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分类号 分类号 密级 密级 UDC 编号 编号 中国科学院研究生院 博士学位论文 中国科学院研究生院 博士学位论文 抗抗 CD146 单克隆抗体单克隆抗体 AA98 抑制肿瘤血管抑制肿瘤血管 生成机理的研究生成机理的研究 卜鹏程 指 卜鹏程 指 导导 教教 师师 阎 锡 蕴 研究员 阎 锡 蕴 研究员 中国科学院生物物理研究所 中国科学院生物物理研究所 申请学位级别 博士 申请学位级别 博士 学科专业名称 生物化学与分子生物学 学科专业名称 生物化学与分子生物学 论文提交日期 论文提交日期 2007 年 5 月 30 日 2007 年 5 月 30 日 论文答辩日期论文答辩日期2007 年 6 月 22 日 2007 年 6 月 22 日 培 培 养养 单单 位 中国科学院生物物理研究所 位 中国科学院生物物理研究所 学位授予单位 中国科学院研究生院 学位授予单位 中国科学院研究生院 答辩委员会主席 沈倍奋 院士 答辩委员会主席 沈倍奋 院士 卜鹏程博士学位论文 2007 摘要 I 摘摘 要要 粘附分子 CD146 是黑色素瘤的标志分子,与黑色素瘤的发生和转移密切相 关。此外,我们实验室发现 CD146 还是肿瘤新生血管的新靶标,其表达水平受 肿瘤微环境的影响,并参与肿瘤血管生成;而抗 CD146 单克隆抗体 AA98 能够 抑制血管生成和多种肿瘤的生长(Blood. 2003, 102:184-91;Faculty of 1000 Biology. Feb. 28, 2007) 。本研究是在上述工作的基础上探索 CD146 及其抗体 AA98 在肿瘤血管生成中的分子机制,获得主要研究结果如下: (1)发现肿瘤培养上清促进血管内皮细胞增殖和迁移的分子机制是:肿瘤 培养上清诱导p38 MAPK的磷酸化、 激活NF kappa B信号通路, 从而上调MMP-9 和 ICAM-1 的表达, 后者在内皮细胞迁移和肿瘤血管生成过程中起着非常重要的 作用。另外,我们还发现抗体 AA98 能够抑制由肿瘤培养上清诱导的 p38 MAPK 磷酸化、NF kappa B 核转移和 MMP-9、ICAM-1 的表达,这种抑制作用表现为 抗体剂量依赖性和时间依赖性(Mol Cancer Ther. 2006, 5(11): 2872-2878) 。 (2) NF kappa B 的激活能够上调 CD146 的表达, 而且呈时间、 剂量依赖性。 通过基因序列分析,我们发现 CD146 启动子区域含有两个假定的 NF kappa B 结 合位点。为了证实该启动子的转录效率及与 NF kappa B 结合能力,我们进行了 缺失突变和染色质免疫共沉淀实验,结果证实了 NF kappa B 结合位点的存在, 后者是调节 CD146 表达所必需。 (3)CD146 在活细胞中发生二聚化,而且这种二聚化现象与肿瘤的恶化相 关。此外,还发现肿瘤培养上清能够通过激活 NF kappa B 通路诱导 CD146 二聚 化,而抗体 AA98 能够阻止其诱导的 CD146 二聚化,提示抗体 AA98 抑制肿瘤 的生长和转移可能与其抑制 CD146 的二聚化相关(BBA-Mol Cell Res. 2007, 773(4):513-20) 。 (4)发现 A375 细胞中存在 100 kD 和 130 kD 两种不同分子量的 CD146。 有意思的是只有 130 kD 的 CD146 分子发生酪氨酸磷酸化, 暗示可能参与细胞信 号传递;而 100 kD 的 CD146 分子发生二聚化,可能参与肿瘤的生长与转移。 (5)发现 CD146 和波形蛋白 vimentin 在黑色素瘤细胞 A375 中相互作用, 而抗体 AA98 能够抑制 CD146 与 vimentin 的相互作用,其意义正在探索之中。 根据上述实验结果,我们推测 CD146 及其抗体 AA98 在肿瘤血管生成中可 能的作用机制是:肿瘤培养上清激活 NF kappa B 信号通路,上调 CD146 潜在配 体的表达;而配体和 CD146 的结合诱导 CD146 二聚化,激活 p38 MAPK、促使 NF kappa B 发生核转移, 上调促血管生成因子 MMP-9、 ICAM-1、 CD146 的表达, 后者促进血管内皮细胞迁移和血管生成。单克隆抗体 AA98 与 CD146 结合,阻 抗 CD146 单克隆抗体 AA98 抑制肿瘤血管生成机理的研究 II 止了 CD146 与其潜在配体的相互作用,进而抑制了 CD146 的二聚化,阻止 p38 MAPK 发生磷酸化,抑制 NF kappa B 活性,下调 MMP-9 和 ICAM-1 表达,从而 抑制血管内皮细胞增殖、迁移和血管生成。 