抗禽流感病毒单域抗体库的构建及抗体的筛选、表达和生物活性鉴定

目 录 摘要1 前言2 1 单域抗体研究进展.2 2 噬菌体展示技术.4 3 禽流感病毒的生物学特性及其检测.5 4 总技术路线.7 1 实验材料8 1.1 试剂、菌株及抗体.8 1.2 载体.8 2 实验方法9 2.1 羊驼的免疫.9 2.2 引物设计.9 2.3 总RNA提取与RTPCR.9 2.4 抗禽流感病毒单域抗体库的构建.10 2.5 单域抗体库的免疫亲和筛选.10 2.6 抗禽流感病毒单域抗体的构建、表达及纯化.11 2.7 抗禽流感病毒单域抗体活性鉴定.12 3 实验结果13 3.1 羊驼免疫与血清效价测定.13 3.2 总RNA提取与RTPCR.13 3.3 抗禽流感病毒单域抗体库的构建.14 3.4 神经氨酸酶（NA）的表达，纯化及复性.15 3.5 单域抗体库的富集和高亲和力单抗的筛选.15 3.6 抗禽流感病毒单域抗体（B21）序列分析.17 3.7 单域抗体（pET28a-B21）的亚克隆、表达及纯化.17 3.8 单域抗体（pET28a-B21）活性鉴定.18 4 讨论20 4.1 重链抗体的产生、应用及建立从噬菌体抗体库中筛选单域抗体技术平台的意义20 4.2 禽流感病毒单域抗体的获取及检测策略.23 4.3 单域抗体（B21）序列分析.25 4.4 单域抗体（pET28a-B21）在将来用于治疗方面的设想 .26 5 结论28 参考文献：29 附录一35 附录二36 致谢37 山西农业大学研究生毕业论文正文 抗禽流感病毒单域抗体库的构建和抗体的筛选、表达抗禽流感病毒单域抗体库的构建和抗体的筛选、表达 及生物学活性鉴定及生物学活性鉴定 摘要摘要 为建立从免疫单域抗体库中获得具有生物活性抗体的技术平台，快速、高效获得针 对不同抗原的单域抗体， 探索高灵敏度检测禽流感病毒单域抗体 （VHH） 的制备。 用 H5N1 亚型和 H5N2 亚型禽流感病毒疫苗分别免疫 B007 和 B008 两头成年羊驼三次，抽取外周 血提取 RNA，经 RT-PCR 扩增，获得 VHH 的 DNA 序列。VHH 与噬菌粒载体连接，借助大肠 杆菌 TG1 的大量扩增与辅助噬菌体 M13KO7 的辅助侵染，将 VHH 抗体表达展示在噬菌体 表面的 P蛋白上。利用神经氨酸酶（NA）作为抗原进行 5 轮富集，从随机挑选的单克 隆中筛选一株与 NA 和 H5N1 病毒亲和力高的抗体。 序列比对分析获得 VHH 抗体的序列特 征。经 pET28a 亚克隆后，获得可溶性表达 VHH，再通过 ELISA 分析抗体的生物活性及检 测 H5N1 病毒的灵敏度。 结果： 构建库容为 210 6的噬菌体单域抗体库， 从 112 株随机挑选的单克隆中筛选到抗体 B21，序列与骆驼抗体VHH抗体相符。重组抗体pET28a-B21 获得可溶性表达，表达量 达到 10 mg/ml。ELISA表明重组后抗体具有一定的生物学活性，能够检测到禽流感病毒 NA的量为 25ng。 结论： 成功建立从免疫单域抗体库中获得具有生物活性抗体的技术平台，从中快速、高效 筛选到一株抗禽流感病毒的抗体，该抗体拟实现高灵敏检测禽流感病毒。给出羊驼 （Alpaca）单域抗体所编码氨基酸的基本特征，为将来研究羊驼单域抗体氨基酸序列特 征提供依据。 关键词：羊驼；单域抗体；噬菌体抗体库；禽流感病毒；神经氨酸酶；生物活性； 1 山西农业大学研究生毕业论文正文 前言前言 1 单域抗体研究进展 1 单域抗体研究进展 一直以来， 人们对抗体IgG的认识仅限于四链结构。 1964 年首次报道缺失L链的抗体 1， 这种异常抗体的产生会导致重链疾病的发生23。 1993 年， Hamers等4在骆驼(Camel) 血清中发现天然缺失轻链的重链抗体，使人们对抗体的结构有了新的认识。骆驼血清中 有近一半的IgG由重链抗体组成，并且可以功能性的结合抗原。由此克隆构建的只含重 链可变区的抗体称为单域抗体，即VHH 抗体(variable domain of heavy chain of heavy chain antibody，VHH)，分子量仅为 15kD,可以结合一些更小的抗原表位，有更高的结 合活性。之后，同样缺失轻链的抗体新抗原受体（NARs）在鲨鱼体内发现 5。这些 使得人们对抗体有了进一步的认识，也对功能性重链抗体的研究产生浓厚的兴趣。 单域抗体在明显缺失 CH1 区和 L 链的情况下，与一般抗体相比，在残基取代和铰链 区、骨架区、互补决定区、二硫键以及胚系基因库(repertoire)方面，都有自己独特的 特征： 骆驼(Camel,llama, dromedary)IgG重链分子量由于CH1 区的缺失而减小，据分子量 的大小分IgG1，2，3 三个亚类 4，IgG1 即一般抗体IgG，由两条重链和两条轻链组成， IgG2 和IgG3 的不同主要体现在铰链区的长短上，一种是 35 个氨基酸编码的长铰链，另 一种是由 11 个氨基酸编码的短铰链（图一） 。 图一 骆驼三种不同 IgG 抗体 A IgG1, 一般抗体 B IgG2，长铰链重链抗体 C IgG3 短铰链重链抗体 Fig.1 Three kinds of IgG in camel. A IgG1, common antibody. B IgG2, long hinge heavy chain antibody. C IgG3, short hinge heavy chain chain antibody. 