细胞黏附分子CD146的研究——在自身免疫疾病中的表达以及CD146的分子亚型

分类号 密级 UDC 编号 中国科学院研究生院 博士学位论文 细胞黏附分子 CD146 的研究 在自身免疫疾病中的表达以及 CD146 的分子亚型 张佰茹 张佰茹 指导教师 阎锡蕴 研究员 博士 指导教师 阎锡蕴 研究员 博士 中国科学院生物物理研究所 中国科学院生物物理研究所 申请学位级别 博士学位 博士学位 学科专业名称 生物化学与分子生物学 论文提交日期 2006.8. 2006.8. 论文答辩日期 2005.8.18 2005.8.18 培 养 单 位 中国科学院生物物理研究所 学位授予单位 中国科学院研究生院 答辩委员会主席 张佰茹博士学位论文 2006 摘要 I 摘摘 要要 作为新发现的内皮细胞黏附分子，CD146 还有很多未知有待探索。本研究 的主要目的是研究 CD146 在慢性炎症血管炎、系统性红斑狼疮以及脱髓鞘 病中的作用，同时研究膜结合形式 CD146 的亚型。研究分三部分展开： 1. 本研究首次从膜结合形式 CD146 和可溶性 CD146(sCD146)两个方面来研 究 CD146 在血管炎和系统性红斑狼疮患者中的动态表达以及临床意义。实验结 果显示外周血白细胞膜上的 CD146 表达，而不是血清 sCD146 水平，能够反应 出血管炎和 SLE 患者疾病进程，并有可能预测预后情况。CD146 在患者活动期 白细胞上的表达仅限于外周血白细胞，在渗透到组织中的白细胞上 CD146 表达 缺失，显示 CD146 发挥作用的时空定位。体外实验证实 CD146 在白细胞表面是 可诱导表达，与临床检测结果趋势一致。文献报道血管内皮细胞表达 CD146 配 体，健康人淋巴细胞亚群表达 CD146 分子，综合本研究所得结果，CD146 在活 动期患者循环的白细胞上的诱导表达很可能介导白细胞与血管内皮之间的相互 作用，并且这种诱导表达为监控疾病进程及预后的提供新的靶标。 2. 由于目前商品化检测 sCD146 的 ELISA 试剂盒不够灵敏，无法对脱髓鞘 病患者脑脊液中 sCD146 定量。本研究采用基于光学椭偏光成像技术的蛋白质芯 片来检测脑脊液样品种 sCD146 的含量。该方法有样品用量少，样品无需任何标 记物，检测速度快等优点。实验结果表明该方法可以灵敏检测脑脊液样品中 sCD146 含量， 检测极限为 0.2ng/ml， 比商品化的 ELISA 试剂盒(检测极限 100/ml) 灵敏 500 倍，可以用于脑脊液样品 sCD146 的检测。 3. 本研究首次发现三个分子量的 CD146：CD146130 （130kDa） 、CD146110 (110kDa)和 CD14697(97kDa)。三个分子量的糖基化以及分布各不相同。三个分子 量CD146在血管系统中的表达： CD14697大量表达于血管平滑肌上， 同时CD14697 可以形成天然二聚体，显示了 CD146-CD146 之间的相互作用；CD146110在正常 组织上的表达仅限于某些血管内皮细胞上，但在肿瘤血管上大量表达，反映 CD146110在血管生成中起作用。CD146130与前两个分子量的 CD146 显著区别是 不能够被神经氨酸酶所消化。此外黑色素瘤细胞对 CD14697表达有选择性，预示 CD14697在黑色素瘤发展中的作用。通过 RT-PCR 发现了 CD146 的 RNA 剪接， 首次分析两个剪接产物的序列。 关键词关键词：细胞黏附分子，CD146 亚型，自身免疫病，光学椭偏光成像 细胞黏附分子 CD146 的研究在自身免疫疾病中的表达以及 CD146 的分子亚型 II Abstract Bairu Zhang (Biochemistry and molecular biology) Directed by Xiyun Yan As a new assigned endothelial cell adhesion molecule, much more is unkown about CD146. The aim of this study is to evaluate the role of CD146 in chronic inflammation including systemic vasculitis, systemic lupus erythema, and multiple sclerosis and Guillain-Barre Syndrome. In addition, isoform of membrane bound CD146 is explored. The whole study is comprised by the following 3 parts: 1. To study the role of CD146 in autoimmune disease vasculitis, both soluble form of CD146 (sCD146) in peripheral