关键词关键词:CD146,肿瘤血管生成,NF kappa B,二聚化,磷酸化,波形蛋白 卜鹏程博士学位论文 2007 摘要 III Abstract Pengcheng Bu (Cell biology) Directed by Xiyun Yan Adhesion molecule CD146 is a marker of melanoma cells and plays an important role in melanoma progression and metastasis. In our previous study, CD146 was identified as a novel target for tumor vascular endothelium. Further study indicated that CD146 participated in angiogenesis and its expression was upregulated by tumor micro-environment. Moreover, we found that anti-CD146 mAb AA98 raised against tumor conditioned medium-stimulated HUVECs, inhibited angiogenesis and tumor growth (Blood. 2003, 102:184-91; Faculty of 1000 Biology. Feb. 28, 2007). However, the mechanism behind is not elucidated. The objective of this thesis is to understand the mechanism of CD146 and mAb AA98 in tumor metastasis and angiogenesis. The important findings are summarized as follows: (1) Tumor conditioned medium induced NF kappa B activation through the upstream of p38 MAPK pathway, leading to the up-regulation of MMP-9 and ICAM-1 expression, which play an important role in angiogenesis and tumor metastasis. Interestingly, all these activities stimulated by tumor conditioned medium could be effectively inhibited by mAb AA98 in a dose and time dependent manner (Mol Cancer Ther. 2006, 5(11): 2872-2878). (2) NF kappa B activation induces CD146 expression. Further study indicated two potential NF kappa B like binding sites exist in CD146 promoter region. Analysis of CD146 promoter activity and NF kappa B binding ability by chromatin immunoprecipitation assay (ChIp) and mutation confirmed existence of the NF kappa B like binding site, which is important for CD146 transcription in ECV304 cells. (3) CD146 dimerization occurs in living cells and this dimerization phenomenon may be associated with malignancy. In addition, we found that CD146 dimerization was up-regulated by tumor conditioned medium through NF kappa B, while mAb AA98 inhibited the induced CD146 dimerization, which may be the molecule mechanism that mAb AA98 inhibited endothelial cell migration and angiogenesis (BBA-Mol Cell Res. 2007, 773(4):513-20). (4) Two forms of CD146 (100 kD and 130 kD) were identified in A375 cells. Interestingly, only the 130 kD CD146 is alternatively tyrosine-phosphorylated, which may be involved in signal transduction. And dimerization of the 100 kD CD146 may 抗 CD146 单克隆抗体 AA98 抑制肿瘤血管生成机理的研究 IV be associated with malignancy. (5) We found that CD146 is interacted with vimentin in melanoma cell A375. Interestingly, the interaction can be inhibited by mAb AA98. The subsequent study is going on. In conclusion, we hypothesize that tumor conditioned medium up-regulated the potential ligand of CD146 though NF kappa B activation. And the ligand binding to CD146 induced CD146 dimerization, activated p38 MAPK, promoted NF kappa B nuclear translocation, and then up-regulated the expression of MMP-9, ICAM-1 and CD146. The engagement of mAb AA98 with CD146 inhibited the interaction between CD146 and its ligand, suppressed CD146 dimerization, inhibited p38 MAPK activity and NF kappa B nuclear translocation, and then down-regulated the expression of MMP-9 and ICAM-1. Key words: CD146, angiogenesis, NF kappa B, dimerization, phosphorylation, vimentin 卜鹏程博士学位论文 2007 目录 V 目 录 目 录 中文摘要 I I 英文摘要 目录 文献综述 11 第一部分 肿瘤血管生成及靶向治疗 11 1 肿瘤血管生成 1 2 血管生成靶向治疗 10 3 问题与展望 15 第二部分 粘附分子 CD146 在肿瘤转移和血管生成中的作用1515 1 CD146 的结构 16 2 CD146 的分布 16 3 CD146 的生物功能 17 4 问题与展望18 材料与方法20 实验结果与讨论28 第一部分 AA98 通过抑制 NF kappa B 信号通路抑制肿瘤血管生成 2828 1 摘要 28 2 结果 28 3 讨论 34 第二部分 CD146 的二聚化及其在活细胞中的调节 3535 1 摘要 35 2 结果 35 3 讨论 42 第三部分 TNF-通过激活 NF kappa B 上调 CD146 的表达 4343 1 摘要 43 2 结果 43 3 讨论 48 第四部分 CD146 自身磷酸化 4949 1 摘要 49 2 结果 50 抗 CD146 单克隆抗体 AA98 抑制肿瘤血管生成机理的研究 VI 3 讨论 54 第五部分 CD146 与波形蛋白的相互作用 5555 1 摘要 55 2 结果 56 3 讨论 58 参考文献 6060 发表文章 7373 致谢 7474 附录 卜鹏程博士学位论文 2007 文献综述 1 文献综述文献综述 第一部分第一部分 肿瘤血管生成及靶向治疗肿瘤血管生成及靶向治疗 早在几个世纪前, 有学者就提出肿瘤可能是一个与脉管系统有着密切关系的 疾病。1787 年,Johon 就用血管生成(angiogenesis)一词描述血管生成过程1。 1939 年,Ide 等发现肿瘤细胞分泌促血管生成因子2。1945 年,Algire 等观察到 了肿瘤血管与正常血管的差异3。然而,直到 1971 年 Folkman 提出肿瘤生长依 赖于血管生成4的观点之后,血管生成研究才真正启动并成为肿瘤研究的热点, 同时抗肿瘤血管生成作为肿瘤治疗的一个新思路也越来越受到国内外研究人员 和制药公司的关注。