2 山西农业大学研究生毕业论文正文 VHH的氨基酸序列与人VH第三家族同源，明显不同之处在于FR2 与CDR区，一般抗体 VH的FR2 区有 7 个与VL连接的疏水性氨基酸残基，通常其进化是极其保守的。然而，重 链抗体中 4 个疏水性氨基酸残基发生了亲水性取代，即V37F或V37Y,G44E,L45R和W47G 6 （图二） 。 骆驼 VHH 互补决定区(CDR)在三方面不同于一般抗体 VH： VH的CDR1 区包含第 3135 位氨基酸，而VHH的范围扩大到第 2735 位，CDR1 区 残基的多样性也明显提高，该区是抗体发生亲和成熟的重要突变热点(hotspots) 7。 CDR1、CDR2 的结构偏离了人和鼠VH的规范化结构（canonical structure） ，由于 额外二硫键的存在使得结构更加可变 8。 VHH互补决定区一般长于VH。CDR1区略微延长，而CDR3区延长尤为明显，可以形成 一大而暴露的凸环。凸环中二硫键的存在，使它比较稳定。人和鼠VH的CDR3区分别由12 和9个氨基酸组成，而骆驼VHH的CDR3区一般有1618氨基酸。 对一般抗体而言，CDR3 区第 107131 残基与VL有广泛的接触，此区与抗原结合力 有关。因此，VHH的CDR3 区的延长增加了VHH的多样性，提高了与抗原结合的能力，弥补 了VL三个CDR的缺失 9。 图二 VH 和 VHH 基因序列的比较 Fig.2 Comparison of VH and VHH sequence. VHH的CDR3 区比较长，会造成结构上多变，性质不稳定，从而限制其亲和力。在其 CDR3 与CDR1(或FR2)区有额外编码Cys存在，它们折叠成内域二硫键，降低了长CDR3 环 的灵活性，稳定结构。而二硫键在人或鼠VH的CDR区上是少有的 10。研究发现6，在VHH 的CDR3 环上有二硫键高频率（约 80）出现，在IgG2型长铰链抗体上， CDR2 环上的第 50 位有二硫键存在，在IgG3 型短铰链抗体的第 33 位也有额外的二硫键的存在。 骆驼体内有9种胚系基因存在，其中5种基因编码序列与功能性有关，它们编码不 同的铰链区，与不同的亚类有关。3种基因编码产生缺失CH1区的重链抗体，在这种特殊 拼接过程中，无特殊的转录因子存在 11。两种功能性基因IGHG1A和IGHG1B可以编码产 3 山西农业大学研究生毕业论文正文 生一般抗体 12。重链抗体和一般抗体的可变区有相似的重组信号序列（RSS），说明它 们的V(D)J基因片段有相同的基因重组过程 13。 重链抗体的产生是长期进化的结果，其产生原因是否与恶劣环境有关已无证可考， 但我们可以根据现在VHH胚系基因序列从基因水平推测，在CH1上游基因突变的前提下， 功能性CH1区的翻译被终止，导致其缺失，进而与CH1区紧密联系的L链也随之发生缺失 14。由于L链的缺失，使得抗体IgG多样性受到限制，为适应机体抗外界病原体的需要， VHH在进化过程中，可以识别更小的抗原表位,晶体结构显示，VHH能够结合一般抗体 难以识别的表位，如酶的活性位点；在胚系基因重排过程中，VHH具有更为频繁的核 苷酸插入和删除，基因转换/取代；CDR1、FR2和CDR3区不同位置出现的Cys，使VHH形 成内环二硫键，并由此形成更为多样的构象；更长CDR3区骆驼CDR3区平均编码17 个氨基酸，人和鼠VH的CDR3区分别有11和9个氨基酸；体细胞高频突变过程中CDR区更 多高频热点的突变。这些都弥补了因L链的缺失，以及H-L链组合所造成的多样性减少的 缺陷 15161718，这些诸多优点在进化中保留下来，发挥抗病原体的功能性作用。 骆驼单域抗体其独特的结构和序列特征，也决定了它某些独特的理化和生物学特 性。如：分子小、结构单一；同人VH有很高的同源性；易克隆、筛选，表达量高，易纯 化；高可溶性和热稳定性；特异性强、亲和力高等。VHH抗体其独特的理化和生物学特 性使其应用领域越来越广。分子小、结构单一，可用于酶抑制剂、模拟制备肽药物、作 为细胞内抗体和生物传感器诊断用靶标试剂 19202122；免疫原性低，可用于构建免疫融 合物 23；易克隆、高表达和易纯化，易于商品化大规模生产24；可溶性和稳定性，可用 于构建多价及多功能抗体 25；特异性强、亲和力高，可用于特异性的靶标肿瘤和发现肿 瘤靶分子 2627。 2 噬菌体展示技术 2 噬菌体展示技术 McCaferty等 28在1990年首次将抗体片段基因(如ScFv或Fab基因)， 克隆到丝状噬菌 体的基因组DNA中，使抗体片段呈现于噬菌体表面，为制备人源性单抗提供了有效手段， 开创了一条简便、快速的基因工程抗体生成思路，噬菌体展示技术是单克隆技术发展史 上的里程碑。 噬菌体展示是一种基因表达产物和亲和筛选相结合的技术。 其基本原理是将目的基 因与编码噬菌体外壳蛋白的基因相连，插入到噬菌体的表达载体上，从而使多肽或蛋白 质与外壳蛋白融合表达并展示在噬菌体的表面。 