肿瘤细胞迁移过程中CD146的功能及作用机理研究

分类号 分类号 密级 密级 UDC 编号 编号 中国科学院研究生院 博士学位论文 中国科学院研究生院 博士学位论文 肿瘤细胞迁移过程中肿瘤细胞迁移过程中 CD146 的功能的功能 及作用机理研究及作用机理研究 张 锦 彬 指 张 锦 彬 指 导导 教教 师师 阎 锡 蕴 研究员 阎 锡 蕴 研究员 中国科学院生物物理研究所 中国科学院生物物理研究所 申请学位级别 博士 申请学位级别 博士 学科专业名称 生物化学与分子生物学 学科专业名称 生物化学与分子生物学 论文提交日期 论文提交日期 2008 年 5 月 1 日 2008 年 5 月 1 日 论文答辩日期 论文答辩日期 2008 年 6 月 12 日 2008 年 6 月 12 日 培 培 养养 单单 位 中国科学院生物物理研究所 位 中国科学院生物物理研究所 学位授予单位 中国科学院研究生院 学位授予单位 中国科学院研究生院 答辩委员会主席 答辩委员会主席 张锦彬博士学位论文 2008 摘要 I 摘 要 摘 要 细胞粘附分子 CD146 是黑色素瘤的标志分子，在肿瘤细胞的迁移过程中发 挥着重要的功能， 但其作用机理尚不清楚。 针对这一问题， 本论文分别从与 CD146 胞外区结合的上游分子以及 CD146 胞内区的下游结合蛋白两个方面探讨了 CD146 在细胞迁移中发挥作用的分子机制。 通过免疫共沉淀实验我们首次证明了 CD146 可以与 actin 结合，并且发现这 种结合是通过膜突蛋白 Moesin 介导的。免疫荧光的结果显示，CD146-Moesin 复 合物在运动中的细胞内呈现极性分布， 并主要集中于丝状伪足等与细胞的运动功 能密切相关的区域。 下调 CD146 的表达或竞争抑制 Moesin 的功能均可以导致丝 状伪足的长度及数量的减少，并且显著抑制黑色素瘤细胞的迁移。除了直接与 Moesin 结合，CD146 还可以引起 Moesin 的活化，具体表现为 Moesin 磷酸化水 平的升高及膜定位与极性分布的增强。使用 Moesin 的上游分子 ROCK 及 p38 MAPK 的抑制剂不能抑制这一现象， 说明 CD146 可能通过 PKC 或其它信号通路 来促进 Moesin 的活化。 我们的研究提出了 CD146 促进黑色素瘤细胞迁移的一个 可能机制： 即 CD146 通过上调 Moesin 的磷酸化， 一方面促进了 Moesin 与 CD146 及其它粘附分子的结合，并藉此介导细胞膜与细胞骨架的相互作用，促进细胞的 极化；另一方面活化的 Moesin 可以促进 Rho GTPases 的活化，由此引发 actin 细 胞骨架的重排，最终促进细胞的迁移。 除了寻找下游蛋白，对 CD146 上游结合分子的鉴定也是探讨 CD146 作用机 理必不可少的一部分。我们以 CD146 的胞外区片段（sCD146）作为探针，通过 Far-Western Blot 实验检测了其与 A375、 Mel888+和 ECV304 细胞内蛋白的结合情 况， 发现 sCD146 可以识别一个分子量约 130 kD 的蛋白。 进一步通过 His-tag pull down 实验发现该蛋白是细胞自身表达的 CD146。 这表明 CD146 具备同亲性相互 作用的能力。这一发现与 CD146 所属的免疫球蛋白超家族中部分成员同时具有 同亲性及异亲性结合活性的特点相一致。 和很多粘附分子类似，CD146 也同时存在可溶型及膜结合型两种形式。研 究表明，外周血、脑脊液中可溶型 CD146 的含量与一些自身免疫疾病息息相关。 在利用 CD146 抗体 AA98 建立临床样品中可溶型 CD146 的检测方法时，我们意 外发现通常被认为化学反应惰性的 Fe3O4磁性纳米颗粒（MNPs）具有类似过氧 肿瘤细胞迁移过程中 CD146 的功能及作用机理研究 II 化物酶的催化活性， 并进一步将这种催化活性应用于有毒有害物质的氧化和降解 中。该方法具有成本低廉、稳定性好、无二次污染以及可回收反复使用的优点， 在环境保护及工业生产等多个领域具有广泛的潜在应用价值。 关键词关键词：CD146，Moesin，actin，磷酸化，肿瘤细胞迁移 张锦彬博士学位论文 2008 Abstratct III Abstract Jinbin Zhang (Biochemistry and Molecular Biology) Directed by Xiyun Yan Adhesion molecule CD146 is a marker of melanoma cells, which has been proved to paly a pivotal role in cell migration. Nevertheless, how CD146 involved in cell migration still remains unclear. Here we intended to elucidate that