blood and membrane bound form of CD146 on circulating leukocytes were evaluated respectively with ELISA kit and flow cytometry in samples from patients diagnosed with vasculitis and systemic lupus erythema (SLE). The expression of CD146 in patients circulating leukocytes was confirmed by RT-PCR with CD146 specific primers. The CD146 expression is localized only on the circulating leukocyte cell surface but not on renal biopsies from vasculits patients by immunohistochemistry, and H CD146; autoimmune disease; imaging ellipsometry; isoforms; 张佰茹博士学位论文 2006 目录 IV 目目 录录 中文摘要 I 英文摘要 II 目录 IV 文献综述 细胞黏附分子及细胞黏附分子 D146. 1 材料与方法 15 实验结果与讨论 21 第一部分：黏附分子 CD146 在血管炎中的作用 21 1. 患者临床背景. 21 2. CD146 在血管炎和 SLE 患者外周血白细胞上的动态表达及 临床意义 22 3. 血液外渗到组织中的炎细胞上 CD146 表达的缺失. 25 4. sCD146 在患者血清中的动态变化. 26 5. CD146 在健康人外周血 PMN 的诱导表达活动期血管炎 患者血清刺激以及 PSL 的作用. 30 第二部分 光学蛋白质芯片在检测脱髓鞘病患者脑脊液 sCD146 中的应用 方法的建立 33 1. ELISA对活动期 MS 和GBS患者以及正常人血清中 sCD146 进行定量分析 33 2. 光学蛋白质芯片定量检测患者脑脊液中 sCD146. 34 第三部分 CD146 亚型的研究 37 1. 三个分子量 CD146 亚型的存在. 37 2. CD146110在肿瘤血管上过量表达 38 3. 三个分子量 CD146 存在不同的唾液酸化. 41 4. CD146 转录水平上剪接 43 参考文献 49 文章发表 57 致谢 58 张佰茹博士学位论文 2006 文献综述 1 文 献 综 述 文 献 综 述 细胞黏附分子及细胞黏附分子 CD146 细胞黏附分子及细胞黏附分子 CD146 炎症，以从血液中募集白细胞到受损组织和器官为特点的疾病过程，在整个 生命过程中起着重要的作用。受损的组织器官可能是由外部损伤引起的感染、或 者自身免疫反应即自身免疫性疾病。炎症过程中，白细胞的募集是机体对抗感染 和促进伤口愈合必不可少的过程。 而白细胞在血管内皮上的运动对于其定位到炎 症部位非常关键， 目前已知许多分子参与此过程。 通过研究特定遗传缺陷的病人， 例如具有某些细胞黏附分子基因缺陷、突变或者缺失的患者伤口难愈合，有反复 感染等症状(白细胞粘附缺陷，leukocyte adhesion deficiency，LAD)，使得细胞黏 附分子在免疫系统中的作用得以认识1。细胞黏附分子（cell adhesion molecules, CAMs，以下均简称为黏附分子）是一类表达于细胞膜表面的糖蛋白。在动物机 体中，不同组织、器官的细胞有序地构成有机体依赖于不同黏附分子参与的分子 间相互作用细胞黏附分子与细胞表面分子之间的相互作用以及细胞黏附分 子与细胞外基质之间的相互作用2。在免疫系统中细胞与其它细胞或者细胞外 基质之间的相互作用至关重要，并且贯穿了整个生命活动过程。目前越来越多的 细胞黏附分子被鉴定，功能得以研究。尤其是在某些病理条件下，比如严重的感 染、自身免疫疾病、移植排斥、神经系统疾病、动脉硬化症、血栓以及肿瘤等病 理条件下，细胞黏附分子的表达调控明显处于混乱状态，这为临床诊断以及疾病 的治疗提了供新的靶标。 1.参与炎症过程的细胞黏附分子1.参与炎症过程的细胞黏附分子 在免疫系统中黏附分子的功能主要体现在三个方面：1）使得血管平滑肌附 着生长， 维持必要的细胞-细胞间交流； 2） 严格控制血管内皮细胞内外物质交换； 3） 捕获血液中的循环细胞结合到血管壁上引发血栓 （血小板细胞参与） 、 炎症 （白 细胞参与）等3。白细胞的募集是炎症反应的关键环节，这是一个有序的多步 骤过程。首先白细胞沿着血管壁（炎症部位的毛细血管末梢）滚动（滚动） ，在 滚动过程中被捕获（捕获） ，随着滚动的减慢（缓慢滚动）白细胞被牢固地黏附 到血管内皮细胞上 （牢固黏附） ， 然后穿越血管壁， 最终外渗到目标组织中去 （穿 越内皮） （整个过程见图 1） 。