被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立 的空间结构和生物活性，同时将特定分子的基因型和表型统一。利用噬菌体在大肠杆菌 4 山西农业大学研究生毕业论文正文 系统易于分离扩增， 可以通过与配体的结合选择出表达相应受体的噬菌体颗粒， 通过 “吸 附一洗脱一扩增”的富集过程，可从中筛选出特异性抗体基因，并可直接测定所展示的 多肽或蛋白质的某些生物学活性。 噬菌体展示抗体库具有很多优点：(1)可以模拟天然抗体库，不需要免疫人或动物； (2)抗体工程菌比杂交瘤稳定、易保存，适于大规模工业化生产；(3)抗体库技术直接得 到抗体的基因，便于进一步构建基因工程抗体；(4)一些难于制备的抗体，如免疫原性 弱或毒素抗原的抗体。 噬菌体展示系统包括丝状噬菌体系统，噬菌体系统，T4噬菌体系统，T7噬菌体系 统等，其中以单链丝状噬菌体系统最为常用。丝状噬菌体是一种单链DNA病毒，其中与 噬菌体展示有关的主要是次要外壳蛋白（minor coat protein）p和主要外壳蛋白 （major Coat protein）p 29。p蛋白分子量为42KD，病毒颗粒有35个拷贝，有两 个位点可供外源序列插入，即N端和近N端可伸屈臂内，当外源基因融合到p的N端时， 噬菌体仍有感染性，但若融合到后一位点则会切去N端而丧失感染性，这时就需要辅助 噬菌体如M13K07提供将单链噬菌体DNA复制并包装成完整噬菌体颗粒所需的野生型p 蛋白质。噬菌粒含有氨苄抗性基因，而M13K07 含有卡那霉素抗性基因，使被感染的细 胞能从未被感染的细胞中挑选出来。被辅助噬菌体M13K07 感染后的宿主细胞能在含有 氨苄青霉素和卡那霉素的培养基中生长，噬菌体展示系统就是基于噬菌粒和M13K07 的 相互作用之上的。p蛋白的装载能量大，甚至可以容纳50KD的外源片断；与p基因融 合后表达在噬菌体表面的抗体表现为单价，这有利于获得高亲和力的抗体。因此，目前 在噬菌体抗体库技术中，大多采用p蛋白来融合展示抗体片段。 目前，噬菌体展示技术已广泛应用于肿瘤学、免疫学、蛋白质工程和配受体研究等 领域。 3 禽流感病毒的生物学特性及其检测 3 禽流感病毒的生物学特性及其检测 1997年香港H5N1，2003年荷兰H7N7致人死亡的事件，特别是2004年后频繁出现的人 类感染以及2005年在亚洲出现的广泛流行，并在越南、泰国、柬埔寨等导致数十人死于 与H5N1感染相关的疾病 30，引起了全世界的高度关注。 禽流感病毒是由正黏病毒科流感病毒属的A型流感病毒引起的禽类疾病，根据病毒 表面血凝素(HA)的不同，可以分为16个亚型(H1H16)，根据病毒表面神经氨酸酶(NA) 的不同，可以分为9个亚型(N1N9)，因此理论上共有144种亚型组合 31。 禽流感病毒基因共编码 10 种蛋白 32（PA、PB1、PB2、HA、NA、NP、M1、M2、NS1、 5 山西农业大学研究生毕业论文正文 NS2）其中NS1、NS2 为非结构蛋白，其余为结构蛋白。结构蛋白又有糖基化和非糖基化 之分。糖基化结构蛋白为HA和NA，PA、PB1、PB2、NP、M1、M2 为非糖基化结构蛋白。神 经氨酸酶（Neuraminidase, NA）是具有催化活性的四聚体，能将唾液酸从糖蛋白和糖 脂中切开，其重要功能是使子代病毒释放出来，NA的 221、344、368 位是重要的抗原决 定簇，其主要作用是使新生病毒从细胞中释放。禽流感病毒的HA分子与宿主细胞表面含 唾液酸的黏蛋白受体相结合，通过受体介导的细胞内吞作用进入宿主细胞，形成内体 (endosomes)。HA分子构象发生改变，激活了HA2 的膜融合活性，使内涵体膜与病毒囊膜 相互靠近、融合，病毒核酸释放入细胞浆中。 进入宿主细胞核后，AIV的 8 个负链RNA 进行病毒基因组的转录、翻译、复制。NP蛋白在细胞核中与新合成的病毒RNA结合成新 的RNP，然后再进入细胞浆，靠近细胞膜，形成一个小突起，通过神经氨酸酶(NA)的介 导，突起以出芽的方式从细胞膜表面释放出来，形成一个新的病毒颗粒。 根据WHO的统计数据，自 2003 年以来，禽流感病毒已致 167 人死亡。现在，最大的 担心是禽流感病毒突变造成人与人之间的传染，从而引发严重流行。尽管禽流感问题已 引起全世界的高度重视， 但到目前为止， 还没有检测和预防禽流感病毒的有效方法。 2007 年 2 月 26 日FDA公布美国第一个审批中的由Sanofi-Aventis小组研制的禽流感疫苗， 测 试结果显示其效果不如预期的好，前景不容乐观。精确早期诊断到受禽流感（AIV）病 毒感染的禽类或人对于病毒扩散传播至关重要。传统检测AIV方法主要有病毒分离培养 和血清学诊断，但操作繁琐、诊断时间长（1 到 2 周）、结果重复性不好等，大大延缓 了病毒的控制与防治。 分子检测方法如RT-PCR可用于诊断禽流感病毒的感染和HA亚型的 鉴定 333435。另外，实时定量PCR和DNA芯片（microarray）也被用来检测流感病毒36。 然而，这些方法技术要求苛刻，样品间交叉污染造成的假阳性率也高。 利用单克隆抗体灵敏度高、特异性好的特点实现病毒的快速、早期诊断，既避免了 传统方法耗时长，稳定性差的缺点，又弥补了分子检测方法的假阳性问题 37。但传统单 克隆抗体的制备繁琐，耗时长，成本高。