目前国内外已有包括 Avastin、Macugen、Endostatin 等多种 抗肿瘤血管生成药物上市,此外,还有大量的针对不同靶标的抗肿瘤血管生成药 物进入临床。 1 肿瘤血管生成肿瘤血管生成 1.1 血管生成过程血管生成过程 血管生成有两种不同的形式:(1)芽式生长:从原有的血管基础上芽式生 长成毛细血管, 其内皮朝着产生血管生成因子的细胞, 在血管芽的顶端生长延长, 包括细胞外基质的降解、内皮细胞趋化性迁移和增生、内皮板层的形成和功能成 熟等过程。(2)套叠式生长:内皮细胞增殖致使管腔增大,通过产生贯穿毛细 血管的间隙组织柱而最终导致血管腔裂开形成新生血管5。 基于出芽模式的血管生成主要分为以下一些步骤:(1)维持血管正常代谢 的刺激因子和抑制因子之间的平衡被打破,促血管生成因子的活性上调,内皮细 胞被激活,细胞分裂和增殖加快。(2)血管基底膜中的金属蛋白酶、丝氨酸蛋 白水解酶、尿激酶型血纤溶酶原激活剂等多种水解酶类水平上调6,降解基底膜 与细胞外基质。(3)内皮细胞膜上的粘附分子表达上调,如整合素v3通过激 发钙信号调节途径,导致内皮细胞侵人周围组织的基质层并增殖和迁移7。(4) 各种促血管内皮生长因子的受体分子如 Flt-1,Flk-18,Tie-1 和 Tie-29等表达量 也相应增高。这些受体与生长因子结合,促使内皮细胞组装形成管腔和血管网。 (5)在 angiopoielin-1 和 angiopoietn-2 等因子作用下,通过促进或松弛内皮细胞 与其周围支持细胞的相互作用,完成血管重塑10。(图 1) 抗 CD146 单克隆抗体 AA98 抑制肿瘤血管生成机理的研究 2 1.2 肿瘤血管的形态特征肿瘤血管的形态特征 正常器官和组织中的血管通常相对静止,但在一些生理(如成年女性子宫内 膜血管的周期性重建、胚胎发育、创伤修复)和病理(如肿瘤、糖尿病性视网膜 病变、风湿性关节炎)过程中,由于血管生成的正负调控系统平衡被打破,进而 导致血管生成。生理性血管生成的特点是有序而可控的,新生血管形成后迅速成 熟稳定。然而在病理过程,尤其在肿瘤的增殖和迁移过程中,血管生成的正负调 控系统持续失衡。由于血管像永不愈合的伤口一样持续而无控制的生成,导致肿 瘤血管具有特别的形态结构,主要表现为: (1)血管粗细不均、膨胀、粗糙以及 有终端。肿瘤血管不像正常血管一样分为动脉、静脉以及毛细血管,而是高度混 乱无序、血管扭曲。 (2)肿瘤细胞和内皮细胞相间排列在肿瘤血管腔内表面,形 成“马赛克血管” 。 (3)内皮不完整、基底膜不连续甚至缺失、造成血管通透性 高15-17。 (4)血管缺乏功能性的淋巴系统18,造成新生毛细血管间质高压,不仅 进一步抑制淋巴管形成19,还干扰抗肿瘤药物的运送20,同时促进肿瘤细胞的 扩散和转移21。 (5)血管中血流紊乱,流动缓慢,有时甚至会发生振动12,易 导致肿瘤内出现缺氧和酸性区13, 不仅降低了抗肿瘤药物的效力, 还不断调节血 图 1 肿瘤血管生成模式图 内皮细胞的迁移和粘附 胞外基质降解 基质金属蛋白酶 内皮细胞 增殖 肿瘤血管生成和肿瘤生长 基质 肿瘤细胞 内皮细胞 肿瘤细胞 血管平滑肌细胞 迁移 卜鹏程博士学位论文 2007 文献综述 3 管生成因子的产生,有利于高恶性和转移性肿瘤细胞的选择14。 (6)血管表面某 些分子过表达或表达缺失。 1.3 肿瘤血管生成促进肿瘤生长和转移肿瘤血管生成促进肿瘤生长和转移 肿瘤细胞转移需逃避免疫监视,从原发灶进入血管,在循环系统中存活,定 位于靶器官的微血管并进入靶器官,诱发转移灶血管生成22,23。血管生成是转移 过程自始至终所必须的。在原发肿瘤血管化之前,循环中肿瘤细胞极少24,仅在 血管化后它才持续出现在循环系统中,肿瘤微血管数量越多,肿瘤细胞进入血液 循环的机会就越大。大量的血管不仅增加了肿瘤细胞进入循环系统的机会;同时 因为肿瘤新生血管结构缺乏完整性,管壁薄弱,仅排列一层内皮细胞,缺乏平滑 肌, 基底膜变薄或者缺失, 使它们比正常成熟血管更容易被肿瘤细胞穿透。 再者, 血管生成本身就具有一定的组织侵袭性, 肿瘤细胞可以沿着新生血管所开启的胶 原裂隙侵袭。另一方面,肿瘤细胞释放的血浆蛋白酶原激活剂及胶原酶能诱导组 织纤维蛋白的形成,进而形成肿瘤细胞转移所必需的基质,使游离的肿瘤细胞通 过基质迁移进入血液循环,在远离肿瘤的部位形成转移灶25,26。不少研究发现, 随着肿瘤微血管密度(microvesseld ensity, MVD)的增加,肿瘤侵袭转移等恶性 潜能也明显增加。 MVD 可以被认为是预测肿瘤转移、 复发和预后的一项指标27。 1.4 肿瘤血管生成的机制肿瘤血管生成的机制 对于肿瘤血管生成机制, 早在三十年前 Folkman 提出一种假设, 他认为肿瘤 在无血管状态下只能生长到 1-2mm3,也无法转移至其它器官。若要持续生长, 必须诱发新生血管。