内皮细胞以及白细胞表面表达一系列的黏附分子参 与这一过程中。目前根据其结构、功能以及分布等信息主要将细胞黏附分子分为 四个家族：选择素家族、整合素家族、免疫球蛋白基因超家族、钙粘素家族4。 而参与炎症过程中起作用的黏附分子主要是选择素、 整合素以及免疫球蛋白基因 超家族。 细胞黏附分子 CD146 的研究在自身免疫疾病中的表达以及 CD146 的分子亚型 2 1.1 1.1 参与炎症反应的黏附分子的分类 图 1.细胞黏附分子参与炎症反应示意图 （来源 /ley/main.html，修改） (1) 选择素家族选择素家族 选 择 素 (selectins), 根 据 分 布 的 不 同 又 分 为 P-selectin(platelet) 、 E-selectin(endothelium)和L-selectin(leukocyte)。在结构上选择素是由三个不同结 构的蛋白域构成，即N端钙依赖的碳水化合物识别区，和EGF第一段重复区同源 的区域，即EGF样区，以及和补体调节蛋白同源的几个重复区域。P-选择素储存 在内皮细胞和血小板的颗粒中，一旦受到炎症刺激很快转移到膜表面发挥作用 5。E-selectin只表达于血管内皮细胞上，其表达水平受各种炎症因子的调控。 L-selectin在白细胞的多种亚群细胞上都有表达，白细胞激活后，L-selectin会迅速 从细胞表面脱落6。所有三种选择素都参与介导白细胞在内皮细胞上的滚动7, 8。选择素功能的实现需要与相应的特定配受体结合。这些配受体分子的结构还 不甚清楚，但它们有一个共同点，即具有四糖唾液酸LewisX(sLex)9。P-selectin 与配体结合在白细胞的滚动过程中起主要作用； 白细胞上的L-selectin与配体结合 后使更多的白细胞被捕获到血管内皮细胞上； E-selectin介导白细胞在炎症内皮上 张佰茹博士学位论文 2006 文献综述 3 的缓慢滚动。 (2) 整合素家族整合素家族 整合素(integrins)是由和 两个亚基构成的二聚体。和 亚基 40%-50%氨 基酸序列相同，互相组合成种类繁多的整合素分子。其中，亚基主要决定整合 素的配体结合活性， 亚基与细胞骨架结合。到目前为止至少有 19 种亚基和 8 种 亚基组成至少 25 种整合素10。整合素家族的分子根据 亚基的不同又可 以分为八个亚群，其中 1-整合素中的 链与一类命名为 VLA(very late antigen) 的亚基结合形成不同的分子，这些分子广泛地分布在组织中，主要与细胞外基 质相互作用，并被认为在伤口愈合和胚胎发生过程中的细胞迁移中起重要作用； 2-整合素因其仅表达于白细胞表面而又被称作“白细胞整合素”(leukocyte integrins),这类整合素在免疫系统中的作用非常重要，2-整合素缺陷的患者不能 正常启动中性粒的反应，从而遭受周期性的细菌感染1；3-整合素更多的表达 于淋巴和单核细胞，其功主要是控制单核细胞的运动11。在炎症反应过程中， 整合素与免疫球蛋白基因超家族的黏附分子之间的相互作用尤其重要。 (2) 免疫球蛋白基因超家族免疫球蛋白基因超家族 免疫球蛋白基因超家族(Ig-super gene family)是一类在结构上具有与 Ig 可变 区和恒定区类似的折叠结构，同时氨基酸组成上也有一定同源性的黏附分子，其 作 用 不 依 赖 于 Ca2+离 子 。 在 炎 症 过 程 中 起 作 用 的 成 员 主 要 包 括 ： ICAMs(intercellular adhesion molecules，细胞间黏附分子)、VCAM-1(vascular cell adhesion molecule-1，血管细胞黏附分子-1)，PE-CAM-1 （platelet-endothelial cell adhesion molecule-1， CD31， 血小板-内皮细胞黏附分子） 以及 MAdCAM-1(mucosal addressin cell adhesion molecule-1，粘膜地址素黏附分子-1)。 ICAMs 帮助白细胞定位到损伤组织区域。炎症过程中，ICAMs 在血管内皮 细胞上的表达受许多细胞因子包括-干扰素、 IL-1以及TNF-的调控12。 ICAMs 通过与白细胞上的整合素受体结合调节白细胞的黏附行为。在炎症中重要的 ICAMs 是 ICAM-1(CD54a)和 ICAM-2(CD102)。 ICAMs/整合素之间的相互作用在 不同的病理条件下选择募集白细胞， 为更好的研究炎症性疾病机理及治疗提供新 思路13。VCAM-1 主要表达于血管内皮细胞，与整合素 VAL-4 结合调节多种白 细胞对于激活内皮细胞的黏附14。与 ICAMs 一样，在很多炎症性疾病中都发 现有高水平的 VCAM-1 的表达15-18。 PE-CAM-1 即 CD31,大量地表达于血管内 皮上以致于现在通常被用作血管内皮细胞的标志分子。MAdCAM-1 是免疫球蛋 白基因超家族中较新的成员，它主要表达在粘膜部位的血管内皮细胞上，受体分 细胞黏附分子 CD146 的研究在自身免疫疾病中的表达以及 CD146 的分子亚型 4 别为 L-选择素和 CD49d/7。