噬菌体表面展示技术为筛选特异性抗体提供了 新的思路，该技术可以将B细胞全套可变区基因克隆出来，将其融合到噬菌体表面蛋白 上并表达出来，避免了单克隆抗体制备过程中的种属交叉问题，直接建立了基因型与表 型的联系。而传统噬菌体表面展示筛选后表达的抗体片断，如ScFv，Fab等，但存在一 定的问题，如：由于人为将VH和VL通过接头（Linker）连接，无法形成经体内亲和力成 熟表达的天然V区，而且存在表达量低，亲和力不高，包涵体表达等问题 38。对比克隆 ScFv构建的噬菌体抗体库，VHH结构单一，天然状态下只由一条多肽链组成，只需一对 引物即可克隆出全部抗体基因，避免了因将VH和VL利用PCR连接过程中，重新组合配对 导致的天然构象的错乱， 这种不需人为改造而成的天然构象在识别抗原表位上更具有一 6 山西农业大学研究生毕业论文正文 定优势，并且存在可溶性好，表达量高等优点 31，成为了基因工程表达抗体的新方向， 也成为近年来国内外的研究热点。 综合国内外各种检测禽流感病毒方法的研究进展， 筛选抗禽流感病毒H5N1的单域抗 体的研究尚无相关报道。本项研究构建了大容量抗禽流感病毒免疫抗体库，利用NA蛋白 筛选出一株抗禽流感病毒的单域抗体，经重组后实现了抗体的高效可溶表达，并通过 ELISA鉴定了抗体的亲和活性，以及对其检测禽流感病毒灵敏度进行了探索。 本研究旨在筛选一株高灵敏度检测禽流感病毒的单克隆抗体， 同时构建大容量免疫 单域抗体库，稳定筛选针对不同病原体的单域抗体，建立高效可溶表达基因工程单域抗 体的技术平台。 4 总技术路线 4 总技术路线 7 山西农业大学研究生毕业论文正文 1 实验材料 1 实验材料 1.1 试剂、菌株及抗体 1.1 试剂、菌株及抗体 实验所用羊驼由山西农业大学动物解剖与组胚实验室提供；噬菌粒载体 pCANTAB 5E、pGEX-5P-NA 表达质粒由中国科学院生物物理研究所阎锡蕴组提供；H5N2 亚型 N28 株和 H5N1 亚型 Re1 株由北京市兽医总站馈赠；大肠杆菌 BL21（DE3）购自 Novagen 公司；辅助噬菌体 M13KO7 和菌株 TG1 购自 Stratagene 公司； RNA 抽提试剂盒、质粒小 提试剂盒、 DNA 产物纯化试剂盒和 DNA 回收试剂盒购自 QIAGEN 公司； 比重 1.0770.001 的淋巴细胞分离液购自医科院天津血研所生产；逆转录酶购自 Invitrogen 公司；纯化 mRNA 试剂盒、辣根过氧化物酶（HRP）标记 M13 噬菌体 IgG 购自 Promega 公司；限制性 内切酶与 T4连接酶购自NEB； 鼠源抗HisTag抗体和羊抗鼠FabHRP购自Sigma公司； 化学发光底物购自 PIERCE 公司。 本实验所需培养基、缓冲液的配制，PCR扩增、酶切与连接体系及反应条件，各种 感受态细胞的制备和热击转化，以及M13 辅助噬菌体的大量制备均参照分子克隆（第三 版） 39。 1.2 载体 1.2 载体 1.2.1 噬菌粒载体（pCANTAB 5E） 1.2.1 噬菌粒载体（pCANTAB 5E） pCANTAB 5E，Pharmacia 公司产品，基因图谱如附录所示，含有氨苄青霉素抗性基 因，P lac 启动子和 M13 噬菌体基因间隔区片段，可受 IPTG 诱导，在 M13K07 辅助下可 产生含单链噬菌粒基因组的噬菌体颗粒。在不含有琥珀抑制基因的菌株（如 HB2151）中 经诱导可产生可溶性蛋白。此外，还有 fd 噬菌体基因 III（gIII）序列，在 gIII 信号 肽和编码区序列之间有用于克隆 ScFv 基因的 SfiI、NotI 克隆位点、E tag 序列和琥珀 终止码 TAG。 1.2.2 pET28a(+)表达载体 1.2.2 pET28a(+)表达载体 商品化融合表达载体,使用参照 Novagen 公司的使用说明, 基因图谱如附录所示。 8 山西农业大学研究生毕业论文正文 2 实验方法 2 实验方法 2.1 羊驼的免疫 2.1 羊驼的免疫 商品化的禽流感疫苗： H5N1 亚型Re1 株， 灭活前鸡胚液血凝(HA)效价8 log2； H5N2 亚型N28 株，灭活前病毒含量10 8.0 EID50/0.2ml。使用时将两种疫苗以 1：1 的体积比混 合。 健康的成年雄性羊驼两头， B007、B008。颈部两侧淋巴结各皮下多点免疫，每隔 10 天免疫一次，共分三次。每次免疫前抽取 5 ml 外周血，离心后去沉淀收集上层血清， 4保存，待三次免疫完后，以 H5N1 作为包被抗原，通过 ELISA 来测定抗血清效价。效 价符合要求后各取外周血 10 ml（加抗凝剂） 。 2.2 引物设计 2.2 引物设计 VHBACKA4: 5CATGCCATGACCGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGA(GT)GT(GC)CAGCT3 Sfi I VHFOR36: 5GGACTAGTGCGGCCGCGTGAGGAGACGGTGACCTG3 Not I F-PRCCAMEL: 5-CCTTTCTATGCAGGCCCAGCCGGCCGCATGGCCGA(GT)GT(GC)CAGCT-3 Sfi I R-PCRCAMEL: 5-GGCCGCAAGGCCTCGGGGGCCTGAGGAGACGGTGACCTG-3 Sfi I 2.3 总 RNA 提取与 RTPCR 2.3 总 RNA 提取与 RTPCR 用红细胞裂解液裂解血细胞，离心收集白细胞。