在这一过程中,肿瘤分泌多种促血管生成的生长因子,如血 管内皮生长因子(VEGF) 、碱性成纤维生长因子(bFGF) 、白介素8(IL-8) 28。 目前至少有以下证据支持这一假设: (1)鼠皮下移植的肿瘤,在血管形成前肿瘤 生长呈线性增加,而在血管形成后肿瘤生长呈指数增加。 (2)鸡胚绒毛尿囊膜 (CAM)上生长的肿瘤,其生长在无血管期受限,但在血管形成后肿瘤快速生 长。 (3)鼠皮下注射肿瘤细胞,在肿瘤体积大约 0.4mm3时即发现有血管形成, 随着肿瘤直径的进一步增加,血管占肿瘤的比例增加,最终将占整个肿瘤体积的 1.5。 (4)无血管的球状肿瘤在体外培养时仅能达到 2mm3,体内也只能达到 0.4mm3,只有在球状体血管化后才发生进一步生长和转移。 (5)乳腺癌中血管 内皮细胞的增殖比癌旁间质内皮细胞快 45 倍。 (6)血管生成抑制剂 TNP-470 在 体内能抑制肿瘤生长,在体内和体外均能抑制内皮细胞增殖。 (7)腹腔内注射 bFGF 能够增加肿瘤的血管密度,抗 bFGF 抗体对肿瘤的长生有明显抑制作用。 (8)VEGF 能促进肿瘤血管形成,采用抗 VEGF 抗体或负调其受体 Flk-1 基因 均能抑制移植性动物肿瘤生长和转移。 抗 CD146 单克隆抗体 AA98 抑制肿瘤血管生成机理的研究 4 目前广为接受的血管生成机制是由Hanahan和Folkman于1996年提出的 “血 管生成转换(angiogenic switch) ” ,该假说认为内皮细胞增殖形成新血管的过程 中发生“转换” 。决定“转换”开启的因素是血管生成抑制因子和激活因子的水平。 当正负调节因子处于平衡时 “关闭” , 平衡被打破而倾向于促血管生成方向时 “打 开”29,30。此外, “血管生成转换”还受到多种信号的触发,包括代谢压(如低 pH,缺氧,低血糖) 、机械压迫(如细胞增殖产生的压力) 、免疫/炎症反应(如 免疫/炎症细胞浸润)和遗传突变(控制血管生成调节因子表达的原癌基因的激 活和抑癌基因缺失) 31,32。环境与遗传机制的共同作用如何影响肿瘤的生长和血 管生成是一个非常复杂的过程,还有大量未知细节有待揭示。 1.5 肿瘤血管生成的调节肿瘤血管生成的调节 1.5.1 促血管生成因子与抗血管生成因子促血管生成因子与抗血管生成因子 肿瘤血管生成是一个极其复杂的过程, 包括选择性降解血管基底膜和周围的 细胞外间质、内皮细胞分裂、游走和增殖,这些过程受血管生成诱导剂和抑制剂 调节。影响血管生成的因子包括促血管生成因子和血管生成抑制因子,对这些因 子的鉴定是理解血管生成机制的基础, 有助于对该过程的人为调控并最终发展出 可行的肿瘤治疗策略,表 1 和表 2 列举了近年来鉴定了的血管生成调节因子。 表表 1 促血管生成因子促血管生成因子 促血管生成因子名称促血管生成因子名称 参考文献参考文献 血管生成素(Angiogenin) 33 血管生成因子-1(Angiopoietin-1) 34 造血干细胞标记AC133 35 甘油一丁酸酯(1-Butyryl glycerol) 36 Developmentally regulated endothelial locus 1, Del-1 -雌二醇(-estradiol) Ephrins 成纤维细胞生长因子(Fibroblast growth factor, FGF-) 卵泡抑制素(Follistatin) 粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony stimulating factor, G-CSF) 肝细胞生长因子(Hepatocyte growth factor, HGF) 离散因子(Scatter factor, SF) Id1/Id3 37 38 39 40 41 42 43 43 44 副层连蛋白(Entactin) 45 卜鹏程博士学位论文 2007 文献综述 5 层粘连蛋白(Laminin) 45 整合素(Integrins, V3, V5, 51) 46 白介素-8(IL-8) 47 瘦素(Leptin) 48 巨噬细胞趋化蛋白(Macrophage chemoattractant protein, MCP-1) 49 基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteases, MMPs) 50 妊娠中肾细胞因子(Midkine) 51 一氧化氮合酶(Nitric oxide synthase, NOS) 52 基底膜蛋白聚糖(Perlecan) 53 磷脂(Phospholipids) 54 胎盘生长因子(Placental growth factor, PLGF) 55 血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor-BB, PDGF-BB) 56 