研究发现在生理条件下 MAdCAM-1 在发育的淋巴 结中起作用19；病理条件下，在肠炎中的表达异常20-22。 表 1.参与炎症反应的黏附分子 黏附分子黏附分子 其它名称其它名称 分布分布 配体配体 功能功能 CD62L P-/E-Selectin LAM-1 GlyCAM, CD14 L-selectin LECAM-1 所有白细胞 MAdCAM-1 滚动 CD62P L-Selectin PADGEM PSGL-1 P-selectin GMP-140 血管内皮细胞， 血小板 120K PSL 滚动 CD62E L-Selectin,CLA, SSEA-1 选择素选择素 家族家族 E-selectin ELAM-1 血管内皮细胞 250KD ESL 滚动 CD11a/CD18 LFA-1,L2 所有白细胞 ICAM-1, ICAM-2 黏附/迁移 CD11b/CD18 Mac-1,M2 粒细胞, 单核细胞 ICAM-1, IC3b; Fb 黏附/迁移 CD11c/CD18 P150,95; X2粒细胞, 单核细胞 IC3b; Fb 黏附/迁移 CD11d/CD18 d2 巨噬细胞 ICAM-3, ICAM-1 黏附/迁移 CD49d/CD29 VLA-4 ,d2 淋巴细胞, 单核细 胞, 嗜署红粒细胞, 嗜碱细胞 VCAM-1 细胞外基质 黏附 整合素整合素 家族家族 CD49d/7 47 淋巴细胞 VCAM-1 MAdCAM-1 fibronectin 黏附 CD11a/CD18 ICAM-1 CD54a 血管内皮细胞,单核 细胞 CD11b/CD18 黏附/迁移 ICAM-2 CD102 血管内皮细胞 CD11a/CD18 黏附/迁移 VCAM-1 CD106 血管内皮细胞 CD49d/CD29 黏附 PE-CAM-1 CD31 血管内皮细胞, 白细 胞, 血小板 PE-CAM-1 黏附/迁移 免疫球蛋 白基因 免疫球蛋 白基因 超家族超家族 MAdCAM-1 （肠）血管内皮细胞L-selectin ,D49d/7 黏附/迁移 1.2 1.2 自身免疫疾病与细胞黏附分子 张佰茹博士学位论文 2006 文献综述 5 自身免疫疾病实质是失控的炎症。 尽管到目前为止有关的致病机理及病原尚 不清楚，但免疫系统的失控最终导致组织损伤已是共识。激活的白细胞在其中扮 演关键的角色，与普通炎症反应不同的是它们的目标是自身组织。目前已知白细 胞迁移并穿越血管壁进入炎症部位由内皮细胞和白细胞表达的黏附分子间的相 互作用调控， 而在自身免疫疾病等慢性炎症性疾病的过程中， 这个调控机制失控。 在疾病的非活动期白细胞并不会黏附到血管内皮上，一旦疾病处于活动期，免疫 系统被激活，释放各种炎症因子，从而诱导内皮细胞表达黏附分子，促进外周血 中激活的白细胞黏附到内皮并外渗到外周组织中去，造成组织损伤。 1.3 1.3 针对细胞黏附分子的免疫治疗在自身免疫疾病中的应用 到目前为止应用免疫学方法抑制慢性炎症反应， 而同时又不干扰全身免疫方 面的研究进展缓慢。但个别成功的案例使得这一方向倍具吸引力。例如抗体特异 性阻断肿瘤坏死因子 TNF 和其可溶受体的相互作用在风湿性关节炎的治疗中 取得了相当显著的效果23，并已经通过美国 FDA 认证投放市场。针对黏附分 子的免疫治疗也是一个有希望的治疗策略。 由于黏附分子在从血液中募集白细胞 至炎症组织的过程中起作用，那么阻断特定的黏附分子配受体间相互作用，白细 胞是否就不会到达炎症部位产生伤害了呢？这个想法的却很有吸引力， 起码在动 物模型上获得了很好的效果24-28。其中应用较多的阻断剂是单克隆抗体。现在 的生物学技术较之以往有了巨大的进步，单克隆抗体的获得、人源化、以及大量 制备技术日渐成熟，这为阻断黏附分子的抗体治疗提供了良好的技术基础。 .1 抗黏附分子的治疗性抗体在炎症性疾病中的应用情况 针对选择素的抗体阻断治疗虽然在某些动物模型中取得了良好的效果， 但在 临床治疗上至今未获得有效的结果29。特定阻断某一种选择素在治疗上的失败 显示了不同选择素或其他黏附分子在白细胞迁移过程中功能的冗余。例如，T- 细胞在某些情况下还可以借助 VCAM-1/VLA-4 完成滚动30。而一次阻断一个 以上的选择素倒是可以有效地抑制 T-细胞迁移到炎症组织， 但同时也增加了感染 的风险。实验证明同时缺失 E-selectin 和 P-选择素的小鼠在白细胞外渗方面有严 重的缺陷并极易发生细菌感染31。 针对整合素以及免疫球蛋白基因超家族的抗体治疗经历了一系列尝试， 很多 单克隆抗体上了一期、二期甚至三期临床但最后都没有结果。抗 ICAM-1 的单克 隆抗体 enlimomab 被用来治疗肾移植排斥和风湿性关节炎， 后来发现伴有明显的 副作用，患者外周血白细胞明显升高，研究表明这可能和抗体的 Fc 段有一定的 关系32。目前还有另外一些抗体处于不同的试验阶段。