糖抗原sTn及其抗体3P9在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制_第1页
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密级密级: 博士学位论文博士学位论文 糖抗原糖抗原 sTn 及其及其抗体抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中在肿瘤诊断和靶向治疗中的的作用与作用与机机 制制 作者姓名作者姓名: 安云鹤安云鹤 指导教师指导教师: 阎锡蕴阎锡蕴 研究员研究员 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 学位类别学位类别: 博士博士 学科专业学科专业: 细胞生物学细胞生物学 培养单位培养单位: 中国科学院生物物理研究所中国科学院生物物理研究所 2012 年年 4 月月 II A novel target sTn and its antibody play a key role in tumor detection and therapy By Yunhe An A Dissertation Submitted to Graduate University of Chinese Academy of Sciences In partial fulfillment of the requirement For the degree of Doctor of Cell Biology Institute of Biophysics, Chinese Academy of Sciences April, 2012 I 目录目录 摘要摘要 IIII AbstractAbstract IVIV 文献综述文献综述: :肿瘤相关肿瘤相关糖糖抗原抗原与与免疫治疗免疫治疗 . . 1 1 粘蛋白相关的粘蛋白相关的肿瘤肿瘤糖抗原糖抗原与免疫治疗与免疫治疗 1 1 lewislewis 血型抗原相关的肿瘤糖抗原血型抗原相关的肿瘤糖抗原与免疫治疗与免疫治疗 5 5 鞘糖脂鞘糖脂与免疫治疗与免疫治疗 8 8 唾液酸化的鞘糖脂唾液酸化的鞘糖脂与免疫治疗与免疫治疗 9 9 混杂糖抗原混杂糖抗原与免疫治疗与免疫治疗 1212 可溶性肿瘤相关糖抗原可溶性肿瘤相关糖抗原 1 12 2 肿瘤相关糖抗原肿瘤相关糖抗原 sTnsTn. .1414 研究内容研究内容 1616 第一部分第一部分 糖抗原糖抗原 sTnsTn 及其抗体及其抗体的制备的制备 1616 一、材料与方法一、材料与方法 1717 二、实验结果二、实验结果 2 20 0 三、讨论三、讨论 2 24 4 第二部分第二部分 糖抗原糖抗原 sTnsTn 及其抗体及其抗体 3P93P9 在肿瘤治疗中的作用及机制在肿瘤治疗中的作用及机制 2525 一、材料与方法一、材料与方法 2626 二、实验结果二、实验结果 3232 三、讨论三、讨论 4242 第第三三部分部分 糖抗原糖抗原 sTnsTn 及其抗体及其抗体 3P93P9 在在肿瘤肿瘤检测中的应用检测中的应用 4444 一、材料与方法一、材料与方法 4646 二、实验结果二、实验结果 4 48 8 三、讨论三、讨论 5 57 7 参考文献参考文献 5 59 9 在读期间已发表和待发表文章在读期间已发表和待发表文章 7070 致致 谢谢 7171 安云鹤博士学位论文2012 摘要 II 摘要摘要 近些年,肿瘤糖生物学研究逐渐成为肿瘤诊断与治疗领域的新热点。许多研 究证明肿瘤的发生发展与糖类分子密切相关。因此,寻找靶向肿瘤相关糖抗原的 免疫治疗试剂和方法成为众多研究者的目标。同时,关于肿瘤相关糖抗原的血清 学研究也成为人们研究的热点之一。 我们实验室利用抗体差异筛选技术,通过肿瘤细胞和正常/肿瘤组织差异筛 选获得一株单克隆抗体,命名为 3P9(IgM/)。我们用糖生物学和糖芯片的方 法研究, 发现 3P9 抗体识别的抗原决定簇不是蛋白质的某一个区域, 而是与蛋白 质骨架相连的糖链结构,即涎酸化的 Tn 抗原(sialyl-Tn,简称 sTn)。sTn 是一 个重要的肿瘤相关糖抗原,在上皮来源的肿瘤组织中广泛表达并参与肿瘤发生、 发展和转移。 那么我们所产生的靶向糖抗原 sTn 的抗体 3P9 是否具有抑制肿瘤的 生物学活性呢?我们首先在体外利用两对细胞系,结直肠癌细胞系 LSCsTn+和 LSBsTn-和乳腺癌细胞系 MDA-MB-231sTn+和 MDA-MB-231sTn-,研究了此抗体的 功能。研究发现此抗体能显著抑制 sTn 阳性细胞的生长和迁移,并能够诱导 sTn 阳性细胞的凋亡,而对 sTn 阴性细胞没有任何作用。体内试验也表明,3P9 能显 著抑制荷 sTn 阳性肿瘤的小鼠的肿瘤生长。 将 3P9 治疗后的小鼠肿瘤切片, 与未 治疗(IgM 对照)的小鼠肿瘤切片比较发现,治疗组凋亡细胞的数量较未治疗组 显著增多, 而血管密度较未治疗组显著减少。 研究还发现 3P9 能够介导显著的细 胞毒作用。我们的初步研究表明,肿瘤细胞的凋亡很可能是由于抗体 3P9 与 sTn 化糖蛋白相互作用, 激活了 NFB 信号通路,从而引起凋亡蛋白 caspase3 的激活 和抗凋亡蛋白 Bcl-2 的下调。