多效蛋白(Pleiotrophin, PTN) 57 血小板源内皮细胞生长因子(Platelet derived endothelial cell growth factor, PD-ECGF) 58 增殖蛋白(Proliferin) 59 前列腺素(Prostaglandins E1 and E2) 60 转化生长因子(Transforming growth factor, TGF-) 58,61 肿瘤坏死因子(Tumour necrosis factor-alpha, TNF-) 62 血管内皮钙粘素(Vascular endothelial cadherin, VE cadherin) 63 血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF) 58,64 在所有的血管生成因子中,对 VEGF 及 bFGF 的研究最为深入。VEGF 具有 增加微血管通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建、促使内皮细 胞迁移等多种作用,是已知最强的血管通透剂。VEGF 选择性地作用于血管内皮 细胞膜上的两种型酪氨酸激酶受体 flt-1 和 KDR,通过磷酸肌醇特异性磷酯酶 C 使胞内甘油三酯(IP3)浓度升高而发挥作用。bFGF 是一种重要的促血管生成 因子,它由肿瘤细胞、巨噬细胞或胞外基质释放,能够上调某些重要的促血管生 成因子如 VEGF 和纤溶酶原激活物,并通过 Bcl-2 途径抑制内皮细胞的凋亡。 bFGF 主要通过与其高亲和性受体 bFGFR 的结合发挥生物活性。 内源性血管抑制剂,包括血小板反应蛋白(throm-bospondin-1,TSP-1)、 干扰素/、血小板因子-4(PF-4)、angiostatin(血管抑制素)及 endostatin(内 皮抑制素)等数十种,其中新近发现的 angiostatin 和 endostatin 尤为值得关注。 angiostatin 是一个分子量为 38000 kD 的纤维蛋白溶酶原片段, 能抑制内皮细胞增 殖、血管生成和肿瘤生长。angiostatin 通过阻断裂解纤溶酶原的酶催化位点,阻 抗 CD146 单克隆抗体 AA98 抑制肿瘤血管生成机理的研究 6 止调节血管生成的基质重塑,选择性阻断内皮细胞对血管生成刺激的反应,使微 转移蛰伏。在小鼠肿瘤模型中,注射 angiostatin 后能抑制乳腺癌、结肠癌和前列 腺癌的生长。Endostatin 是胶原蛋白 X的 C 末端片段,首先从鼠血管内皮细胞 株中分离获得。它能封闭内皮细胞上丝裂原活化的蛋白激酶途径,抑制内皮细胞 增殖,阻断血管生成。重组 Endostatin 能抑制血管生成、肿瘤的生长和原发肿瘤 的发展。经 Endostatin 处理的肿瘤与未经处理的肿瘤增殖速率相似,但前者的程 序性细胞死亡率较后者高 7 倍之多。 表表 2 血管生成抑制因子血管生成抑制因子 血管生成抑制因子名称血管生成抑制因子名称 参考文献参考文献 血管抑素(Angiostatin) 65 抗血管生成的抗凝血酶III(Antiangiogenic antithrombin ) 66 钙网素(Calreticulin) 67 癌抑素(Canstatin) 68 软骨源抑制因子(Cartilage derived inhibitor, CDI) 核心蛋白聚糖(Decorin) 活性维生素D3(1,2,5-Dihydroxyvitamin D3) 内皮抑素(Endostatin) 纤粘连蛋白片断(Fibronectin fragment) 骨粘连蛋白片断(Fragment of SPARC) 肝素酶(Heparinases) 人绒毛膜促性腺激素(Human chorionic gonadotrophin, HCG) 干扰素(Interferon, IFN-) 69 70 71 72 73 74 75 76 77 白介素-4,12,18(IL-4, IL-12, IL-18) 78 Maspin 79 纤溶酶原饼环区5(Plasminogen Kringle-5) 80 胎盘核糖核酸酶抑制因子(Placental ribonuclease inhibitor) 81 色素上皮源生长因子(Pigment epithelium derived growth factor, PEDF) 82 血小板因子(Platelet factor 4, PF4) 83 催乳素片断(Prolactin 16 kDa fragment) 84 类维生素A(Retinoids) 85 金属蛋白酶组织抑制因子(Tissue inhibitor of metalloproteinases, TIMPs) 86 血小板反应蛋白(Thrombospondin-1, TSP-1) 87 血管抑制素(Vasculostatin) 88 血管抑制因子(Vasostatin) 89 卜鹏程博士学位论文 2007 文献综述 7 1.5.2 粘附分子与肿瘤血管生成粘附分子与肿瘤血管生成 内皮细胞的侵袭、运动,内皮细胞与细胞外基质相互作用,血管环及管腔结 构的形成等血管生成过程,均需要细胞粘附分子的参与。