加入 1 ml Trizol，室温静置 5 min。 加入 200 l 氯仿/mlTrizol 1530 min 静置 23 min。12000 rpm，4 离心 15 min。 转移上层水相到另一新离心管内， 加入 500 l/mlTrizol 异丙醇充分混匀后静置 10 min， 12000 rpm,4 离心 10 min，弃上清。1 ml75%乙醇/mlTrizol 漂洗 RNA 沉淀 23 次， 4 ，7500 rpm 离心 5 min，弃上清。干燥 RNA 沉淀 510 min，用 DEPC 处理的超纯水 50 l 于 55温育 10 min 完全溶解 RNA。 以 RNA 为模板反转录合成 cDNA 第一链。 以 cDNA 产物为模板， 用上述引物 VHBACKA4/ VHFOR36 进行 PCR 扩增 VHH 片断。PCR 产物纯化后，再用引物 F-PRCCAMEL/ R-PCRCAMEL 9 山西农业大学研究生毕业论文正文 二次扩增后电泳分析，从凝胶中回收 VHH 片断。 2.4 抗禽流感病毒单域抗体库的构建 2.4 抗禽流感病毒单域抗体库的构建 2.4.1 单域抗体（VHH）与噬菌粒载体的酶切、连接 2.4.1 单域抗体（VHH）与噬菌粒载体的酶切、连接 回收VHH片断与pCANTAB 5E分别用Sfi I进行酶切，16连接过夜反应。 2.4.2 电穿孔转化 2.4.2 电穿孔转化 取1l连接产物加入到80 l感受态细胞TG1中，混匀，冰上30 min。加入到预冷的 电转杯中，在电压2.5 kV，电阻2000，电容25 F 的条件下进行电穿孔转化。快速加 入到920 l 2YTAG中，180 rpm，37 ，1 h。5000 g，10 min离心，适量2YT重 悬沉淀，涂于SOBAG固体培养基上，37 ，倒置培养过夜。库容计数后，刮下，分装EP 管，70 冻存。并随机挑取单菌落用于PCR检测转化阳性率。 2.5 单域抗体库的免疫亲和筛选 2.5 单域抗体库的免疫亲和筛选 2.5.1 神经氨酸酶（NA）的表达，纯化及复性 2.5.1 神经氨酸酶（NA）的表达，纯化及复性 将构建到pGEX-5P载体上的神经氨酸酶 （NA） ， 转化。 挑取阳性克隆过夜培养。 1/100 量加入500 ml LB液体培养基中，振荡培养至OD6000.6。加IPTG诱导表达5 h，10000 rpm， 10 min离心。取少量加6Loading Buffer在100 下煮5 min制样，用于SDS-PAGE电泳。 称重按每克菌体加3 ml细胞裂解液（25 mM TrisCl，1 mM EDTA,150 mM NaCl）重悬， 4 超声破碎2 h，4 ，10000 rpm离心10 min。2.5 mol/L NaCl悬起，4 ，洗涤30 min，4 ，10000 rpm离心10 min。重复上。再分别用1TritonX-100和2 M脲用同样 方法洗涤两次。取少量制样。将上纯化样品用8 M脲（内添加1 mM EDTA和25 mM DTT ）， 4 ，过夜溶解。10000 rpm，10 min离心，取上清装入透析袋内。袋外用6 M脲，4 ， 透析6 h。再分别用4 M脲、2 M脲、1 M脲和两次PBS透析各6 h，4 ，10000 rpm离心 10 min。取上清即为纯化后复性蛋白，取少量制样。 Western blotting鉴定表达NA蛋 白，SDS-PAGE凝胶电泳后，转膜至硝酸纤维素膜(NC膜)上，5脱脂奶粉封闭，加入一 抗抗HisTag抗体孵育2 h，PBST、PBS各洗3次，每次5 min，加入二抗羊抗鼠FabHRP 孵育1 h，PBST、PBS各洗3次，每次5 min，利用化学发光底物X光片曝光显影。 2.5.2 单域抗体库的富集 2.5.2 单域抗体库的富集 取转化免疫库100 l混匀，加入9.5 ml的2YT中，37 ，220 rpm，1 h。加入10 lM13辅助噬菌体，补加Amp抗生素，37 ，220 rpm，2 h。4000 g，10 min离心收集 10 山西农业大学研究生毕业论文正文 菌。重悬于10 ml 2YTAG（Amp和Kana） ，37 ，220 rpm，过夜培养。同时，将表 达的NA蛋白包被于免疫管中，4 ，过夜。4000 g，20 min离心，收集上清至干净离心 管。加入20PEG/NaCl，冰浴放置1 h。10000 g，4 离心20 min，弃上清。2BSA重 悬抗体，放于4 备用。将上免疫管中的包被液倒掉，PBS洗3次。加2BSA封闭，室温 1 h。PBS洗三次，加上2BSA重悬抗体，37 孵育2 h。PBST洗三次，PBS洗三次，每 一轮筛选都根据情况增加洗的次数。加入2.5 ml洗脱液（0.1 M GlyHCl，pH 2.2） ， 室温孵育10 min。吹打数次后吸至另一干净管内，立即用60 l 2 M Tris（pH7.4）中 和。将洗脱液加入至10 ml OD6000.3的TG1菌液中，室温静置15 min。