但具体的信号转导机制如 3P9 与蛋白表面的糖抗原 sTn 结合后,究竟是通过哪些接头分子最终激活了 NFB 信号通路,从而开启凋 亡机制还需要进一步研究。这是我们首次报道抗糖抗原 sTn 的抗体具有治疗作 用,不仅为 sTn 的疫苗治疗研究提供了可行性依据,而且为治疗性抗体的研发提 供了新的选择靶标。 同时我们为结直肠癌,子宫内膜癌等提供了一种新的免疫诊断试剂。为了解 3P9 在肿瘤组织中的敏感性和特异性,我们收集了 737 例组织,其中包括 18 种 常见肿瘤类型共 573 例肿瘤组织和 164 例相应的正常组织, 通过免疫组化的方法 筛查了 3P9 的识别模式。结果表明,3P9 在结直肠癌中的敏感性最高(84%), 其次是子宫内膜癌(80%)。我们通过对 111 例子宫内膜癌研究发现,抗体 3P9 所识别的抗原 sTn 并非在所有子宫内膜癌中高表达。sTn 只在 I 型子宫内膜癌中 高表达(80%),而在 II 型子宫内膜癌中表达率很低(45%),几乎与 sTn 在正 常组织中的表达率(31%)相近(p0.05)。我们首次报道了 sTn 与子宫内膜癌 的临床病理分型有关,这不仅为 I 型子宫内膜癌的诊断提供了新的标志分子和诊 断试剂,而且对两种类型子宫内膜癌的区别治疗具有指导意义。其次,我们还发 现 3P9 能够区分 I 型子宫内膜癌的癌前病变,即非典型增生与 I 型子宫内膜癌。 sTn 在非典型增生组织中的表达 (44%) 远远低于 I 型子宫内膜癌 (80%)(p40U/ml。除此外,一般 当 CA125 的水平高于 35U/ml,即预示着肿瘤的发生160。卵巢癌病人血清中 CA125 水平明显升高,手术和化疗后期水平很快下降。当复发时,在临床确诊 前几个月便出现 CA125 的增高,尤其卵巢癌转移患者的血清水平更明显高于正 常值161。 6.3 CA153 CA153 是一种乳腺癌相关抗原, 对乳腺癌的诊断和术后随访有一定的价值。 乳腺癌常有 CA153 升高,在乳腺癌初期敏感性较低,约 60%。但在转移性乳腺 癌中阳性率可达 80%。CA153 常用来作为乳腺癌辅助诊断指标,也是用于术后 随访,监测肿瘤复发,转移的指标。患者血清 CA153 水平的变化与乳腺癌病情 变化平行,是复发和转移的重要信号,而且这种信号的发出要比临床症状的出现 和其他检测手段如 B 超, X 线或 CT 等检出复发和转移的时间要早。 CA153 水平 超过 40U/ml 时,即预示着患者存在术后局部区域复发或远处转移,其敏感性超 过 90%。此外,CA153 水平增高的乳腺癌患者发生转移的时间较 CA153 正常的 患者要早很多。因此,CA153 具有对乳腺癌转移起监视的作用,如其血清水平 持续升高,则应开始或加强化疗,放疗或改用内分泌治疗等162。 6.4 CA72-4 CA72-4 又被称作肿瘤相关糖抗原 72(TAG-72) ,即 sTn 化的粘蛋白。它通 常被用于胃肠道肿瘤和妇科肿瘤等的标记物,在结肠癌和胃癌中的敏感性为 40%, 而在卵巢癌中, 敏感性为 50%以上, 特异性均在 95%以上163。 由于 CA72-4 在肿瘤诊断过程中具有较高的特异性, 因此一直受到血清肿瘤标记物研究领域的 重视,常常被用作联合检测的指标。 糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制 14 第第二二部分部分 肿瘤相关糖抗原肿瘤相关糖抗原 sTn Sialyl-Tn(sTn)是 O-连接粘蛋白糖基化过程中糖链合成不完全出现的二糖 结构,是肿瘤相关糖抗原的一种。它在正常组织中分布相当局限,而在上皮来源 恶性肿瘤,尤其是腺癌组织中分布广泛。sTn 糖抗原主要是通过影响粘附分子的 功能而导致细胞与细胞、细胞与基质之间相互作用的改变,进而影响到肿瘤细胞 与内皮细胞的粘附、侵袭和转移,从而增加肿瘤的不良预后。抗 sTn 抗原单克隆 抗体在肿瘤显像、靶向药物治疗、疫苗研发等方面有重大意义。 1. sTn的结构与合成的结构与合成 Sialyl-Tn抗原(Neu5Ac2-6GalNAc1-O- Ser /Thr) ,也被称为CD175s或 sTn, 是唾液酸化的粘蛋白型糖抗原, 产生于细胞表面粘蛋白的异常糖基化164。 粘蛋白是细胞表面的或分泌的具有高度O-糖基化修饰的糖蛋白。在粘蛋白中, O-聚糖是通过N-乙酰氨基半乳糖与丝氨酸或苏氨酸之间形成连接, 该结构被称 为粘蛋白型O-聚糖。 细胞恶变的过程中常常伴随着粘蛋白型O-聚糖结构和数量上 的改变,形成肿瘤特异聚糖结构,如肿瘤Tn抗原和T抗原等。Tn抗原(GalNAc 1 -O-Ser/Thr)是最简单的粘蛋白型O-聚糖。sTn抗原是唾液酸化的Tn抗原,即 Neu5Ac2-6GalNAc1-O- Ser /Thr,其合成依赖于2,6唾液酸转移酶的催化。 2,6唾液酸转移酶负责将一个唾液酸残基从CMP-Neu5Ac向GalNAc -O-Ser/Thr 聚糖连接的唾液酸化,同时意味着该O糖链结构延伸的终止165。研究表明, 在肿瘤发展的不同阶段2,6唾液酸转移酶的表达是受调控的,与肿瘤的恶性程 度有相关性。据报道,在乳腺癌细胞系中导入2,6唾液酸转移酶发现细胞生长 缓慢、迁移能力上升、细胞的粘附能力降低。