针对整合素的抗体治疗 细胞黏附分子 CD146 的研究在自身免疫疾病中的表达以及 CD146 的分子亚型 6 在最近几年应用于自身免疫疾病的治疗中取得了一些进展。 已经有几株抗体通过 认证应用于临床的治疗。例如抗 CD11a 的人源化单克隆抗体 efalizumab 在牛皮 癣 的 治 疗 中 取 得 了 显 著 的 疗 效 ， 并 通 过 了 美 国FDA认 证 ： /cder/foi/appletter/2003/125075-0ltr.pdf。抗 4-整合素人源化单 克隆抗体 Natalizumab 在治疗多发硬化症方面有显著效果，并于 2006 年 6 月 5 日通过 FDA 认证，被限定用于复发型多发硬化症患者的临床辅助治疗 （/cder/drug/infopage/natalizumab/default.htm） 。抗黏附分子的 治疗性抗体在炎症性疾病中取得了上述成就，为该类疾病的治疗带来了新的希 望。 然而现有的抗体免疫治疗仅对累及某一特定器官的自身免疫疾病有一定的疗 效如风湿性关节炎、多发硬化症等，而针对系统性的自身免疫疾病如系统性血管 炎、系统性红斑狼疮等目前还未取得实质性进展。 表 2. 治疗性细胞黏附分子单克隆抗体在炎症性疾病中的应用 黏附分子黏附分子 抗体特性抗体特性 抗体名称抗体名称 公司公司 临床阶段临床阶段 状态状态 选择素家族选择素家族 P-selectin E-selectin 人源化 mAb HuEP5C7 (SmartTM) Protein Design Labs 期临床 P-selectin mAb CY1747 Epimmune 动物实验 L-selectin mAb DREF200 Boehringer 动物实验 整合素家族整合素家族 2-整合素 人源化 mAb Rovelizumab (LeuArrestTM) Icos 期临床 2-整合素 人源化 mAb Erlizumab Genentech Roche 期临床 L-整合素 mAb Odulimomab (AntifaR) Aventis Pasteur Sangstat 通过法国认证， 1997 L-整合素 人源化 mAb Efazulimab (RaptivaR) Genentech Xoma 通过美国 FDA 认证，2003 4-整合素 mAb natalizumab Elan, Biogen 通过美国 FDA 认证，2006 47-整合素 人源化 mAb MLN02 (LDP02) Genentech Millenium 期临床 ? 张佰茹博士学位论文 2006 文献综述 7 免疫球蛋白基因超家族免疫球蛋白基因超家族 ICAM-1 mAb Enlimomab Boehringer 期临床 注：mAb，鼠单克隆抗体；：研究终止；：通过认证，商品化；？：目前还没有进一步的信息 1.3.2 1.3.2 抑制黏附分子治疗存在的问题及前景 除了抗体治疗还有其它针对黏附分子的治疗策略如反义 RNA 或针对受体结 构的一部分合成小分子类似物等，也显示出了一定的疗效33。上述所有的这些 治疗方案虽然给自身免疫疾病的治疗带来了新的希望，但是有两点值得特别注 意：首先，这些黏附分子在白细胞募集过程中起重要作用，比如 4-整合素分子 不仅在某个组织部位起作用，阻断该分子途径就会产生感染的问题。事实上在两 名多发硬化患者阻断 4-整合素分子的治疗过程中就出现了上呼吸道感染的现 象；另外一点是如果停止治疗，白细胞又会回到炎症部位，损伤组织。这种现象 也在部分病人临床的间断给药中间发生了34。解决这些问题有赖于基础研究的 深入，更清楚地了解疾病的发生机制和病理过程，尤其是不同炎症性疾病之间不 同黏附分子信号之间选择，从而使治疗目标更有针对性。 1.4 1.4 细胞黏附分子的分子亚型 细胞黏附分子大都存在不同形式的分子亚型。他们由同一个基因编码，通过 基因水平的选择剪接和/或转录后的修饰产生不同的分子形式。著名的神经细胞 黏附分子 NCAM 存在多种分子亚型，有研究表明在大鼠心脏发育过程中至少有 27 种 mRNA 剪接产生的 NCAM 亚型35。就大多数黏附分子而言至少有两个亚 型：结合在细胞膜上的膜结合形式上以及以截短的可溶性形式，即可溶性细胞黏 附分子（soluble cell adhesion molecule, sCAM）存在血清和其它体液中。 从结构上来讲 sCAM 一般缺少其对应的膜结合形式的跨膜区和胞内区，因 此分子量要小一些。sCAM 不仅仅是相对应膜结合亚型的简单的截断，它们也有 多种形式。如血清中可溶性 L-selectin 有 62kDa 和 75100kDa 两种亚型，这两种 亚型主要是由转录后的修饰糖基化的不同造成36。 而可溶性 P-selectin 是通 过转录水平的选择性剪接直分泌到细胞外37, 38。除了这种转录水平的直接调 控产生 sCAM 的机制外， 有的 sCAM 是由于酶切从细胞表面脱落至血液中去的。 sCAM 的产生受多种因子调控。