37 ，220 rpm， 1 h。重复上加入1 lM13辅助噬菌体，补加Amp抗生素，37 ，220 rpm，2 h。最后一 轮后，按10倍、100倍和1000倍三个梯度稀释，涂于SOBAG固体培养基上，以利于以后单 克隆抗体的筛选，剩余菌液经离心后涂板，次日刮下后添加30甘油保存于70 。 每次富集后，随机挑取单克隆进行PCR鉴定，看是否阳性率提高，以此判断富集效果。 2.5.3 高亲和力 VHH 的筛选 2.5.3 高亲和力 VHH 的筛选 挑以上筛库单克隆过夜培养。菌保后，1/100于1 ml 2YT（Amp）中，培养至OD600 0.3。加入1lM13辅助噬菌体，37 ，220 rpm，2 h。4000 g，10 min离心收集菌。重 悬于10 ml 2YTAG（Amp和Kana） ，37 ，220 rpm，过夜培养。同时，用表达的NA 蛋白和H5N1病毒用包被液包被于ELISA板上，4 ，过夜。4000 g，20 min离心，收集 上清至干净离心管。加入20PEG/NaCl，冰浴放置1 h。10000 g，4 离心20 min，弃 干净上清。50 l 2BSA重悬抗体，放于4 备用。将上ELISA板中的包被液倒掉，PBS 洗3次。加1BSA封闭，室温1 h。PBS洗三次，加上50 l 2BSA重悬抗体，37 孵育 2 h。PBST和PBS各洗三次。加入50 l二抗AntiM13-HRP，37孵育40 min。PBST洗三 次，PBS洗三次。加入OPD显色底物显色，显色15 min后用2 M H2SO4终止反应，酶标仪在 OD/490 nm读数。 2.6 抗禽流感病毒单域抗体的构建、表达及纯化 2.6 抗禽流感病毒单域抗体的构建、表达及纯化 2.6.1 引物设计 2.6.1 引物设计 从上挑选出 ELISA 读值高的单克隆抗体，测序。根据测得序列，设计引物如下： F-Pet-B21:5-CGGGATCCATGGCCGAGGTCCAGCTGC-3 Bam H I R-Pet-B21:5-CCGCTCGAGTGAGGAGACGGTGACCTGGGTC-3 Xhol I 11 山西农业大学研究生毕业论文正文 2.6.2 单域抗体与载体 pET28a 的构建、表达与纯化 2.6.2 单域抗体与载体 pET28a 的构建、表达与纯化 将引物F（R）-Pet-B21 PCR扩增后的产物构建到载体pET28a上，转化。挑取阳性克 隆过夜培养。1/100量加入500 ml LB液体培养基中，振荡培养至OD6000.6。加IPTG诱导 表达5 h，10000 rpm，10 min离心。制样用于SDS-PAGE电泳和Western Blotting鉴定。 将表达pET28a-B21的抗体菌种1/1000接菌，220 rpm，37 ，过夜。1/100接500 ml 液体培养基中，振荡培养至OD6000.6。加1 mM IPTG，28 诱导过夜。5000 g，10 min 离心收菌。加入1 mg/ml溶菌酶，4 ，30 min破菌，至菌液粘稠加入5 ng/ml DNase I。 12000 g，10 min离心，沉淀碎片。上清过Ni 2+亲和柱，50 mM，100 mM，300 mM咪唑梯 度洗脱，收集300 mM咪唑洗脱在峰值的液体，然后经脱盐柱用PBS替换咪唑。 2.7 抗禽流感病毒单域抗体活性鉴定 2.7 抗禽流感病毒单域抗体活性鉴定 2.7.1 直接 ELISA 鉴定抗禽流感病毒单域抗体的活性 2.7.1 直接 ELISA 鉴定抗禽流感病毒单域抗体的活性 将H5N1 病毒和禽流感病毒NA蛋白 4 包被过夜。倒掉包被液，PBS洗 3 次，加 2 BSA封闭，室温 1 h。PBS洗三次，加上 50 l 表达的单域抗体，37孵育 2 h。PBST和 PBS各洗三次，加入 50 l鼠源anti-his的抗体，37 孵育 1h。PBST和PBS各洗三次， 加入HRP标记的羊抗鼠FabHRP，37孵育 40 min。PBST和PBS各洗三次，加入OPD显色 底物显色，显色 15 min后用 2 M H2SO4终止反应，酶标仪OD/490 nm读数。 2.7.2 直接 ELISA 鉴定单域抗体检测禽流感病毒 H5N1 的灵敏度 2.7.2 直接 ELISA 鉴定单域抗体检测禽流感病毒 H5N1 的灵敏度 将禽流感病毒 NA 蛋白按不同梯度 4 包被过夜。倒掉包被液，PBS 洗 3 次，加 2 BSA 封闭，室温 1 h。PBS 洗三次，加入 50 l 一定浓度的单域抗体，37孵育 2 h。 以下步骤同上。 12 山西农业大学研究生毕业论文正文 3 实验结果 3 实验结果 3.1 羊驼免疫与血清效价测定 3.1 羊驼免疫与血清效价测定 为使羊驼能够产生较高亲和力的抗禽流感病毒抗体， 我们用 H5N2 亚型 N28 株和 H5N1 亚 型 Re1 株疫苗各 4 ml 免疫羊驼，每次免疫前抽取外周血收集血清，以 H5N1 亚型禽流 感病毒为包被抗原，ELISA 测定效价。根据效价显示，免疫前羊驼对禽流感病毒 H5N1 的抗血清效价水平很低，三次免疫后两只羊驼效价1：16000（图一） ，达到一定的免疫 效果，适合后来试验所需。 