由此表明通过调控2,6唾液酸转 移酶可直接诱导sTn糖链结构的产生,进而引发乳腺癌细胞生长、粘附、迁移等 生物学行为的改变166, 167。 2. sTn的分布的分布 sTn抗原在正常组织中分布相当局限,而在上皮性恶性肿瘤,尤其是腺癌组 织中分布广泛。因高表达于胃癌168、结直肠癌169、卵巢癌170、乳腺癌 171、胰腺癌172,但在各自相对应的正常组织中不表达而备受关注。另外。 其表达情况与肿瘤的侵袭性和不良预后高度相关。在某些腺癌中,sTn在患者血 清和组织中的高表达,甚至被认为是肿瘤不良预后的独立预测因子,如胃癌 173、结直肠癌169、乳腺癌174。研究发现,糖抗原sTn也高表达于消化道 肿瘤的癌前病变中,例如肠上皮化生175、胰腺上皮内瘤变172、溃疡性结肠 炎176和腺瘤性息肉177。这进一步证实了sTn抗原在肿瘤发生发展的过程中 起着重要的作用。 3. sTn的生物学功能的生物学功能 sTn抗原是通过何种机制在肿瘤发生发展中发挥作用呢?这也是近年来肿瘤 相关糖抗原sTn研究的热点所在。有研究报道,sTn阳性的粘蛋白会抑制NK细胞的 细胞毒作用,而sTn阴性的粘蛋白则不会抑制NK细胞的活性178。而且,sTn通 安云鹤博士学位论文2012 文献综述 15 过与表达在天然免疫细胞上的唾液酸结合性免疫球蛋白样凝集素(siglecs)相 互作用,从而传递免疫相关的抑制信号179。另外,有研究表明,在小鼠肿瘤 模型中,表达sTn的粘蛋白与小鼠体内的自身抗体结合可以促进血管内皮生成因 子(VEGF)的分泌,从而促进血管生成,加速肿瘤进展180。此外,Inaba等研 究发现结肠癌细胞表面粘蛋白的畸形糖基化在肿瘤微环境中环氧化酶2(COX-2) 的早期诱导中有重要作用。COX-2是在炎症部位表达的一种诱导酶,近来因其在 多种肿瘤中表现出了显著的病理生理意义而备受瞩目。COX-2的高表达和肿瘤细 胞的凋亡、生长、转移和血管新生密切相关181。而且,据报道,肿瘤细胞中 COX-2的异常增多减少了CD8+T淋巴细胞向癌细胞巢的浸润,而sTn抗原的高表达 和这一过程表现出了高度相关性182。另外,有报道,肿瘤细胞表面畸形糖基 化导致肿瘤相关糖抗原的异常表达不仅降低了肿瘤细胞之间以及细胞和基质之 间的粘附能力而且抑制了T淋巴细胞和抗原提呈细胞的功能。因此,研究推测肿 瘤相关糖抗原sTn的异常增多可能是肿瘤免疫逃逸过程中的又一新机制。 4. 可溶性可溶性sTn在临床诊断中的意义在临床诊断中的意义 血清sTn即CA72-4,属于粘蛋白类癌胚抗原,分子量为220-400kD。国内外研 究表明,血清CA72-4对胃肠道和卵巢癌是很好的标志物,对乳腺癌也有一定的阳 性检出率。早在1991年,Kobayashi H等就已报道sTn抗原在卵巢恶性肿瘤患者血 清中含量显著高于良性肿瘤患者及正常人血清中的含量, 它不仅可以作为卵巢癌 的一个循环肿瘤标志物并被认为是患者不良预后的独立预测因子183。血清 CA72-4作为检测乳腺癌复发和转移效果较好184,可作为预警指标之一,定期 检测血清CA72-4水平将有助于提高乳腺癌的早期诊断率,预测复发转移水平。 基于以上研究,靶向肿瘤相关糖抗原的免疫学研究逐渐兴起,尤其是肿瘤免 疫治疗中疫苗的研究。 目前抗肿瘤糖疫苗的研究思路主要是寻找合适的糖抗原与 大分子载体连接或加入免疫佐剂。 如将肿瘤相关糖抗原与蛋白载体共价结合制备 糖结合物疫苗,或与 T 细胞表位或免疫刺激表位连接制备多组分糖疫苗。基于肿 瘤相关糖抗原 sTn 的疫苗研究在肿瘤免疫治疗上已经取得了重要进展, 而且有些 已经进入了临床研究,包括临床期试验,其中在乳腺癌中的研究最深入171。 可以相信抗肿瘤糖疫苗应用于肿瘤的临床治疗指日可待。 糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制 16 研究内容研究内容 第一部分第一部分 糖抗原糖抗原 sTn 及其抗体的制备及其抗体的制备 sTn 是一个粘蛋白型的二糖结构,它是在 Tn 抗原的基础上由于唾液酸的加 入而使糖链合成提早终止而形成的。sTn 抗原在肿瘤组织中的表达异常增多,而 在正常组织中,几乎检测不到这种抗原的存在,因此,sTn 抗原成为肿瘤免疫治 疗领域的研究热点。目前,人们热衷于将 sTn 作为一个半抗原,与其他大分子载 体连接或加入免疫佐剂来开发肿瘤糖疫苗。 这种主动免疫治疗的效果最终取决于 其所产生的抗体所发挥的功能。因此被动免疫治疗的研究,即将抗体直接注入体 内,观察抗体的疗效是非常必要的。 为了极大可能地获得具有功能性的抗肿瘤抗体,我们实验室用结直肠癌细胞 系 SW1116 为免疫原,而不是化学合成的或者工程表达的免疫原去免疫小鼠。通 过杂交瘤技术和细胞, 组织的差异筛选得到一株对肿瘤细胞和组织具有高亲和力 的鼠源单克隆抗体,命名为 3P9。经鉴定 mAb 3P9 所识别的抗原为糖蛋白,其表 位即 sTn。后续的研究表明,mAb 3P9 具有抑制肿瘤生长的作用。 在建立基于 sTn 的肿瘤血清标记物的新的检测系统时,为了得到高效的配对 抗体,我们利用牛颌下腺粘蛋白(BSM)又产生了一组新的抗 sTn 的抗体。BSM 是高度糖基化的粘蛋白,其糖基的组成 95%以上都是 sTn 抗原和 Tn 抗原。