细胞粘附分子分为4大 类:整合素家族(integrins)、选择素家族(selectins),钙粘素家族(cadherins) 和免疫球蛋白超家族(IgSF),其中Integrins是最重要的粘附分子。整合素是/ 异源二聚体跨膜蛋白,通过与含RGD(Arg-Gly-Asp)序列的胞外基质蛋白作用 控制细胞的迁移、分化和增殖。在整合素家族中, v3在肿瘤血管特异性高表达 90-93,在血管生成中起着重要作用。它能在内皮细胞表面引发MMP-2降解基质 的活性,能抑制内皮细胞的p53及其所诱导的p21蛋白的活性,从而表现出抗凋亡 的效应。它能单独诱导细胞扩散、转移、血管生成和癌细胞的增生。近年研究发 现,v5参与VEGF、bFGF诱发的血管生成94,95。E-cad是另一种粘附分子,它特 异地表达于细胞与细胞发生相互粘连的区域,与内皮细胞的迁移、生存、生长抑 制和血管粘附相关96。E-cad影响内皮细胞组装成脉管结构,在血管生成中起到 关键性作用97。 随着研究的深人, 发现一些肿瘤细胞表面特异抗原及细胞粘附分子在肿瘤血 管内皮上高表达,而在正常血管上不表达,如前列腺特异的膜抗原(prostate specific membrane antigen, PS-MA)98、肿瘤衍生粘附因子(tumor-derived adhesion factor, TAF)99、CD44100和整合素31101等。近年来,发现粘附分子 CD146 在肿瘤血管生成过程中也发挥着重要的作用,这部分研究将在后面叙述。 1.5.3 基质金属蛋白酶与肿瘤血管生成基质金属蛋白酶与肿瘤血管生成 基质金属蛋白酶(MMPs)家族现已有超过20个成员,按结构和基质特性不 同可分为胶原酶(collagense, MMP-1, MMP-8, MMP-13, MMP-18)、明胶酶 (gelatinize, MMP-2, MMP-9) 、 基质降解素 (stromelysin, MMP-3, MW-7, MMP-10, MMP-1l)、膜WMMP(MT-MMP)等4大类102。MMPs在肿瘤血管生成过程中 起着非常重要的作用。在肿瘤组织中,随着MMPs含量的增加,新生的血管也相 应增加103-106,加人MMP抑制剂后新生血管减少107-108。在敲除了MMP-2的 B16-B16黑色素瘤模型中,应用背部气囊法观察新生血管的情况,可以发现肿瘤 诱导的新生血管数目显著减少109,说明MMP-2在新生血管形成和肿瘤进展中起 着重要的作用。而在MMP-9敲除鼠可以观察到新生血管减少,以及软骨生长受 阻滞110。 基质金属蛋白酶(MMPs)促进肿瘤血管生成的机理,最重要的也是最容易 抗 CD146 单克隆抗体 AA98 抑制肿瘤血管生成机理的研究 8 让人理解的是它们能够降解细胞外基质以及血管基底膜, 使得血管内皮细胞能增 殖并向肿瘤方向发展,以“发芽”的方式从原有的血管发出新的分支,并且在血 管形成后期重塑基底膜和管腔的过程中发挥作用111。此外,MMPs还能调节促 血管生成因子的活性或表达,从而影响血管生成。例如MMPs能激活潜伏形式的 转化生长因子R(I-GF-R);通过降解基质成分,释放出与基质成分结合的碱性 成纤维生长因子(bFGF)和血管内皮生长因子(VEGF);通过降解血管基底膜 而释放出膜结合的肿瘤坏死因子(TNF-),上述均为血管生成的促进因子 112,113。Bergers114等在胰岛B细胞瘤模型中,发现EGF及其受体的表达并没有增 加,而是从基质“储备”中释放出来,增加游离VEGF水平,使之能与VEGF受 体有更多的结合。这种释放依靠MMP-9的活性作用,而后者在肿瘤进展过程中 表达增加。MMPs在肿瘤血管模拟过程中也发挥着重要的作用。有些肿瘤细胞能 够象血管内皮细胞一样表达内皮细胞相关的基因,形成流动的管腔,模拟肿瘤血 管,如在黑色素瘤细胞中MMP-2,MT1-MMP高表达,在血管模拟中发挥作用。 1.3.4 NF kappa B 信号转导与肿瘤血管生成信号转导与肿瘤血管生成 核转录因子(NF kappa B)是 Baltimore 和 Sen 于 1986 年在成熟的 B 细胞核 提取液中发现的,因为它能与免疫球蛋白轻链基因的增强子特定 DNA 位点结 合,所以命名为核转录因子(NF kappa B) ,后来发现它广泛存在于除酵母、线 虫外的大多数细胞中115。 NF kappa B是NF kappa B/Rel家族中的一员。 