图一 羊驼抗血清效价 Fig.1 Anti-serum valency of Alpaca. 3.2 总 RNA 提取与 RTPCR 3.2 总 RNA 提取与 RTPCR 由于单域抗体缺失轻链， 故只需一对引物即可PCR扩增出全部单域抗体可变区序列， 大大节约了时间与成本。将两头羊驼外周血混合，红细胞裂解液裂解后收集白细胞，用 Trizol 从中提取总 RNA，反转录后,用引物 VHBACKA4/ VHFOR36 来扩增 cDNA 片断，为增 加扩增出 VHH 片断的特异性，另外设计引物 F-PRCCAMEL/ R-PCRCAMEL 来扩增 PCR 产物， 得到大小约为 400 bp 的目的片断（图二） 。 13 山西农业大学研究生毕业论文正文 图二 反转录后 PCR 扩增出 VHH Fig.2 RT-PCR of VHH fragments 3.3 抗禽流感病毒单域抗体库的构建 3.3 抗禽流感病毒单域抗体库的构建 噬菌粒载体（pCANTAB 5E）与VHH片段分别经过Sfi I酶切后（图三） ，再进行连接 反应，得到目的重组质粒。为获得大库量的抗体库，利于筛选具有更高亲和力的抗体， 将重组质粒先后通过 6 次电转化， 获得库容为 210 6的噬菌体抗体库。 随机挑取其中 22 株单克隆，经菌落PCR鉴定，泳道 3，5，7，12，15，18，19，20，21 和 22 为阳性（图 四） ，阳性率为 45.5 。 图三 噬菌粒载体与 VHH 片断的酶切、连接（1）噬菌粒载体酶切 （2）T 载体酶切 VHH 片段（箭头） Fig.3 Enzyme digestion and ligation of pCANTAB 5E and VHH. (1) Enzyme digestion of phagmid. (2) Enzyme digestion of VHH fragments. 图四 抗禽流感病毒抗体库阳性率鉴定 Fig.4 Ratio of positive clones of the anti-AIV VHH immunized library. 14 山西农业大学研究生毕业论文正文 3.4 神经氨酸酶（NA）的表达，纯化及复性 3.4 神经氨酸酶（NA）的表达，纯化及复性 为了能够获得与病毒的毒力及传播密切相关的抗原，利用它筛选抗禽流感病毒特异 性抗体，我们选用构建到 pGEX-5P 载体上的重组表达的 NA 蛋白。经分析表达产物，产 物以包涵体形式存在，经纯化及透析复性后，获得可溶性 NA 蛋白（图五 a b） 。 a b 图五 NA 的表达与复性 a SDS-PAGE 电泳（1）NA 诱导表达（2）NA 复性纯化后(箭头) b Western blot（1）NA 蛋白（2）阴性对照 Fig.5 Expression and renaturation of NA. a, SDS-PAGE: （1） Induced expression of NA. (2) Renaturated NA. b, Western bolt: (1) Expression of NA. (2) Negative control. 3.5 单域抗体库的富集和高亲和力单抗的筛选 3.5 单域抗体库的富集和高亲和力单抗的筛选 为了得到高亲和力的特异性抗体，我们用复性NA蛋白作为包被抗原，从初级抗体库 中筛选禽流感病毒特异抗体，筛选过程通过增加洗脱次数来加大洗脱强度，通过产生与 输入噬菌体量之比反映富集增长量，经过五轮的有效免疫亲和筛选，由第一轮富集数 1 10 5增长到 6108，使噬菌体抗体富集增长了 6000 倍（图六） 。每次富集后，菌落PCR 鉴定阳性率随富集次数增加而提高，达到预期富集效果。经过五轮富集，从中随机挑选 29 个克隆进行PCR鉴定，阳性率达 96.6 %（图七） 。 15 山西农业大学研究生毕业论文正文 图六 抗禽流感病毒噬菌体抗体的富集 Fig.6 Enrichment numbers of each round. 图七 抗禽流感病毒抗体库富集后阳性率检测 Fig.7 Ratio of positive clones after five rounds enrichment. 五轮富集后， 按 10 倍、 100 倍和 1000 倍三个梯度稀释， 涂于 SOB-AG 固体培养基上， 37 ，过夜培养。随机挑取其中 112 株单克隆，分别制备每个克隆的噬菌体抗体。包 被 NA 蛋白和 H5N1 病毒颗粒，ELISA 分析每个噬菌体抗体的特异性，以不表达抗体 VHH 的空噬菌粒载体 PCK 作为阴性对照，从中选择 22 株 ELISA 读值高的单克隆用于重复试 验，再挑取其中高亲和力的 9 株单克隆，经过两次重复，最后选择一株具有最强活性而 表达稳定的阳性克隆 B21（图八） ，用于后来的克隆表达。 图八 随机挑取 112 个单克隆 ELISA 分析 a OPD 显色反应 b 9 株单克隆 490 nm 读值 Fig.8 Selection high affinity VHH from 112 clones. a, OPD color reaction. b, 490 nm Abs of nine clones. 