underlying mechanism by finding the downstream molecules that could bind to the cytoplasmic region of CD146 as well as by identifying the extra-cellular binding partner which initiated this process. By immunopreciation assay, we gave the first direct evidence for the association between CD146 and actin. Furthermore, we found that this interaction was mediated by the membrane-organizing extension spike protein (Moesin) which usually serves as a bridge between membrane proteins and actin cytoskeleton. Immunofluorescence results showed that both CD146 and moesin were polarized on plasma membrane and colocalized especially in filopodia which usually indicates the direction of cell movement. Either CD146 knockdown or competitive inhibition of moesin led to interruption of filopodia formation and reduced cell mobility. Furthermore, CD146 could also enhance the phosphorylation and polarized redistribution of Moesin. This process could not be inhibited by ROCK or p38 MAPK inhibitors, suggesting that CD146 induced the activation of moesin via PKC or other pathways. As well as figuring out the downstream signaling cascades, identifying the upstream binding partner is also very important. We tested the binding ability of the extracellular region of CD146 (sCD146) to the cell lysate of ECV304, Mel888 and A375 which had been proved to express CD146 ligand. Far-Western blot assay showed that sCD146 could bind a 130 kD protein, which was further identified to be the CD146 expressed in the cell by His-tag pull down assay. This finding suggested the homophilic interactions between CD146 molecules, which was consistent with the observation that many cell adhesion molecules of the Ig superfamily demonstrate both homophilic and heterophilic interactions. As well as lots of adhesion molecules, CD146 presents both soluble and membrane 肿瘤细胞迁移过程中 CD146 的功能及作用机理研究 IV integral forms. The increased soluble CD146 level was correlated with some autoimmune diseases such as RA and Chronic Renal Failure. During the establishment of soluble CD146 detection system by means of magnetic enrichment, we found by chance that the Fe3O4 