BSM 经常被用来制备抗 sTn 的抗体,其去唾液酸的形式常被用来制备抗 Tn 抗原的抗 体。在此次免疫筛选中,我们得到了四株抗 sTn 的抗体,分别命名为 3P1,3P2, 3P3 和 3P6。这四株抗体在体外均不能抑制肿瘤细胞的生长和迁移,因此仅被用 来建立新的检测系统。 本论文的第一部分仅对 3P9 抗体和抗 BSM 的一组抗体的制备,筛选和抗原 鉴定做一个介绍, 而对 3P9 抗体的抑瘤机制研究和基于这些抗体的肿瘤检测方面 的研究分别在论文的第二部分和第三部分做详细介绍。 安云鹤博士学位论文2012 研究内容 17 一、一、材料与方法材料与方法 (一) 、实验材料(一) 、实验材料 1. 抗原、细胞系、组织、实验动物抗原、细胞系、组织、实验动物 牛颌下腺粘蛋白(BSM)购自 Sigma;人结直肠癌细胞 SW1116 为本实验室 保存;小鼠骨髓瘤细胞 Sp2/0 购自 ATCC;肿瘤组织和正常组织来自中国医学科 学院肿瘤医院肿瘤研究所分子肿瘤国家重点实验室,中国人民解放军 301 和 306 医院,北京法医研究所;BALB/c 裸鼠购自北京实验动物中心。 2. 主要试剂主要试剂 RPMI 1640 培养基,HAT 培养基,HT 培养基,小牛血清,聚乙二醇(PEG) 均购自 GIBCO。 (二) 、实验方法(二) 、实验方法 1. 抗体的制备抗体的制备 选择 6-8 周龄的 BALB/c 小鼠,分别以结直肠癌细胞 SW1116 和牛颌下腺粘 蛋白(BSM)作为免疫原免疫小鼠。每三周加强免疫一次,加强三次。然后取小 鼠脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合以获得大量抗体。 详细的操作步骤请见参考文献 185。 2. 冰冻切片、冰冻切片、石蜡切片的制备与免疫组化染色石蜡切片的制备与免疫组化染色 2.1 玻片的处理玻片的处理 切片前对洗净的载玻片用粘附剂进行处理防止组织掉片。洗净的载玻片于 1:50 丙酮稀释的 APES 中浸泡 10-30s,取出放入丙酮中 10-20s,涮去未与载玻 片结合的 APES,取出晾干备用。 2.2 组织的准备组织的准备 1新鲜组织用 OCT 包埋,置-70 C 冰冻用于冰冻切片。 2. 组织用 4多聚甲醛固定 12-24h, 用 70%乙醇溶液冲洗, 再由 70%, 80%, 90%, 95%,95%,100%逐级脱水 35 min,浸入 1:1 乙醇/二甲苯溶液 5 min,取出再浸 入二甲苯各 20 min 透明 2 次;迅速投入已热熔的石蜡(溶点 56-58 C)中 4 h; 取出浸蜡组织移入含熔蜡的纸盒中,切面朝下,待石蜡表面凝结后包埋,浸入冷 水中凝固。 2.3 切片切片 1冰冻切片:用 Leica 冰冻切片机将组织切成 8m 切片粘附与载玻片上。4oC 糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制 18 丙酮固定 10min,室温晾干后-70 oC 保存。 2. 石蜡切片: 用 Leica 石蜡切片机将石蜡包埋组织切成 5m 切片, 在载玻片上 42oC 展片,自然干燥后 50 C 烤片 6h。 2.4 免疫组化免疫组化 冰冻切片 1. 取出片子,室温晾干 2h。PBS 洗三次,每次 5min。 2. 0.3%过氧化氢处理 30 分钟,消除内源性过氧化物酶的活性,PBS 洗三次。 3. 5%的正常血清封闭 1h。 4. 加入 PBS 稀释的一抗,37oC 孵育 2h,PBS 洗 1 次。 5. HRP 标记的二抗 37oC 孵育 1h,PBS 洗三次。 6. 现配的 DAB 显色 2-7min,苏木素复染。 7. 逐级脱水:50708090100100乙醇二甲苯,晾干,中性树脂封 片。 8. 显微成像系统拍片。 石蜡切片 1取出片子,入二甲苯溶液脱蜡三次,每次 5min。再入无水乙醇9580 70和蒸馏水中水化。 2 0.3%过氧化氢处理 30 分钟,消除内源性过氧化物酶的活性,PBS 洗三次。 30.01M pH6.0 柠檬酸缓冲液 100oC 水浴 30min 抗原修复。 余下步骤同冰冻切片 3-8 3. 酶联免疫吸附检测(酶联免疫吸附检测(ELISA) 1. 抗原(BSM)用 9.6 的碳酸钠缓冲液稀释至 1g/ml,50l/孔加入 96 孔板, 4C 包被过夜;或细胞用 4%多聚甲醛固定后,晾干。 2. 每孔加入 200l 2%BSA,室温封闭 2h。 3. 加入一抗室温孵育 2h。 4. 0.05%Tween-20/PBS (PBST) 和 PBS 分别洗板三次, 加辣根过氧化物酶 (HRP) 标记的抗体,室温孵育 1h。 5. 洗去抗体,用 TMB 底物(200ng/ml TMB,0.03%H2O2,pH4.5)显色,硫酸 终止,450nm 读数。 4. 竞争抑制竞争抑制 ELISA 1抗原包被和封闭同上。 2纯化的 3P9 抗体倍比系列稀释, 与 sTn 特异性抗体等体积混合, 37孵 育 1h。 3混合抗体作为一抗加入抗原包被的酶标板 37孵育 1.5h,PBS 洗涤 3 次。 4加入相应二抗,显色同上。 安云鹤博士学位论文2012 研究内容 19 计算竞争抑制率。