16 山西农业大学研究生毕业论文正文 3.6 抗禽流感病毒单域抗体（B21）序列分析 3.6 抗禽流感病毒单域抗体（B21）序列分析 抗禽流感病毒单域抗体（B21）送往公司测序（序列见附录） ，其序列有372 bp核苷 酸,编码124个氨基酸(图九)。/blast/Blast.cgi比对， 序列与NCBI驼科动物重链抗体VHH序列相符。FR1，FR2，FR3和FR4四个骨架区分别由30， 14，32和11个氨基酸组成，三个CDR区分别由5，17和15个编码氨基酸组成。另外，FR2 区重链抗体四个标志性氨基酸分别为37F,44E，45R 和47G。在CDR3与CDR1(或FR2)区无 额外二硫键存在。 图九 B21编码氨基酸序列 Fig.9 Amino acid sequence of B21. 3.7 单域抗体（pET28a-B21）的亚克隆、表达及纯化 3.7 单域抗体（pET28a-B21）的亚克隆、表达及纯化 为了获得可溶性表达的单域抗体，从噬菌粒载体上用引物 F（R）-Pet-B21进行PCR 扩增VHH基因，PCR产物经纯化后连接T载体，热击转化。挑取PCR鉴定阳性菌落，抽提质 粒。将连接有VHH的T载体与表达载体pET28a用Bam H I/Xhol I分别进行双酶切（图十） ， 连接，热击转化大肠杆菌BL21，测序正确。 图十 pET28a及VHH酶切连接 （1）pET28a载体酶切后电泳图 （2）T载体酶切下的目的片断（箭头） Fig.10 Ligation of pET28a-B21 and VHH fragments. 1, Enzyme digestion of pET28a. 2, Enzyme digestion of VHH fragments. 17 山西农业大学研究生毕业论文正文 pET28-B21 通过IPTG诱导在大肠杆菌内得到大量可溶性表达,表达后分子量大约为 17 kD（图十一） 。溶菌酶破菌后，离心收集上清液。上清过Ni 2+柱经咪唑梯度洗脱，再 过脱盐柱除去咪唑， 获得纯化抗体。 无需优化任何条件， 重组抗体表达量可达到 10 mg/L。 图十一 pET28aB21 可溶性表达鉴定 a SDS-PAGE 电泳鉴定 VHH 诱导表达：1 未经 IPTG 诱导；2 IPTG 诱导。 b Western-blot 分析蛋白 pET28aB21 的表达：1 目的蛋白表达； 2 二抗交叉。 c pET28aB21 蛋白的纯化：1 IPTG 诱导；2 未经 IPTG 诱导；3 纯化后蛋白。 Fig.11 Soluble expression of pET28a-B21. a, SDS-PAGE: 1 uninduced, 2 induced. b, Western blot: 1 expression of pET28a-B21;2 negative control. c, Purification of pET28a-B21: 1 uninduced;2 induced;3 purified. 3.8 单域抗体（pET28a-B21）活性鉴定 3.8 单域抗体（pET28a-B21）活性鉴定 为了检测表达 VHH 是否有生物活性，包被 NA 蛋白和 H5N1 病毒浓度为 5 g/ml，将 重组表达 pET28a-B21 梯度稀释，以无关抗原作为对照，直接 ELISA 检测单域抗体活性。 检测结果显示，pET28a-B21 与 NA 蛋白（图十二 a）和 H5N1 病毒（图十二 b）在浓度分 别为 15 g/ml 和 30 g/ml 的情况下还能结合，表明重组 pET28a-B21 与 NA 蛋白和 H5N1 病毒都有较高的结合活性。 18 山西农业大学研究生毕业论文正文 a a b b 图十二 pET28a-B21 活性检测 a 与 NA 的结合活性 b 与 H5N1 病毒的结合活性 Fig.12 Binding ability of pET28a-B21. a, Binding ability of pET28a-B21 for detection of NA. b, Binding ability of pET28a-B21for detection of H5N1 为了鉴定 pET28a-B21 检测禽流感病毒的灵敏度，我们利用直接 ELISA 通过包被不 同浓度的禽流感病毒 NA 蛋白，以无关抗原作为对照，加入浓度为 200g/ml 的单域抗体 来检测，以此间接反应检测禽流感病毒的灵敏度。结果显示（图十三），可检测到 NA 蛋白的浓度为 500ng/ml,故最低检测到禽流感病毒的量为 25ng。 图十三 pET28a-B21 检测 NA 的灵敏度 Fig.13 Sensitivity of pET281-B21 for detection NA. 19 山西农业大学研究生毕业论文正文 4 讨论 4 讨论 4.1 重链抗体的产生、 应用及建立从噬菌体抗体库中筛选单域抗体技术平 台的意义 4.1 重链抗体的产生、 应用及建立从噬菌体抗体库中筛选单域抗体技术平 台的意义 化石记录显示，部分驼科动物在 1.1 亿年前起源于北美洲北部。随着气候变迁，一 部分向亚非大陆迁徙，进化为现在单峰（Dromedary）和双峰骆驼(Camel)，另一部分迁 往南美大陆，进化为美洲驼属，如大羊驼（Llama）、羊驼(A