magnetic nanoparticles (MNPs) possess an intrinsic peroxidase-like catalytic activity. By using phenol as an example, we further explored MNPs application in degrading organic pollutions in wastewater, which showed many attractive features such as easy preparation, low cost, thermo-stability and reusability when compared with traditional catalysts. Keywords: CD146, Moesin, Actin, Phosphorylation, Migration 张锦彬博士学位论文 2008 目录 V 目 录 目 录 中文摘要 I 英文摘要 目录 文献综述 第一部分 ERM 的结构与功能 1 1 ERM 的结构特征与构象转换 1 2 与 ERM 有关的信号通路 3 3 ERM 可以与多种膜蛋白结合 5 4 问题与展望 6 第二部分 粘附分子 CD146 与细胞迁移 8 1 CD146 的结构与功能 8 2 CD146 的作用机理 9 3 寻找 CD146 配体的研究 10 3 问题与展望 11 研究内容 第一部分 CD146 在肿瘤细胞迁移中的作用机理研究 12 1 材料与方法 13 2 实验结果 18 3 讨论 30 第二部分 CD146 配体的研究 32 1 材料与方法 33 2 实验结果 35 3 讨论 38 第三部分 磁性纳米颗粒的催化活性研究 40 1 材料与方法 41 2 实验结果 43 3 讨论 53 参考文献 54 发表文章 60 致谢 61 肿瘤细胞迁移过程中 CD146 的功能及作用机理研究 2 文献综述文献综述 第一部分第一部分 ERM 的结构与功能的结构与功能 定向的细胞运动即细胞迁移是胚胎发育、 创伤修复以及免疫调节等生理现象 的基础，而细胞迁移调控的异常往往与一些疾病的恶化有关，其中最典型的例子 便是肿瘤的侵袭与转移1-3。细胞迁移是一个高度整合的过程，包括伪足伸出、 粘着斑形成、胞体牵拉以及后端剥离四个步骤4。其中第一步主要靠膜表面受 体或粘附分子通过各种 adaptor 促进肌动蛋白在迁移前缘的聚合来推动。 而 ERM （Ezrin/Radixin/Moesin） 蛋白家族便是其中起着调节细胞膜与细胞骨架相互作用 的关键分子5。 ERM 家族包括三个成员，即 Ezrin、Radixin 和 Moesin。它们具有高度的同 源性和功能上的相似性，只是在物种、组织及细胞分布特异性上有所不同。对 ERM 基因敲除小鼠的研究表明，单独敲除任何一个基因的表达并不会产生明显 的表型6, 7，说明他们在功能上存在冗余。但是在不表达 Ezrin 和 Radixin 的果 蝇中，对 Moesin 基因的敲除会引起 actin 骨架组织的异常，导致胚胎发育过程中 细胞极性的消失，并且是致死性的8。这表明它们在维持细胞基本的生理功能 上具有非常重要的作用。 ERM 蛋白的主要功能是介导膜蛋白与 actin 骨架的结合， 从而在细胞的迁移 中具有重要作用。一方面，它们可以通过 Rho GTPases 信号通路参与调控细胞表 面突出结构的形成，例如上皮细胞微绒毛（Microvillus）的生成及成纤维细胞丝 状伪足和片状伪足的伸出9-11；另一方面，它们还可以介导多种粘附分子与细 胞骨架蛋白的结合，从而在细胞与胞外基质的粘附中发挥重要作用12。最近的 研究表明，除了与 F-actin 的作用，ERM 还参与微管合成的动态调控。Naghavi 等人发现，Moesin 的高表达会抑制微管的聚合并抑制逆转录病毒对细胞的侵染 13。在本部分综述中，我将分别从 ERM 蛋白发挥功能的结构基础、调控机制 以及与之相互结合的蛋白三个方面阐述 ERM 蛋白在细胞迁移中的作用。 1. ERM 的结构特征与构象转换的结构特征与构象转换 ERM 所具有的这种同时结合膜蛋白与 F-actin 的功能与它自身的结构特点是 张锦彬博士学位论文 2008 文献综述 3 分不开的。由于 ERM 在结构上高度相似，下面我们以 Moesin 为例介绍 ERM 的 结构特征。 Moesin 全长共 577 个氨基酸，分子量约 78 kD，包括 3 个结构域（图 1） ：N 端的 FERM（Four-point-one, ERM）结构域（1-297 aa） ，中间的 螺旋结构域以 及 C 端的 C-ERMAD（C-ERM-association-domain）结构域（467-577 aa） 。其中 FERM 结构域又分为 F1、F2 与 F3 三个 module，它们分别与泛素、乙酰辅酶 A 结合蛋白、PTB 结构域（phosphotyrosine binding domain）具有高度的同源性， 提示 FERM 结构域具有与多种膜蛋白结合的能力14。 