体外培养的血管内皮细胞用 IL-1、TNF- 等 细胞因子刺激后 24 小时可以在上清中检测到可溶性 E-selectin39； 用 IFN-beta1b 治疗多发硬化患者，会引起 sICAM-1 短期的升高40。一些研究发现激素药物治 疗也也会改变 sCAM 的水平41-43。正是由于炎症过程中黏附分子的表达受到 细胞黏附分子 CD146 的研究在自身免疫疾病中的表达以及 CD146 的分子亚型 8 细胞因子和其他调控因子的调节， 对于黏附分子表达水平的定量可以间接提供炎 症的信息。研究表明 sCAM 不仅改变了脱落细胞的黏附特性及细胞信号传导的 途径，还作用于临近细胞，发挥抗炎或促炎以及促进细胞增值的作用44。目前 已经有很多商用 ELISA 试剂盒可以定量检测到血液中 sCAM 的水平。关于这方 面的研究也有大量的报道。例如最近的较全面研究 sCAM 包括 sICAM-1、 sVCAM-1、 sE-selectin 以及 sP-selectin 在炎症性血管疾病中表达水平的报道45， 与前人发现类似作者发现在系统性红斑狼疮、 巨细胞动脉炎和肾小球肾炎患者中 sVCAM-1 和 sE-selectin 较之健康人有明显的升高； sP-selectin 在风湿性关节炎患 者中有显著上升。同时，血清中 sCAM 的水平在患者和健康志愿者之间没有明 显的域值，因而无法用于区别健康人和患者的个体检测。因而只能反映出疾病群 体的信息，并对于探索疾病机理有所帮助。这可能是为什么有如此多的报道 sCAM 在疾病中的意义，却至今未得到应用的原因。 因为血清水平的sCAM存在上述问题，因此许多研究寻求对其它体液中的 sCAM进行定量分析。因为某些sCAM还可以在脑脊液、肺泡灌洗液、尿、滑膜 液以及腹水中出现，反映局部黏附分子的表达和代谢情况。某些炎症情况下局部 sCAM更能反映疾病情况，如风湿性关节炎患者的滑膜液，脱髓鞘病患者的脑脊 液等。 研究表明sICAM-1的脑脊液水平比血清水平更能反映血脑屏障的破坏程度 46。然而也有结果显示sICAM-1，sVCAM-1和sE-selectin中只有鞘内合成的 sVCAM-1与多发硬化相关且只与复发-延缓型疾病相关47。关于这方面的研究 尚存在争论，不同研究者得到的结论往往相互矛盾。这与自身免疫疾病的复杂性 有关， 不同的发病时期， 对药物反应个体差异等因素有关。 因此大量的临床样品， 详细的分类以及更长时间的临床追踪对于相关研究都非常重要。 同时敏感可靠的 检测方法也是至关重要。随着纳米科技的发展，各种纳米传感器被应用到了生物 领域，这为局部sCAM的检测带来了新的希望。 综上所述可以看出， 可溶性黏附分子对于更好的理解研究黏附分子功能以及 黏附分子的调控机制从而更深入了解黏附分子在疾病过程中的作用有重要意义。 1.5 1.5 黏附分子的其它生物学功能 除参与免疫反应外，黏附分子还参与胚胎的发育与分化、正常组织结构的维 持、以及肿瘤的浸润和转移等多种生理病理过程。在胚泡植入过程中，母体子宫 大多数时候排斥胚泡的植入，只有在特定的窗口才能接受胚泡的植入。在植入窗 口期，子宫上皮特异性地表达某些粘附分子，介导胚泡和子宫上皮的粘附48。 在胚胎发育过程中涉及许多细胞的迁移以及相互识别， 这对发育的神经系统尤其 重要。黏附分子对于发育过程中神经细胞的迁移起重要的识别作用49, 50。另 张佰茹博士学位论文 2006 文献综述 9 有大量的证据表明在肿瘤发生成过程中， 细胞间某些黏附分子的缺失以及与血管 作用的黏附分子的高表达在肿瘤的转移中起重要的作用51。 2.2. 细胞黏附分子 CD146 CD146 CD146（MUC18、A32 抗原、MCAM、Mel-CAM、S-Endo-1 和 P1H12）是 免疫球蛋白基因超家族成员52，最初被鉴定为黑色素瘤转移的标志分子 53-56， 后来的研究证明该分子还是一个内皮细胞黏附分子57-59，并被统一 命名为 CD146。 2.1 CD1462.1 CD146 的结构 CD146 是细胞表面单链跨膜糖蛋白，胞质部分相对较短，拥有潜在的蛋白 激酶识别位点，胞外区有典型的 V-V-C-C-C 的类 Ig 结构区，折叠由 4370 个氨 基酸组成(图 2)。因为 折叠之间的二硫键使得结构很稳定。CD146 分子高度糖 基化，约 35 的分子量是由唾液酸及其它碳水化合物半糖组成，其中寡唾液酸 占大约 20%左右，构成 CD146 唾液酸末端55。 图 2. CD146 分子结构示意图 2.2 CD1462.2 CD146 的分布 CD146 分子分布在有限的正常和恶性肿瘤组织中，除了在黑色素瘤细胞上 表达，还在血管内皮细胞、植入位点中间滋养层细胞、毛囊的外部基壳、乳腺上 皮等部位表达。研究表明 CD146 在慢性阻碍性肺病的支气管上皮细胞上的表达 显著提高。 在肿瘤组织中， 几乎所有的黑色素瘤、 血管肉瘤、 平滑肌肉瘤、 Kaposis 肉瘤、胎盘滋养层细胞瘤和绒毛膜癌都表达 CD146 分子。另外，某些肺鳞片细 胞癌和小细胞肺癌、唾液腺上皮癌、浸润性乳腺癌有微弱的局部 CD146 阳性。 