哺乳动物有5种NF kappa B/Rel 蛋白:P65(RelA) 、RelB、c-Rel、P50(NF kappa B1)和 P52(又称 NF kappa B2) 分别由前体蛋白P105和P100水解产生 (P105和P100还分别产生IB和IB) , 它们组成各种各样的同源或异源二聚体。静息状态下,细胞中的 NF kappa B 二 聚体结合在一种叫做 IB 的抑制性蛋白上,以非活性形式存在于胞浆中。至少有 六种 IB(IB、IB、IB(P105) 、IB(P100) 、IB 及 Bcl-3)参与控制 NF kappa B 二聚体的活性。IB 蛋白的共同特点是存在多个紧密相邻的 33 个氨 基酸组成的重复序列,称为锚蛋白基序(ankrin motif) ,其主要功能是覆盖 NF kappa B 的核定位信号,阻止 NF kappa B 进入吸细胞核,另外还可以在细胞核阻 碍 NF kappa B 与 DNA 的结合,甚至解离 NF kappa B 和 DNA 的复合物116。 NF kappa B 可被多种因素激活,包括反应性氧中间产物117,118、细胞因子 119-124、细菌或病毒125-131及其产物132-138,紫外线139、受体/配体140-144、生长 因子145-148、化学试剂149-152等等。总之 NF kappa B 的活化过程包括以下步骤: 卜鹏程博士学位论文 2007 文献综述 9 (1)IB 的磷酸化。首先 IB 在 NIK 的作用下磷酸化其 C 末端富含脯氨酸、谷 氨酸、丝氨酸、苏氨酸结构域(PEST 结构域) ,然后对 IB 的 N 末端的 32 位 和 36 位丝氨酸进行磷酸化(IB 为 S19 和 S23) 。 (2)IB 的 N 末端第 21 位和 22 位赖氨酸与多个泛素分子共价结合。 (3)与泛素结合的 IB 发生构象变化, 被催化性 ATP 依赖的 26S 的蛋白酶识别并降解,NF kappa B 游离并移入核内。 NF kappa B 在核内与新合成的 IB 结合后出核,进入胞浆从而失活153。 激活的 NF kappa B 进入细胞核,可调节很多基因的表达,在一定程度上调 控相当广泛的生理病理过程,如免疫和炎症反应,免疫系统中 T 细胞和 B 细胞、 内皮细胞、巨噬细胞/抗原呈递细胞中的细胞因子、白介素、粘附分子的表达。 除此之外,NF kappa B 在肿瘤的增殖、迁移,肿瘤血管生成过程中也发挥着相 当重要的作用。NF kappa B 通过调控细胞因子 IL-1、IL-6、EGF 的表达进而促进 肿瘤细胞的增殖,通过调控细胞周期蛋白的表达,促使肿瘤或内皮细胞从 G 期 向 S 期转化154-157。肿瘤血管的生成需要血管内皮细胞的增殖和迁移,而血管内 皮细胞的增殖和迁移需要基质金属蛋白酶 MMPs 降解其胞外基质。有很多证据 图 2 NF kappa B 信号转导通路模式图 抗 CD146 单克隆抗体 AA98 抑制肿瘤血管生成机理的研究 10 表明,MMPs 的表达可被 NF kappa B 所调控158-160,如 Bond 等通过腺病毒载体 抑制 IB 的活性,结果 NF kappa B 被激活,MMP-9 的表达被上调161。高转移 性的黑色素瘤中 NF kappa B 以持续活性形式高水平表达,抑制 NF kappa B 的活 性可以抑制肿瘤的生长、迁移,降低肿瘤血管密度162。此外,NF kappa B 还可 以上调很多促血管生成因子的表达,包括细胞因子(IL-8163、MCP-1164,165) , 粘附分子(ICAM-1166、VCAM-1167) ,生长因子(VEGF168、PLGF169)以及 其它一些促血管生成因子如 NOS170、Laminin171等等。随着对 NF kappa B 与肿 瘤血管生成关系了解的深入, NF kappa B 作为抑制肿瘤血管生成的一个新靶点具 有广阔的前景。 2 血管生成靶向治疗血管生成靶向治疗 自 1971 年哈佛大学医学院的 Folkman 教授提出实体肿瘤的生长和转移依赖 于血管生成以来,许多研究者对这一理论进行了广泛深入的研究,形成了抗肿瘤 血管生成疗法,并取得较大进展。目前,在成功的临床前实验基础上,已经有超 过 75 种抗血管生成药物以单独或联合使用的方式进入临床试验,其中绝大部分 处于或期临床。至少 12 种进入或已经结束了期临床(表 3) 2.1 抗血管生成治疗的优点和策略抗血管生成治疗的优点和策略 抗肿瘤血管生成治疗通过抑制或破坏肿瘤血管生成切断肿瘤赖以生存的“生 命线”,达到“饿死肿瘤”的目的。与针对肿瘤细胞的传统肿瘤治疗相比,抗肿瘤 血管生成策略具有以下优势: (1)不易产生耐药性。因为肿瘤血管由遗传稳定的 二倍体内皮细胞组成,即使多次反复给药甚至肿瘤复发再给药也不易产生耐药 性; (2)药物穿透性强

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