C 端的 C-ERMAD 结构域 具有结合 F-actin 和 FERM 的双重功能：在大多数情况下，C-ERMAD 可以与 FERM 紧密地结合再一起，从而掩盖了 FERM 与膜蛋白的结合位点，使 Moesin 处于非活化的状态；当有信号刺激细胞引起 Moesin 的活化时，C-ERMAD 则可 以与 FERM 解开并与 actin 结合，同时 FERM 也可以与膜蛋白结合15。Moesin 的这种构象转换是其调节细胞膜与细胞骨架相互作用的分子基础。 图 1. Moesin 的结构特征（引自 J. Mol. Biol. 2007: 365, 1446） 图 2. Moesin 的构象转换（引自 Cell 2000, 101: 259） 目前已知的 Moesin 与膜蛋白的结合有两种方式：一种是通过 FERM 结构域 直接与型膜蛋白的 C 端结合；另一种是通过接头蛋白如 EBP50（Ezrin binding phosphoprotein 50）与七次跨膜的型膜蛋白结合。不管哪种方式，Moesin 的构 Phosphorylation Actin Filament Dormant Moesin Activated Moesin Type membrane protein 肿瘤细胞迁移过程中 CD146 的功能及作用机理研究 4 象转换都受到其 C 端 Thr558残基的磷酸化和磷脂酰肌醇 4，5 二磷酸（PIP2）的 影响。 大量证据表明，Moesin C 端 558 位苏氨酸残基的磷酸化对于其活化是必需 的16-18。如果将该位点的 Thr 突变为 Asp，即模拟持续磷酸化的状态，可以促 进细胞表面微绒毛的形成；而将 Thr 突变为不能被磷酸化的 Ala，则会抑制这一 活性19, 20。此外，人们发现全长 Moesin 只有在磷酸化以后才能结合于 actin， 但是单独的C-ERMAD结构域与actin的结合并不依赖于Thr残基的磷酸化18, 21, 22。这说明该保守位点的磷酸化只是对 Moesin 自身构象有影响，而与 Moesin-actin 之间的亲和力无关。晶体学研究结果也证明了这点，Pearson 等人发 现，Thr558残基的磷酸化可以引起 C-ERMAD 的构象变化，同时该磷酸基团与同 样带负电荷的 FERM 结构域之间的排斥作用也进一步减弱了 FERM 和 C-ERMAD 的相互结合14。 另一方面， PIP2可以与 FERM 结构域中的 F3 module 结合，引起其构象发生变化，从而使得 FERM 与 C-ERMAD 之间的亲和力减弱 23。这两方面的作用使得 Moesin 从自身 N 端与 C 端结合的封闭构象变成 N 端 与膜蛋白结合、C 端与 F-actin 结合的开放构象（图 2） 。 2. 与与 ERM 有关的信号通路有关的信号通路 ERM 的活性主要受 Rho GTPases （小 GTP 结合蛋白）以及 PKC 信号通路 调控。 Rho GTPases 是细胞中 F-actin 骨架及丝状伪足、 片状伪足形成过程中最主要 的调控因素，其可以与一系列下游分子作用，引起包括 Arp2/3 复合物在内的激 活，从而促进 F-actin 的动态组装24。其对 ERM 的活性调控主要有两个途径： 一方面 Rho GTPases 可以活化 PI4P5K，从而引起 PIP2水平的升高，后者可以与 ERM 的 FERM 结构域结合，改变 FERM 的构象；另一方面，Rho GTPases 还可 以活化其下游的 ROCK（Rho-associated kinase）和 MRCK（Myotonic dystrophy kinase-related Cdc42-binding kinase） ，从而磷酸化 ERM 的 C 端保守 Thr 残基，使 C-ERMAD 的构象改变19, 25。这两方面的作用使得 FERM 与 C-ERMAD 结构 域解离，并暴露出各自与膜蛋白或 actin 的结合位点。 PKC（Protein kinase C）信号通路也被报道参与 ERM 的活性调控。 Pietromonaco 等人发现，PKC 可以通过非经典途径在体外磷酸化 Moesin 的 张锦彬博士学位论文 2008 文献综述 5 Thr558残基，并且这种活性依赖于 Phosphatidylglycerol (PG)的存在26。此外， Ng 等人也发现 PKC 可以磷酸化 Ezrin 的 Thr567残基， 并可以促进损伤修复中细 胞的迁移27。不过，关于这些激酶磷酸化 ERMs 的详细机制仍有待进一步研究 28。 图 3. ERMs 的调控（引自 Immunology 2004, 112:165） 除了上述经典的激活通路外，也有报道认为 p38 MAPK 的激活也可以引起 ERM 的活化。Koss 等人的工作表明，TNF 的刺激可引起 HUVEC 细胞内 p38 的激活以及 ERM 的活化。