同一肿瘤的不同位置和不同肿瘤之间 CD146 表达密度都有差异。CD146 分子分 细胞黏附分子 CD146 的研究在自身免疫疾病中的表达以及 CD146 的分子亚型 10 布在有限的正常和恶性肿瘤组织中60-64，主要在内皮细胞、植入位点中间滋养 层细胞、毛囊的外部基壳、乳腺上皮、激活 T 细胞等正常部位，和黑色素瘤、前 列腺癌、 骨肉瘤等恶性肿瘤组织上表达。 需要特别指出的是在内皮细胞上的定位， 不同的研究报道结果不同。目前认为是不同的抗体所致，但其深层次的原因有待 研究。 2.3 CD1462.3 CD146 的生物学功能 .1 在肿瘤生长和转移中的作用 CD146 广泛表达于黑色素瘤细胞，其表达情况与黑色素瘤的转移潜力直接 相关53, 54, 65。 转移性的黑色素瘤细胞通常高表达 CD146 分子， 而侵袭性差的 黑色素瘤细胞上 CD146 缺失。大多数黑色素瘤细胞表面同时表达 CD146 及其受 体，但是二者的相互作用在不同肿瘤中产生相反的结果。例如，CD146 在黑色 素瘤中的过度表达会引起肿瘤的快速生长和转移。 如果下调转移性黑色素瘤细胞 CD146 的表达则导致黑色素瘤细胞之间黏附受抑，降低肿瘤的发生66。这说明 CD146 及其受体介导的黑色素瘤细胞-内皮黏附可能是肿瘤转移过程中的重要机 制。与黑色素瘤不同，CD146 在乳腺癌的转移过程中起负调节作用：CD146 表 达于正常和良性增生的乳房上皮细胞,但在侵袭性乳腺癌中缺失。CD146 在不同 肿瘤发展中的矛盾作用反映出肿瘤生物学本身的矛盾性。细胞之间、细胞与基质 之间的作用随时空改变会发生明显变化， 是多种不同黏附分子与细胞因子的共同 调控的结果。 由于在人黑色素瘤上特异高表达，CD146 分子在发现之初被命名为黑色素 瘤细胞黏附分子（Mel-CAM） ，这也预示了它与肿瘤发生发展的密切关系。最近 的研究报告显示一株抗 CD146 的全人抗体 ABX-MA1 能显著抑制黑色素瘤和骨 肉瘤的血管生成、生长和转移67, 68。CD146 还在另外几种肿瘤上高表达，包 括腮腺表皮状粘液瘤、非小细胞肺癌、骨肉瘤。在骨肉瘤中，CD146 的表达水 平与肿瘤发展、转移能力直接相关。以上结果说明在高表达 CD146 的黑色素瘤 及某些其它肿瘤中，该分子对于肿瘤生长、转移起着重要作用。在此同时，作者 实验室揭示了 CD146 在肿瘤血管生成过程中的功能，发现 CD146 分子过量地表 达于肿瘤血管并参与血管生成。 CD146 特异性单克隆抗体 AA98 能有效抑制血管 生成和多种肿瘤的生长和转移69。 2.3.2 CD1462.3.2 CD146 是否参与炎症反应？ 虽然发现之初被视为黑色素瘤转移的标志分子，不久以后研究发现 CD146 分子还是一个表达于血管内皮细胞的 CD 分子， 参与形成血管内细胞的黏附连接 张佰茹博士学位论文 2006 文献综述 11 59。1997 年 Pickl 等发现用 PHA 体外刺激后 T-细胞表达 CD146，并从风湿性 关节炎患者的滑膜液中分离到 CD146 阳性的 T-淋巴细胞， 证明 CD146 是 T-细胞 的激活抗原62。但是该结果缺乏后续报道，甚至有报道结果恰恰与其相反， Neidhart 等同样分离风湿性关节炎患者的滑膜液中的白细胞，但并没有发现其中 存在 CD146 阳性的 T-细胞存在70。这可能与分离手段、患者个体差异以及治 疗与否等因素有关。CD146 参与免疫反应的另一个证据是发现它在胸腺中的表 达， 通过免疫组化和免疫电镜技术发现在胸腺中除了毛细血管以及血管平滑肌表 达 CD146 外，在未成熟胸腺细胞、巨噬细胞也表达 CD146 分子71。最近的研 究发现 CD146 在健康人外周血淋巴细胞中的一小部分亚群细胞上有表达，分离 健康人淋巴细胞进行培养，在有丝分裂元和 IL-2 刺激后，T-细胞表面的 CD146 无论是表达数量还是表达强度都有明显增加，证明了 Pickl 的研究结果72。虽 然现有这些研究结果都强烈地暗示了 CD146 可能在免疫系统中起某种作用并且 很可能与炎症进程密切相关，但到目前为止还未见相关研究报道。 2.4 CD1462.4 CD146 亚型 根据目前报道 CD146 分子与大多数的细胞黏附分子一样有两种亚型，一种 是膜结合形式的另一种是可溶形式的。膜结合 CD146 报道较多，所涉及的研究 主要与肿瘤和血管有关。可溶性的 CD146 近几年才有研究，主要是关于各种炎 症。目前还没有在一个研究中同时涉及两种形式 CD146 的报道。 .1 可溶性 CD146(soluble CD146，sCD146)CD146(soluble CD146，sCD146) sCD146 在体外培养的 HUVEC 细胞培养上清中可以检测到，其分子量较之 膜结合形式的 CD146 小 10kDa 左右73。与其它 sCAM 一样，sCD146 与病理过 程密切相关。