抑制率(%) =(1试验组吸收值/对照组吸收值)100% 5. 细胞免疫荧光细胞免疫荧光 1. 贴壁细胞生长至 70-80汇片(confluence) ,吸去培养基,PBS 洗三次,加入 预冷的 1:1 甲醇/丙酮固定 1min。 2. PBS 洗去固定液,加入 5羊血清 37C 封闭 30min。 3. 加入一抗 37C 孵育 1h,PBS 洗去抗体。 4. 加入 PBS 稀释的荧光标记二抗, 避光 37C 孵育 45min, PBS 洗去未结合的抗 体。 5. 激光共聚焦荧光显微镜下观察拍照。 6. FACS 1. 收集细胞,0.3%BSA/PBS 洗细胞三次,加入抗体,以 mIgG 作为空白对照。 4C 孵育 45min。 2. 0.3%BSA/PBS 洗去抗体,所有样品加入荧光二抗,4C 避光孵育 30min。 3. 洗去二抗,细胞重悬于 PBS。FACSCalibur 检测样品荧光。 7. 抗体的亚类鉴定抗体的亚类鉴定 1. 分别用抗小鼠 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM, IgA 及和的大鼠抗体包被 96 孔酶标板,每种设三孔平行,1 % BSA 封闭,4C 过夜。 2. 分别加入 AA1、AA2、AA3、AA4、AA5 和 AA7 的杂交瘤培养上清,室温 孵育 1 h,PBS 洗涤。 3. 加入 HRP-羊抗小鼠血清,室温孵育 1 h,PBS 洗涤。 4. 加入底物 TMB 显色,用酶标仪测定各孔在 450 nm 处的光吸收值,计算平 行孔平均值,根据读数最高的孔所包被的抗抗体类型判断其亚类/亚型。 8. 点杂交(点杂交(Dot Blot) 1. 直接将样品点在 NC 膜上,晾干后 5牛奶室温封闭 2h。 2. 加入 5牛奶的稀释一抗,室温孵育 2h,PBST 洗 3 次,PBS 洗 1 次,每次 5min。 3. 加入 HRP 标记二抗室温孵育 1h,同上洗去未结合抗体。用 Super Signal West Dura 化学发光显色。 糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制 20 二、二、实实验结果验结果 1. 3P93P9 抗体的制备和筛选抗体的制备和筛选 我们用结直肠癌细胞系 SW1116 作为抗原免疫小鼠,得到大量的杂交瘤细胞。 经过几轮细胞 ELISA 的筛选, 我们得到 20 株对 SW1116 具有很强的稳定结合能力 的杂交瘤细胞。接下来,我们用免疫组化的方法对这 20 株杂交瘤细胞进行差异 筛选,得到三株特异结合结直肠癌组织,而不结合正常组织的杂交瘤细胞。其中 单克隆抗体 3P9(IgM/)稳定表达并具有较高的亲和力,因此选择抗体 3P9 做 进一步研究。 2. 3P93P9 抗体的抗体的抗原鉴定抗原鉴定 在筛选过程中,我们发现 3P9 所识别的抗原主要位于肿瘤的腺上皮细胞,有 些存在于腺腔分泌物。考虑到在胃肠道组织中,腺上皮细胞分泌表达的产物主要 是粘蛋白,而粘蛋白是高度糖基化的,并且在肿瘤发生过程中常常伴随蛋白表面 糖链修饰的改变, 因此我们首先分析了抗体 3P9 所识别的抗原是位于糖链还是某 个蛋白区段。我们在相同的组织上分别用糖染色的方法(PAS)和 3P9 抗体进行 染色,比较发现二者的染色模式几乎相同,均在腺上皮细胞膜,细胞质以及腺腔 内有强着色。当用 2%过碘酸对粘蛋白糖链进行氧化处理后发现,3P9 抗体失去结 合结直肠癌组织的能力(图 1-1 A-C)。此结果说明 3P9 所识别的抗原很可能是 糖链结构,对糖链结构的改变会直接影响 3P9 抗体的识别能力。 粘蛋白上的抗原主要有三种,Tn 抗原,sTn 抗原和 TF 抗原。为了弄清 3P9 所识别抗原的结构,我们用神经氨酸酶处理牛颌下腺粘蛋白(BSM)观察 3P9 的 结合情况。BSM 是一个广泛使用的高度糖基化的粘蛋白,而神经氨酸酶可以将位 于末端的唾液酸从糖蛋白骨架上消化下来。我们发现经神经氨酸酶消化后,3P9 与 BSM 的结合信号明显降低(图 1-1 D),说明唾液酸是 3P9 的组成成分。 至此,我们猜测 3P9 所识别的抗原很可能是 sTn。为了验证这一点,我们用 抗体竞争抑制实验(图 1-1 E)和免疫荧光(图 1-1 F)进一步鉴定了 3P9 所识 别的抗原。 我们发现 3P9 抗体对 sTn 抗原的特异性抗体 TKH2 和商品化抗体 B72.3 与 BSM 的结合能力产生明显的抑制作用。并且 3P9 可以结合 sTn 阳性的 LSC sTn+细 胞,而对 sTn 阴性的 LSB sTn-细胞没有结合。这些结果都说明,mAb 3P9 所识别的 抗原是糖蛋白,其表位是一个二糖结构,即 sTn。 安云鹤博士学位论文2012 研究内容 21 图 1-1:mAb 3P9所识别抗原的鉴定。A-C,为同一个结肠癌组织。A,肿瘤组织的糖染色。 B,3P9抗体染色。C,肿瘤组织经过碘酸氧化处理后在进行3P9抗体染色。D,BSM用神 经氨酸酶(0.02U/ng),胰蛋白酶(0.25%)或 BSA(2%)37C 处理 30 分钟后,分别与 3P9 抗体进行孵育。E,3P9 与抗 sTn 的抗体 TKH2 和 B72.3 共孵育,观察抗体的竞争抑 制情况。