但是 p38 并不直接作用于 ERM，并且 p38 也不通过 PKC 通路发挥功能。分别抑制 PKC 及 p38 都可以完全抑制 TNF 引起的 ERM 的磷酸化，说明 p38 与 PKC 可能最终会影响一个共同的未知下游信号通路29。 此外还有报道称，属于 Ste20/MAP4K serine/threonine 蛋白激酶家族成员的 NCK-interacting kinase（NIK）也可以直接与 ERM 的 N 端结合并磷酸化 C 端的 保守苏氨酸残基30。 有意思的是， ERM 除了可以被上述信号通路调节， 其自身在被活化后对 Rho GTPases 的活性也有调控作用。人们发现 Moesin 中 FERM 结构域可以与 GDI （GDP 解离抑制因子）结合，从而促进 Rho-GDI 复合物中 Rho-GDP 的释放，有 利于 Rho-GTP 的形成 （图 4） 31。 Radixin 也被报道可以与 Dbl 结合并促进 GDP/ GTP 的交换，从而提高 Rho GTPases 的活性32。在 Swiss 3T3 细胞中的实验显 示， ERM 可以促进 Rho 和 Rac 的激活并从而促进 F-actin 的组装和应力纤维的形 成12。 这些结果表明， ERM 与 Rho GTPases 之间的相互活化形成了一个正反馈 肿瘤细胞迁移过程中 CD146 的功能及作用机理研究 6 调控。 图 4. Rho GTPases 的调控（引自 Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2005, 21: 247） 3. ERM 可以与多种膜蛋白结合可以与多种膜蛋白结合 自从 Ezrin 与受体酪氨酸激酶的相互作用首次在 1981 年被报道后33，越来 越多的膜蛋白被发现可以与 ERM 结合。表 1 中总结了可以与 ERM 结合的膜蛋 白，它们在不同的细胞中发挥多种多样的功能。例如在 T 淋巴细胞中，Ezrin、 Moesin 可以与细胞粘附分子 ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD43、CD44 结合， 促进 T 细胞的极化和伪足的形成34, 35。在 B 淋巴细胞中，Moesin 与 L-selectin 的相互作用可以促进细胞表面微绒毛的形成以及淋巴细胞的粘附。在神经细胞 中，粘附分子 L1 通过 ERM 与 actin 的结合对于神经细胞轴突的形态发生是必不 可少的。使用 FERM 结构域竞争抑制细胞内 ERM 的活性时，可以导致神经细胞 形成类似丝状伪足的细小突起而无法形成正常的轴突36。此外，ERMs 对于 CD93 介导的吞噬作用37、Estrogen Receptor 介导的内皮细胞的迁移38、NIK （Nck-interacting kinase）介导的片状伪足的生成30都是必需的下游分子。对 ERM 活性的抑制可以显著地破坏细胞膜表面的微绒毛（Microspike） 、丝状伪足 等与细胞的极化和运动相关的细胞结构的形成39。 对 CD43、 CD44、 ICAM-1、 ICAM-3 等 ERM 结合蛋白的序列进行分析发现， 它们的胞内区都具有富含碱性氨基酸残基、等电点高的特点。他们与 ERM 的结 合位点都位于蛋白质胞内区中接近细胞膜的区域（Juxtamembrane Domain）40。 张锦彬博士学位论文 2008 文献综述 7 由于 ERM 分子内负责与膜蛋白结合的 FERM 结构域带有较多的负电荷14，膜 蛋白上这种正电荷氨基酸残基集中的区域正好可以与之互补。此外，这种 Juxtamembrane Domain 在许多未被报道可以与 ERM 结合的膜蛋白上都有分布 5，因此，随着研究的深入将会有越来越多的分子被发现可以与 ERM 结合，并 赋予 ERM 蛋白家族越来越丰富的功能。 表 1. ERMs 结合蛋白 4. 问题与展望问题与展望 与 F-actin 细胞骨架的结合是许多膜蛋白在细胞的极化、粘附、迁移等过程 中发挥功能的基础。作为介导膜蛋白与 F-actin 细胞骨架结合的桥梁，ERM 蛋白 家族被发现具有越来越多的功能。 一方面， 其所在的 Band 4.1 蛋白超家族的成员 不断增加，目前已经达到 15 个。它们都具有较为保守的 FERM 结构域以及各不 相同的下游蛋白及信号分子结合能力， 这赋予了它们多种多样的功能。 另一方面， 新的与 ERMs 相互作用的膜蛋白不断被发现， 研究它们之间的相互关系是将来的 研究方向之一。 Moesin 活性的调控是将来另外一个重要的研究方向。 目前对于 Rho GTPases 信号通路调节 ERMs 的活性的机制研究地比较清楚，但是其它如 PKC 以及 p38 MAKP 通路则研究的较少。此外，人们对于直接作用于 ERM 并使其 C 端保守 Thr 残基发生磷酸化的激酶仍存在争议。