、TNF等）、细菌或病毒及其产物（如LPS 和dsRNA），紫外线（UV）、受体/配体（如CD40L/CD40）、生长因子（如EGF、 TGF-， HGH） 、 化学试剂等。 经典的信号通路指细胞接受到上游来自TNFR1/2, TCR, BCR, TLR/IL-1R, GF-Rs等受体信号， 活化IB激酶复合体 （IKK） 的亚基， 即IKK-， 被激活的IKK磷酸化IB蛋白N端的两个丝氨酸残基 （IB-为S32和S36， IB-为S19 CD146 在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 13 和S23），磷酸化的IB被泛素连接酶识别，最后被泛素化介导的蛋白酶体所降解， 释放出具有转录功能的p65/p50和p65/p52二聚体。在非经典信号通路中，细胞接受 的上游刺激是来自LT- -R, BAFFR, and CD40R，通过NIK激活IKK-，然后磷酸化 p100，之后p100被泛素化降解成p52，被释放的RelB/p52复合物进入核内，调节转录 过程。 IB被降解之后，NF-B释放出来，进入核内结合在含有B site的启动子或者增 强子区域，识别保守的DNA序列是GGGRNNYYCC。RelB, c-Rel, 和p65在C-端有一 个转录活化结构域（TAD）, 对于NF-B蛋白的转录活性十分重要，而当NF-B被化 学修饰之后，例如磷酸化、乙酰化，TAD的功能和活性被大大提高了，这是在另外 的一个层面上调节NF-B介导的转录应答。活化NF-B能够调节很多基因的表达， 在一定程度上调控相当广泛的生理病理过程，如免疫和炎症反应，免疫系统中T 细 胞和B 细胞、内皮细胞、巨噬细胞/抗原呈递细胞中的细胞因子、白介素、粘附分子 的表达48。 在肿瘤血管生成过程中，NF-B信号通路也发挥重要作用。首先，肿瘤细胞和 肿瘤组织中浸润的免疫细胞都会分泌大量的炎症因子，如TNF-和IL-1，这些炎症 因子能够刺激内皮细胞的NF-B活化49， 并且促进血管生成50, 51。 活化的NF-B p65和p50亚基组成异源二聚体被转运到细胞核内， 诱导促血管生成因子如IL-8, IL-6, MCP-1和VEGF， 粘附分子ICAM-1, VCAM-1和E-selectin， 基质金属蛋白酶 （MMPs） ， 以及其它一些促进血管生成的蛋白如NOS、Laminin的表达，这些效应分子在内皮细 胞活化以及血管生成过程中发挥重要的作用52-57。另一方面，Miyake等人报道用 NF-B假义核苷酸 （decoy oligodeoxynucleotides） 可以在兔静脉移植模型中显著抑制 新生内膜增生（neointimal hyperplasia），也进一步支持了NF-B在血管形成过程中 的促进作用58。此外许多研究表明经常存在于肿瘤微环境中的氧化压力（oxidative stress）和缺氧（hypoxia）等条件也能够活化内皮细胞中的NF-B，上调趋化因子和 抗氧化蛋白的表达， 包括NOS， COX-2和MnSOD， 从而维持局部内皮组织的稳定性， 增强内皮细胞的迁移能力59-62。综上所述，NF-B信号通路在肿瘤血管生成过程 中发挥着介导内皮细胞活化的重要作用。 郑超固硕士毕业论文 2009 文献综述 14 图1-2 NF-B信号通路概况。引自/pathways/nk-kappab-signaling.jsp 1.5 靶向肿瘤血管生成的治疗性药物靶向肿瘤血管生成的治疗性药物 由于靶向肿瘤血管生成的肿瘤治疗拥有许多与传统肿瘤治疗相比的优势，比如 不产生耐药性、广谱性、药物穿透性强、可抑制肿瘤转移、安全性较高等，越来越 多的得到临床肿瘤治疗的关注。目前，在成功的临床前实验基础上，已经有超过75 种抗血管生成药物以单独或联合使用的方式进入临床试验，其中绝大部分处于或 期临床，至少12种进入或已经结束了期临床。对于抗血管生成药物在肿瘤治疗 中的发挥效应有两种理论： （1）抗肿瘤血管生成治疗通过抑制或破坏肿瘤血管生成 CD146 在肿瘤血管生成过程中的作用机制研究 15 切断肿瘤赖以生存的“生命线”，使肿瘤细胞缺氧，缺乏血液供给的营养，无法排 出代谢废物，从而达到“饿死肿瘤”的目的。（2）抗血管生成药物使肿瘤部位对于 血管生成的调节趋于平衡， 即促血管生成和抑制血管生成的信号到达平衡， 从而 “正 常化”肿瘤血管，使得药物能够通过血管快速到达肿瘤部位，因此与化疗药联用效 果较好63。这两种理论的一个共同点就是要破坏肿瘤组织中过度活跃的促血管生 成信号。 抗肿瘤血管生成治疗的策略主要是三个方面：其一，中和促血管生成因子；其 二，加入内源或者外源的血管生成抑制物；其三，靶向肿瘤组织血管内皮细胞。中 和促血管生成因子和活化血管生成抑制因子的目的是调节“血管生成开关” （angiogenic switch），而靶向肿瘤内皮细胞则是直接破坏肿瘤血管。 1