F,3P9 抗体与结直肠癌细胞 LSCsTn+和 LSBsTn-的结合情况。 3. 一组识别糖表位一组识别糖表位 sTn 的单克隆抗体的制备的单克隆抗体的制备、筛选筛选和鉴定和鉴定 为获得不同的识别 sTn 的单克隆抗体, 我们用富含 sTn 的抗原 BSM 去免疫小 鼠,通过杂交瘤技术进行单克隆抗体的制备。BSM 即牛颌下腺粘蛋白,是一种高 度糖基化的粘蛋白,其表面 95%以上都是 sTn 抗原。BSM 常被用于免疫产生识别 糖表位的抗体。免疫后的 BALB/c 小鼠脾细胞与 SP2/0 骨髓瘤细胞融合构建杂交 瘤细胞,经过三轮 ELISA 筛选,得到八株高亲和力的 BSM 单克隆抗体,分别命 名为 3P1、3P2、3P3、3P4、3P5、3P6、3P7 和 3P8。这八株抗体均与 BSM 结合 (图 1-2 A)。经小鼠抗体分型 ELISA 试剂盒鉴定发现 3P4 和 3P5 是 IgM/型抗 体,其它都是 IgG/型抗体(图 1-2 B)。然后我们用糖的氧化剂过碘酸和胰酶 分别处理 BSM,发现 3P4 和 3P5 抗体对用胰酶消化过的 BSM 结合能力下降,而对 过碘酸消化过的 BSM 结合能力没有变化,这说明 3P4 和 3P5 所识别的位点位于 BSM 的粘蛋白上,而非糖链。其它六株抗体对 BSM 的结合能力均明显受到过碘酸 氧化的影响,说明这六株抗体的识别位点位于 BSM 的糖链(图 1-3 A)。其中抗 体 3P1 和 3P6 对 BSM 的结合能力也大大受到胰酶消化的影响(p0.05)。第 30 天处死小鼠并剥离肿 瘤组织称重,发现 sTn 阳性肿瘤治疗组与对照组差异明显,而 sTn 阴性治疗组与 糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制 36 mIgM 对照组无明显差异(图 2-5 B)。同时对肿瘤组织进行冰冻切片,用抗体 3P9 检测这些组织中 sTn 的表达水平。结果表明,在 sTn 阳性肿瘤的荷瘤鼠中, 其组织切片中 sTn 的表达量仍然很高, 而在 sTn 阴性的荷瘤鼠组织中没有 sTn 的 表达(图 2-5 C)。这些结果表明,3P9 抗体在小鼠体内亦能显著抑制 sTn 阳性 结直肠癌的生长。 图 2-5: 3P9 抗体在荷瘤鼠模型中对人结直肠癌生长的抑制作用。BALB/c 小鼠背侧部皮下 种植人结直肠癌肿瘤,腹腔注射 3P9 抗体进行治疗,对照组注射相同体积的 mIgM。A,肿 瘤在 3P9 抗体治疗期间的平均生长体积。B,各组间肿瘤重量的比较。*,p0.05)(表 3-7)。 糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制 52 sTn 在子宫内膜癌组织中的染色分布情况与结直肠癌类似。在少数表达的正 常组织和非典型增生组织中,染色主要集中在细胞膜上;而在肿瘤组织中,细胞 膜和细胞浆均有着色,并且在腺腔的分泌物中可见 sTn 的表达(图 3-4)。这也 提示我们 sTn 可以进入体液并被 3P9 识别。 安云鹤博士学位论文2012 研究内容 53 图 3-4:A-C, typecarcinoma; D-F, typecarcinoma; G-I, atypical hyperplasia; J-L, normal endometrium. A, endometrioid carcinoma I stage; B, endometrioid carcinoma II stage; C, endometrioid carcinoma III stage; D, uterine papillary serous carcinomas II stage; E, uterine papillary serous carcinomas I stage; F, clear cell carcinomas II stage. Magnification is 100 folds. 4. 建立建立可溶性可溶性 sTn 的的双抗夹心检测系统双抗夹心检测系统 在前面大量的组化试验结果中,我们发现某些高表达 sTn 的组织中,其腺腔 内也有着色,表明 sTn 会被分泌进入体液。很多研究也表明,血清中 sTn 的水平 可以作为某些肿瘤不良预后的独立预测因子,如胃癌,结直肠癌和乳腺癌。在体 液中这种可溶的 sTn 化的糖蛋白又叫做 CA72-4(糖抗原 72-4),TAG-72(肿瘤 相关糖蛋白 72)。根据前面的研究结果,我们现有的 sTn 抗体有 6 株,分别是 3P1、3P2、3P3、3P6、3P9 和 B72.3。我们将这些抗体以排列组合的方式进行双 抗夹心配对抗体的筛选。筛选过程中,检测抗体以生物素(biotin)标记后,加 入 HRP 标记的链霉亲和素(Streptavidin)完成显色。筛选过程使用从病人体液 中纯化得到的 TAG-72(Sigma)作为目的抗原。 糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制 54 图 3-5:基于 3P6 和 3P9 建立的 CA72-4 双抗体夹心检测系统。