因此，进一步探讨 ERM 蛋白的活化机 制以及不同信号通路之间如何cross talk对于真正理解ERM如何在细胞表面的特 肿瘤细胞迁移过程中 CD146 的功能及作用机理研究 8 殊结构（如微绒毛，丝状伪足）形成过程中发挥作用具有重要的指导意义。 第二部分第二部分 粘附分子粘附分子 CD146 与细胞迁移与细胞迁移 细胞粘附分子 CD146 又称为 MCAM（melanoma cell adhesion molecule）,最 初由一株特异性识别人黑色素瘤细胞的单克隆抗体 MUC18 鉴定出来,并在后来 被发现是多个抗黑色素瘤抗体的抗原，因此 CD146 也叫做 MUC18、S-Endo 1、 和 A32 抗原41-43。 作为黑色素瘤的标志分子，CD146 与黑色素瘤的恶性化转变密切相关，使 用针对CD146的特异性抗体或DNA疫苗均表现出良好的抑制肿瘤生长与转移的 效果44-46。最近的研究显示，CD146 可以影响 actin 细胞骨架的动态组装从而 在黑色素瘤细胞的极化和迁移中发挥重要作用47。由于肿瘤细胞的迁移活性与 肿瘤的转移密切相关，因此从对细胞迁移调控的角度来研究 CD146 的功能将有 助于对其发挥作用的分子机制产生新的认识。 1. CD146 的结构与功能的结构与功能 CD146 是型膜蛋白，由 646 个氨基酸残基组成，属于免疫球蛋白超家族 成员（IgSF） 。利用原子力显微镜检测“Force-Extension”的结果显示，其胞外区 可以形成顺序相连的 V-V-C-C-C 的 Ig-like domain48；而胞内部分则较短，只有 63 个氨基酸，但是拥有多个可能的蛋白激酶识别位点及与其它蛋白相互作用的 Motif49。这种结构特征显示 CD146 可能具备两方面的功能： 一方面， 其 Ig-like domain 在许多配体与受体的相互作用的研究中被广泛报道，提示 CD146 的胞外 区很可能可以与其他粘附分子或细胞外基质结合， 从而在细胞的粘附和迁移方面 发挥作用；另一方面，其胞内区的蛋白激酶识别位点提示 CD146 可能不只是作 为一个粘附分子参与细胞的粘附，还可能参与信号转导。 在黑色素瘤中的研究表明，CD146 的表达水平与肿瘤的发展及转移成正相 关50, 51。对不同来源的肿瘤组织的免疫组化分析显示，CD146 在恶性黑色素 瘤上高表达而在痣等良性组织中不表达或低表达41。与之一致的，通过比较 9 种人黑色素瘤细胞，Luca 等人发现 CD146 的表达水平越高，黑色素瘤细胞在裸 张锦彬博士学位论文 2008 文献综述 9 鼠中的致瘤性及转移率也越强52。 人为地提高良性黑色素瘤细胞中 CD146 的表 达水平可以引起细胞的致瘤性及转移率的升高53；而抑制黑色素瘤细胞中 CD146 的表达则可以显著降低其致瘤性和侵袭性54。这些结果表明 CD146 在 黑色素瘤的恶性化转变中具有重要的功能。 但是目前对于其发挥作用的具体机制 尚不清楚。一种观点认为 CD146 与其配体的相互作用可能可以促进黑色素瘤细 胞之间的粘附并形成细胞团，从而赋予它们更强的侵袭性和转移能力55。近来 的研究发现，CD146 可能通过影响细胞的迁移活性来促进黑色素瘤的侵袭与转 移。Watson-Hurst 等人发现利用 siRNA 抑制黑色素瘤细胞中 CD146 的表达会使 得它们的迁移和侵袭能力显著下降56。类似的，在 Wnt5a 所介导的黑色素瘤细 胞的定向运动中，抑制 CD146 的功能会抑制细胞骨架的极性排布从而抑制细胞 的极化和迁移47。 除了黑色素瘤细胞，CD146 在内皮细胞和中间滋养层细胞的迁移中也发挥 着重要的功能。我们实验室的研究发现，利用 CD146-siRNA 或抗 CD146 单抗 AA98 都可以显著抑制 HUVEC 细胞的迁移能力，并进而抑制它们在血管生成中 的功能，表明 CD146 在内皮细胞的迁移中发挥重要作用45, 57。此外，我们还 观察到在先兆子痫病人中，中间滋养层细胞上 CD146 表达水平有显著下降，这 抑制了中间滋养层细胞的迁移以及侵入子宫内膜细胞的能力， 从而影响了胚胎的 着床58。 但是对于 CD146 在上述细胞迁移过程中发挥作用的机制仍有待进一步 的探讨。 2. CD146 的作用机理的作用机理 CD146 有可能分别通过调节 actin 细胞骨架的重排和促进细胞外基质的降解 两条途径来促进细胞的迁移。 研究发现，抗体 S-Endo 1 与 CD146 的结合可以引发 HUVEC 细胞中蛋白酪 氨酸激酶 FYN 结合于 CD146 的胞内区， 并引发下游一系列蛋白的酪氨酸残基的 磷酸化，其中包括磷脂酶 C-，Pyk2 和 p130Cas。磷脂酶 C-的活化可以引起细胞 内Ca2+的释放， 并引起下游Pyk2和p130Cas 的磷酸化59, 60。 由于Pyk2和p130Cas 都是与 actin 细胞骨架密切相关的蛋白，因此人们认为 CD146 可以通过影响细胞 骨架重排在细胞的迁移中发挥作用。 Bardin 等人在内皮细胞中的研究也部分支持 这种假设。