有研究发现 sCD146 在风湿性关节炎患者的滑膜液中有病性升高， 这是最早的关于 sCD146 与在慢性炎症中的报道，作者认为 sCD146 与受累组织 的血管生成有关70。Bardin, N.等在 2003 年开发出首个商品化的检测 sCD146 双抗夹心试剂盒， 检测发现 sCD146 同样存在于正常人外周血中， 并发现 sCD146 在慢性肾衰竭患者中有明显升高74。还有报道表明 sCD146 在女性妊娠失败的 和慢性肠炎患者体内有显著性升高75, 76。 但是 sCD146 在上述病理条件下的升 高与临床指标之间并没有相关性（如风湿性关节炎中的血沉、C 反应蛋白等炎症 指标） ，因而 sCD146 更多地被认为是血管内皮细胞激活的潜在标志分子。 目前可以得到的检测 CD146 商用试剂盒只有上文提到的由 Biocytex 公司生 产的一种。该试剂盒检测血清中的 sCD146 重复性很好，很稳定，缺点是不够敏 感， 检测的下限是 100ng/ml。 这样的灵敏度很难应用到局部合成 sCD146 的检测， 细胞黏附分子 CD146 的研究在自身免疫疾病中的表达以及 CD146 的分子亚型 12 比如对风湿性关节炎患者滑膜液和脱髓鞘病患者脑脊液中 sCD146 的定量分析。 根据报道风湿性关节炎患者滑膜液中升高在 5115 ng/ml70，目前的商用 sCD146 检测试剂盒无法检测。因此研究开发更为灵敏的检测方法非常必要。 .2 膜结合形式 CD146CD146 是否存在不同的亚型？ 在禽类和啮齿类中存在与 CD146 的同源分子，它们的膜结合形式的分子存 在 RNA 水平的剪接产生长短不同的分子亚型77, 78。同时综合目前 CD146 研 究小组的结果发现，不同的研究小组利用不同的抗 CD146 的单克隆抗体所得到 结果有很多不一致的地方。不禁使人产生疑问：膜结合形式 CD146 是否存在不 同的亚型？ 目前 CD146 研究主要集中在两个方向：黑色素瘤和血管。Johnson, JP 等用 MUC18 抗体鉴定的 CD146 分子在非还原条件下分子量为 98kDa56，免疫组化 显示 MUC18 抗原仅在 CD31 阳性某些毛细血管和血管平滑肌上表达，在动脉、 静脉内皮细胞血管内皮细胞上不表达 CD146 分子54。Shih Ie-Ming 等发现了一 个 A32 抗原，N-端测序证实 A32 抗原与 MUC18 抗原相同为 CD146 分子。A32 抗原在非还原条件下分子量 113kDa55。免疫组化结果表明 A32 抗原不仅象 MUC18 表达于恶性黑色素瘤，在良性的黑色素瘤上也有表达。而 Bardin, N 等用 单克隆抗体 S-endo 1 鉴定的 CD146 分子量在非还原条件下大约是 118120kDa， 免疫组化结果显示 S-endo 1 抗体识别的 CD146 分子表达于所有的血管内皮细胞 上，不因解剖部位不同有任何差异，在血管平滑肌上表现很弱的阳性57, 58， 这与另一个抗 CD146 的单克隆抗体 P1H12 的结果类似79。最近发表的文章报 道单克隆抗体BT14和L101识别一个130kDa糖蛋白gp130在一些肿瘤中过表达， 经过 20 多年的努力终于揭开了这个分子神秘面纱，测序结果表明 gp130 就是 CD14680， 免疫组化显示 gp130 在所有血管上都有染色。 而我们得到的抗 CD146 鼠单克隆抗体 AA98 识别从血管内皮平滑肌中纯化 CD146 在非还原胶上 97kDa。 通过以上的描述可以知道，目前报道的 CD146 有三个分子量：9798kDa、 110113 kDa 和 120130 kDa，三个分子量的 CD146 有着不同的组织分布。提示 膜结合 CD146 很可能存在不同的分子亚型，可能是由于不同的糖基化或者是 RNA 水平的剪接或者二者兼而有之。但是目前报道还没有一个抗体可以同时识 别三个分子量的 CD146，因此是否存在不同膜结合形式的 CD146 亚型还有待于 进一步的研究鉴定。 .3 鼠抗人 CD146CD146 单克隆抗体 AA98AA98 笔者所在实验室用肝癌培养上清刺激的人脐带静脉内皮细胞免疫小鼠， 进行 张佰茹博士学位论文 2006 文献综述 13 筛选得到一株特异识别 CD146 分子的单克隆抗体 AA98(mAb AA98)69。 Western-blot 显示在还原条件下 mAb AA98 识别血管平滑肌来源地 CD146 为 97kDa。研究发现 mAb AA98 识别所有的恶性肿瘤血管，但是在正常组织血管上 只识别 CD31 阳性的某些血管（mAb AA98 检测 CD146 在人正常组织和肿瘤组 织血管以及细胞系上的表达情况见表 3） 。据此猜测 CD146 可能参与肿瘤血管生 成， 并通过一系列实验证实了这一猜想。 动物实验和体外细胞实验结果表明 mAb AA98 可以抑制内皮细胞的增殖和迁移，并且通过抑制血管生成而抑制肿瘤的生 长，具有潜在的治疗作用。此外，我们用 AA98 为工具研究 CD146 在胚胎植入 中的作用，并