A:双抗体夹心 ELISA 系统 如图所示,以 3P6(2g/ml)作为捕获抗体,biotinlated-3P9(2g/ml)作为检测抗体, Streptavidin-HRP 进一步对信号进行放大,TMB 作为底物与 HRP 进行最后的颜色反应。B: 以溶液中的不同浓度的 CA72-4 为标准品测定的标准曲线。X 轴表示标准品 CA72-4 的浓度 (U/ml) ,Y 轴表示反应测定的吸光值(OD450nm) ,该曲线公式 Y=0.0223+0.0089X, R2=0.9933。 经过抗体的不同配对筛选,我们首先确定了三对组合是信噪比最高的:B72.3 为 捕获抗体,3P9 和 3P6 分别为检测抗体;3P6 为捕获抗体,3P9 为检测抗体。从 线性范围来看,3P6 和 3P9 的组合最广泛,其他两种组合虽然很敏感,但线性范 围太窄, 不适合血清检测。 最终我们确定了捕获抗体 3P6 和检测抗体 3P9 的组合。 接下来的试验我们在包被缓冲液、封闭液、检测抗体稀释液及系统反应体系等几 方面做了进一步的优化,最终确定检测系统条件如下。以 3P6(2g/ml,稀释液 为 0.02M PB,pH 7.25)作为捕获抗体,3P9-biotin(2g/ml,稀释液为 0.02M PB, pH 7.25)作为检测抗体,Streptavidin-HRP 进一步对信号进行放大,封闭液采用 2%BSA,系统反应体系为 50l(图 3-5 A)。CA72-4 以封闭液稀释梯度至 2.5U/ml-160U/ml,应用于该检测系统。结果显示该系统可检测抗原的线性范围 在 5U/ml 到 80U/ml 间(图 3-5B),在此范围之间的样品均可以实现稳定准确的 检测。 5. 新型可溶性新型可溶性 sTn 的的双抗夹心检测系统双抗夹心检测系统 在此基础上,为了进一步缩短检测所需的时间,实现临床检测中快速大量检 测的目的,我们对传统的双抗夹心 ELISA 系统进行了优化。我们实验室首先发现 了磁性纳米颗粒具有过氧化物酶的活性, 因此我们将磁性纳米颗粒偶联在捕获抗 体 3P6 上,以实现捕获、分离抗原和催化底物三个功能于一身的目的。过氧化物 酶偶联检测抗体 3P9,其作用是催化底物葡萄糖产生过氧化氢,过氧化氢又作为 底物参与磁性纳米颗粒催化底物产生颜色反应的过程(图 3-6 A)。在整个过程 中只有最后加入底物之前需要洗涤,并且整个系统是在液相系统中进行,反应时 间很短,每一步只需孵育 15min,因此大大缩短了反应时间。同样,CA72-4 以封 闭液稀释梯度至 2.5U/ml-160U/ml,应用于该检测系统。结果显示该系统可检测 抗原的线性范围在 2.5U/ml 到 40U/ml 间(图 3-6 B),在此范围之间的样品均 可以实现稳定准确的检测。该系统具有较高的灵敏度及快速准确的检测特点,可 以被有效的应用于临床诊断中。 图 3-6:改良的双抗体夹心检测系统。A:改良的双抗体夹心系统如图所示,以磁性纳米颗 粒 (MNP) 标记的 3P6 (2g/ml) 作为捕获抗体, 葡萄糖氧化酶 (GOD) 偶联的 3P9 (2g/ml) 安云鹤博士学位论文2012 研究内容 55 作为检测抗体, 葡萄糖作为底物与 GOD 反应, 其底物与 TMB 一起与 MNP 进行最后的颜色 反应。 B: 以溶液中的不同浓度的 CA72-4 为标准品测定的标准曲线。 X 轴表示标准品 CA72-4 的浓度(U/ml) ,Y 轴表示反应测定的吸光值(OD450nm) ,该曲线公式 Y=0.0072+0.0111X, R2=0.9952。 5. 妇科肿瘤妇科肿瘤患者血清患者血清中中 sTn 的的检测检测 5.1 患者临床资料患者临床资料 完整的临床资料来自北京安贞医院妇产科。子宫内膜癌(EC)患者 5 名 (5113 岁),宫颈癌(CC)患者 7 名(4610 岁),卵巢癌(OC)患者 8 名 (519 岁) , 怀孕组 3 名 (301 岁) , 怀孕者除外的非肿瘤疾病对照组 6 名 (4512 岁)。 所选患者在手术前均未接受放疗,化疗或激素治疗,且所选患者在术前诊 断时均进行肿瘤血清标志物 CA72-4 的检查,且均为阳性。怀孕组均未正常宫内 受孕者,且无任何并发症。所有对照均为子宫肌瘤或炎症患者,且均未接受任何 治疗。 5.2 肿瘤肿瘤患者血清患者血清 sTn 的的检测检测 利用前面建立的改良的 CA72-4 双抗夹心检测系统,我们对子宫内膜癌患 者、宫颈癌患者、卵巢癌患者及对照组的血清 CA72-4 分别进行了测定,检测结 果用 Origin7.5 软件进行统计分析。 图 3-7:妇科肿瘤患者血清 CA72-4 水平。EC,子宫内膜癌;CC,宫颈癌;OC,卵巢 癌;P,怀孕者;N,正常对照。 CA72-4 在正常对照组的血清水平为 3.3061.96U/ml,而在肿瘤患者中血清 水平明显升高。在卵巢癌患者中,其血清水平为 49.7759.59U/ml,宫颈癌中为 60.35125.93U/ml,子宫内膜癌中为 52.597.33U/ml。值得注意的是,CA72-4 在怀孕时的水平也明显升高(50.16410.57U/ml)(图 3-7)。这提示我们在进 行肿瘤标记物 CA72-4 筛查时,怀孕人群应当排除在外。临床上有怀孕合并妇科 肿瘤的病例,此时应主要依靠临床症状,物理检查和病理分析等来确诊。 糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制 56 在子宫内膜癌,宫颈癌和卵巢癌这三大妇科肿瘤中,CA72-4 在卵巢癌中的研 究最多,并常作为一个联合检测的指标。目前已经应用于临床的辅助诊断。我们 的研究发现,在提供的 8 例卵巢癌患者中,均检测到血清 CA72-4 水平的升高, 与临床诊断的结果一致。这提示,我们建立的新系统可以用于临床血清检测。同 时, 我们还检测了宫颈癌和子宫内膜癌血清 CA72-4 的水平。 发现同样有 CA72-4 的水平升高,与临床的检测结果是一致。接下来,如果要真正在临床中应用这一 新系统,还需要增加大量病例,进一步验证系统的可行性。 综上, 我们首次将磁性纳米颗粒的磁性和过氧化物酶的活性同时应用到抗原 的双抗夹心检测体系中,在不影响系统敏感性和特异性的前提下,不但大大缩短 了反应时间,更拓展了磁性纳米颗粒的应用程度。 安云鹤博士学位论文2012 研究内容 57 三、三、讨论讨论 抗体除了可以作为靶向性药物,目前大部分被用于诊断试剂研究。作为一 株新型的抗 sTn 抗体, 我们首先评价了 3P9 在组织学诊断上的应用。 我们收集了 737 例组织,其中包括 18 种常见的肿瘤类型和其相应的正常组织。并用免疫组 化的方法对抗体 3P9 的免疫染色特性进行了分析。 在免疫组织化学染色中, 要评 价一个抗原/抗体的可行性,通常涉及到四个指标,分别是敏感性,特异性,阳 性预测值(PPV) ,阴性预测值(NPV) 。敏感性指的是病人中得出阳性检测的样 本占病人总数的百分比; 特异性即健康人中得出阴性检测的样本占健康人总数的 百分比;阳性预测值指的是得出阳性检测的样本总数中,病人样本占阳性检测样 本总数的百分比;阴性预测值指的是得出阴性检测的样本总数中,正常人样本占 阴性检测样本总数的百分比。其中,敏感性和特异性是最为重要的。当然这四个 指标的值越高越好,但是很少能达到 100%。我们的结果显示,在胰腺癌,肺癌, 膀胱癌,皮肤癌和甲状腺癌中,抗体的特异性和阳性预测值均达到 100%。这还 需要进一步加大病例进行验证,但在一定程度上也说明,在这些肿瘤组织的诊断 中,3P9 抗体可以被应用于辅助诊断以增加其准确性。3P9 所能识别的肿瘤大部 分是上皮来源的, 而在非上皮来源的肿瘤, 如纤维组织肉瘤, 脂肪肉瘤, Hodgkins 病中,几乎没有表达。这与之前的报道是一致的。 3P9 在结直肠癌中的敏感性最高,达 84%。同时,我们将 3P9 与目前广泛 使用的一株商品化抗sTn抗体B72.3在结直肠癌组织中的免疫染色情况进行了比 较。我们发现,二者相比,3P9 较 B72.3 具有更高的敏感性(84% vs 65%) ,阳 性预测值(82% vs 78%)和阴性预测值(81% vs 70%) 。只有特异性较 B72.3 稍 低(78% vs 82%) 。而且,在免疫组化的过程中,3P9 染色无需进行二抗的放大, 两步法就完成显色;而如果用 B72.3 进行染色,还需要信号放大的步骤,不但成 本提高,而且反应时间延长。鉴于此,我们相信,3P9 在组织染色方面完全可以 替代 B72.3。 子宫内膜癌是我们感兴趣的另外一种肿瘤。子宫内膜癌是妇科常见的恶性 肿瘤,发病率仅次于宫颈癌。但是子宫内膜癌尚无特异的早期筛查方法及肿瘤标 志物。而且,虽然肿瘤相关糖抗原 sTn 与各种肿瘤的研究起始已久,并已确认在 多种上皮性腺癌中高表达,且在肿瘤的发生发展中起到了重要作用。但其在子宫 内膜癌中的研究却很少,仅有的几篇报道结果也前后不一197-199。为了阐明 sTn 在子宫内膜癌中的表达情况,我们加大了子宫内膜癌的病例数。结果表明, sTn 在正常组织中的表达率为 31%,在非典型增生组织中为 44%,在子宫内膜癌 组织中为 76%,明显高于正常和非典型增生组织。这说明 sTn 参与了子宫内膜癌 的发生发展,并且可以作为诊断子宫内膜癌的标记物。非典型增生被认为是 I 型 子宫内膜癌的癌前病变,在病理上二者的形态难以区分,尤其是重度非典型增生 与 I 型子宫内膜癌,给临床治疗造成困扰。而 3P9 能够区分非典型增生与 I 型子 宫内膜癌(p0.01) ,这在临床上具有重要的指导意义和应用价值。同时我们发 现,sTn 的表达与子宫内膜癌的临床病理分型和组织分级具有相关性。sTn 并非 在所有的子宫内膜癌中高表达,而是在 I 型子宫内膜癌中高表达(80%) ,而在 II 其子宫内膜癌中低表达(45%) 。这也许可以解释之前仅有的研究结果为什么 互相矛盾,可能问题就出在研究病例的选择上。I 型癌和 II 型癌在组织学形态, 糖抗原 sTn 及其抗体 3P9 在肿瘤诊断和靶向治疗中的作用与机制 58 临床治疗和预后等方面完全不同,前者大多是子宫内膜样腺癌,分化程度高,预 后好,一般采用激素治疗;而后者是非子宫内膜样形态,如浆液性乳头状癌,透 明细胞癌等,分化程度低,预后差,目前临床上还没有成熟的治疗方案。我们的 研究结果为区分 I 型癌和 II 型癌提供了一个新的诊断标记物和诊断试剂。 同时, sTn 在低分化的子宫内膜癌中表达率远远低于高中分化的癌症,也再次证实了以 上结果,同时提示 sTn 在子

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