他们观察到 CD146 可以与 F-actin 共定位，而使用细胞松弛素 B 使 肿瘤细胞迁移过程中 CD146 的功能及作用机理研究 10 F-actin 解聚后可以导致 CD146 在细胞上的重新分布61。此外，CD146 部分不 溶于 Triton X-100 的性质也从侧面说明了 CD146 可能可以和 actin 骨架结合62。 但是目前一直没有 CD146 与 actin 直接结合的证据。 除了影响细胞本身的运动活性，有证据表明 CD146 还可以通过促进细胞外 基质的降解来促进细胞的迁移。在 CD146 阴性的黑色素瘤细胞中表达 CD146 基 因能够引起基质金属蛋白酶 MMP-2 的表达，增强细胞的迁移能力53。而利用 抗 CD146 的抗体 ABX-MA1 可以抑制黑色素瘤细胞中 MMP-2 的分泌46。我们 实验室的在内皮细胞中的研究进一步揭示了 CD146 上调 MMP-2 表达的机理。 我 们发现利用 SMMC 7721 条件培养基（CM）模拟肿瘤微环境可以引起内皮细胞 中 p38 MAPK 的活化并进一步引起 NF-B 的激活，活化的 NF-B 可以促进 MMP-2 的转录，而对 MMP-9 的活性没有影响。使用抗体 AA98 可以抑制这一过 程，说明上述 NF-B 信号通路是由 CD146 参与的信号转导引发引发的63。但 是目前对于 CD146 如何感受细胞外信号并激活 NF-B 通路的机制还有待进一步 研究。 3. 寻找寻找 CD146 配体的研究配体的研究 CD146 与其配体的相互作用被认为可以引发下游信号并有助于增强黑色素 瘤细胞的侵袭性和迁移能力53。通过固相粘附以及细胞粘附实验，人们早在 10 年前就认为 CD146 可以与一个未知配体结合64， 但是遗憾的是一直都未能把它 鉴定出来。这使得一直以来人们只能使用抗 CD146 的抗体来模拟或阻断“假定 配体”与 CD146 的结合，并以此为模型研究 CD146 的功能及相关信号传导通路 59, 60, 63。 由于我们并不能确定抗体与细胞膜上的 CD146 的结合会对细胞产生 “刺激”还是“阻断”的效果，因此这种方法存在着天然的不足，而 CD146 天 然配体的鉴定将使得这些问题迎刃而解。 人们发现许多不表达 CD146 的黑色素瘤细胞（如 Mel888，SBcl-2）可以与 固相化的 CD146 蛋白粘附，并且利用 CD146 的胞外区蛋白可以竞争抑制这种结 合64，使用抗 CD146 的抗体如 A32、S-Endo-1、AA98 都可以抑制 CD146 所介 导的粘附65。 这说明在部分黑色素瘤细胞上有 CD146 配体的表达。 并且 Johnson 等人还发现 CD146 与其配体的结合不依赖于 Ca2+的存在66。 由于在已知的细胞 粘附分子 4 大家族中，钙粘素、选择素和整合素其与其他粘附分子的相互作用均 张锦彬博士学位论文 2008 文献综述 11 需要 Ca2+的存在，这使得我们可以把 CD146 配体的寻找范围缩小到免疫球蛋白 超家族的成员中。 不过，除了 IgSF 成员，CD146 的配体也有可能是细胞外基质成分。序列分 析显示， CD146 的胞外第二个 Ig-like domain 中含有一个 LKEEKN motif， 与 CD31 及 NCAM 中的粘多糖结合位点“LKREKN”非常相似，提示 CD146 也可能具有 与细胞外基质成分结合的活性42。与之一致的，对 CD146 在鸡中的同源分子 Gicerin 的研究显示，其可以与 NOF（Neurite outgrowth factor，属于 Laminin 家 族）结合并介导细胞与基质的粘附67。 除了上述大分子，CD146 的配体也可能是一个小分子。我们实验室之前的 工作发现，SMMC 7721 细胞培养上清（CM）可以刺激 HUVEC 细胞中 CD146 的二聚化以及 p38 信号通路的激活， 而抗体 AA98 可以阻断 CM 的这种作用63， 说明 CM 中也许含有某种成分可以与 CD146 结合并引发下游信号通路。这种未 知成分可能就是 CD146 的配体。 4. 问题与展望问题与展望 从最开始作为黑色素瘤恶性程度的标志分子， 到后来研究其在血管内皮细胞 中的功能，再到研究其在细胞迁移中的作用，我们对 CD146 的功能的认识越来 越全面。但是人们对 CD146 发挥作用的分子机制还存在很多疑问。这主要受两 方面的限制： 一方面， CD146 的配体迄今没有被鉴定， 这极大的限制了对 CD146 功能的研究，并且给 CD146 作用机理的研究也设置了障碍。另一方面，虽然目 前已经观察到了 CD146 可以引起一些信号通路的活化，但是对于“CD146 通过 什么途径或什么方式激活这些信号通路” 、 “这些信号通路如何解释 CD146 所表 现出来的在粘附、迁移、肿瘤生长与转移等方面的功能” 、 “这些信号通路之间如 何 cross-talk”等一系列问题尚需要更深入的探索。因此，寻找 CD146 的“上游” （即配体）及“下游”分子将是未来最重要的研究方向之一。本论文即围绕上述 问题，寻找分别与 CD146 胞内区及胞外区结合的蛋白，试图从 CD146 参与细胞 运动调节的角度阐述 CD146 在肿瘤转移过程中发挥作用的分子机制。 肿瘤细胞迁移过程中 CD146 的功能及作用机理研究 12 第一部分第一部分 CD146 在肿瘤细胞迁移中的作用机理研究在肿瘤细胞迁移中的作用机理研究 前言前言 CD146 是黑色素瘤的标志分子，在黑色素瘤细胞的迁移过程中发挥着重要 的功能。 在黑色素瘤细胞中上调 CD146 的表达会提高其致瘤性及转移率53， 而 抑制 CD146 的表达则可以显著的抑制黑色素瘤细胞的迁移能力47, 56。但目前 对于 CD146 如何在黑色素瘤细胞的迁移中发挥作用这一问题尚无明确答案。 之前的研究表明，CD146 可能通过影响 F-actin 的动态组装而促进细胞的迁 移。Bardin 等人在内皮细胞中的研究发现，CD146 可以与 F-actin 共定位，并且 使用细胞松弛素 B 使 F-actin 解聚后可以导致 CD146 在细胞中的重新分布61。 类似的结果最近在黑色素瘤细胞中也被观察到。Witze 等人发现 CD146 与 W-RAMP 复合物（Wnt-mediated receptoractinmyosin polarity）在细胞内的协 同极性分布对于 WM329A、WM1789 等黑色素瘤细胞的定向运动至关重要，并 且抑制 CD146 的表达会导致 F-actin 细胞骨架的弥散和紊乱并最终降低细胞的迁 移能力47。然而，人们一直没有找到 CD146 与 actin 结合的直接证据。 本部分研究工作即围绕 CD146 与 actin 细胞骨架蛋白的相互作用展开。通过 免疫共沉淀试验，我们首次在黑色素瘤细胞 A375 中发现了 CD146 可以与 actin 结合的直接证据。进一步的研究发现，这种结合是通过膜突蛋白 Moesin 介导的， 即 CD146 的胞内区可以和 Moesin 的 N 端结构域结合，并通过其 C 端结构域结 合到 actin 细胞骨架上。 此外， CD146 与 Moesin 的相互作用还可以促进丝状伪足 的形成，从而促进细胞的迁移。除了直接与 Moesin 结合，我们还发现 CD146 的 高表达可以引起 Moesin 的磷酸化水平升高， 直接表现为 Moesin 从胞质内到细胞 膜的重新定位和极性分布。这提示 CD146 可以通过活化 Moesin 来影响 actin 细 胞骨架的重排，进而影响细胞的迁移能力。 张锦彬博士学位论文 2008 研究内容 13 一、 材料与方法一、 材料与方法 1. 实验材料实验材料 1.1 质粒、基因、细胞系质粒、基因、细胞系 p3FLAG-CMV-14 购自 Sigma 公司， Reformed- p3FLAG-CMV-14 载体是 由本实验室对 p3FLAG-CMV-14 的多克隆位点进行改造后的载体； pcDNA3.1/myc-His(-)B 购自 Invitrogen 公司；pECFP-N1 和 pEYFP-N1 由中科院 生物物理所沈恂研究员赠送；CD146 基因（pUC18-CD146）由德国慕尼黑大学 JP. Johnson 博士赠送。人黑色素瘤细胞系 A375、MALME-3M 购自 ATCC。 1.2 主要试剂主要试剂 质粒提取试剂盒、 DNA 纯化试剂盒、 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒购自天根 生化公司；Ex Taq 聚合酶、La Taq 聚合酶、限制性内切酶、T4 DNA 连接酶购自 TaKaRa 公司，反转录试剂盒、Trizol 试剂购自 Invitrogen 公司。 CD146 兔多抗 RACD146、单克隆抗体 AA98 及 aa1、anti-myc 单抗 9E10 由 本实验室制备；抗 Moesin 单克隆抗体 38/87 由 Heidelberg University 的 Reinhard Schwartz-Albiez 教授惠赠；Phospho-Ezrin (Thr567)/ Radixin(Thr564)/ Moesin (Thr558) Antibody 购自 Cell signalling 公司； 抗体 anti-actin 购自 Sata Cruz 公司； anti-FLAG 单抗、鼠 IgG（mIgG） 、FITC 标记羊抗小鼠抗体、Cy3 标记羊抗兔抗 体、 多聚赖氨酸 （Poly-lysine） 购自 Sigma 公司； 正常羊血清购自中杉公司。 Protein A agarose 购自 Sata Cruz 公司；防荧光淬灭封片剂与膜再生缓冲液购自北京普利 莱公司； SuperSignal West Dura Detection Kit 购自 Pierce 公司； 硝酸纤维素膜 （NC 膜）购自 Amersham 公司。 Lipofectamine 2000 购自 Invitrogen 公司；FuGen