实验十三血乳酸的测定与应.ppt

实验十三 血乳酸的测定与应用,通过实验使学生掌握体内血乳酸的测定方法及该指标在运动实践中的应用和意义，为体育教学和运动训练提供指导。 进一步巩固离心机、可调微量移液器、振荡器等仪器的基本操作。掌握实验对象取材、标本处理的方法与半自动生化分析仪的操作方法。 通过综合设计型实验的实验设计与研究过程，提高学生的学习兴趣，培养学生查阅文献资料、独立思考、创新思维、动手操作、分析问题和解决问题的能力，使学生基本掌握从事一般科学研究的方法。,1 实验目的,2 实验原理,2 实验原理,乳酸是糖酵解供能系统的终产物，又是有氧代谢系统的重要氧化物质，运动时乳酸主要在骨骼肌中生成，然后透过细胞膜进入血液，并随血液循环到达身体的其他组织被代谢消除。可在肝内经糖异生途径转变为葡萄糖，在供能体系中占有重要地位。与此同时，乳酸过多对酸碱平衡的影响又成为负面效应，导致疲劳发生。 因此，运动时乳酸的生成、运动后乳酸的消除，以及运动训练和体育锻炼中血乳酸指标的应用成为运动生物化学研究的重要内容之一。 安静时，人体静脉血里的乳酸物质的量浓度为0.45-1.3mmol/L。剧烈运动时，肌肉内糖的无氧分解加强，,血乳酸浓度显著升高，而且在某些项目中两者的相关系数很大，其增长情况与运动强度、氧债、训练程度等因素密切相关，因而可直接用运动后血乳酸的浓度来评定无氧代谢的能力，如400m跑后，血乳酸低于10 mmol/L表明无氧代谢能力差；达到14-15 mmol/L表明无氧酵解能力强。 当今血乳酸不仅用来评定速度耐力水平，还用来评定有氧代谢能力，控制运动强度，预测成绩等等。,3 实验器材与试剂,3 实验器材与试剂 实验仪器,实验仪器 采血针、吸血管、移液管、聚苯乙烯微量细胞培养板、酶联免疫检测仪, 试剂, 试剂 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG； 包被液：0.05 mol/L碳酸缓冲液（pH值为9.63）：Na2CO30.15g，NaHCO20.293g，蒸馏水稀释至100ml； 稀释液（PBS-Tween）：NaCl8g，KCl0.2g，KH2PO4 0.2g，Na2HPO412H2O 2.9g，Tween-20，0.5ml，蒸馏水加至1000ml； 洗涤液：同稀释液； 封闭液：0.5%（质量分数）BSA（用PBS配制）； 邻苯二胺溶液（底物）： 配制：0.1 mol/L柠檬酸（2.1g/100 ml），取6.1 ml；0.2 mol/L Na2HPO412H2O（7.163 g/100 ml），邓邻苯二胺8 mg（溶解）；临用前加30%（体积分数）H2O240 l； 终止液：2mol/L H2SO4。,4 实验方法与步骤,4 实验方法与步骤,4-5人一组，自由组合编组，选定一人担任小组长。查找国内外近十年有关运动训练中血乳酸变化的文献资料并总结，以小组为单位进行讨论，拟定实验的内容与指标。 根据拟定的实验内容与指标，讨论拟定运动实验对象的训练方案：运动方式、运动强度与时间等（包括学会训练实验动物）。 详细制定实验步骤与方法，严格按照实验步骤与要求进行实验。,设计本次实验方案 全血乳酸检测试剂盒法,设计本次实验方案 实验对象的选择（不同项目运动员）运动训练方式、强度、持续时间及取样时间的选择。 血乳酸的实验测定方法选择 可采用酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA），或放射免疫法（Radioimmuniassay,RLA）测定。 确定实验数据的统计学处理方法。 全血乳酸检测试剂盒法 原理：以NAD+为氢受体，LDH催化乳酸脱氢生成丙酮酸，使NAD+转化成NADH。其中PMS递氢使NBT还原为紫色呈色物，呈色物的吸光度在530nm时与乳酸含量成线性关系。 材料与试剂：采血针、吸血管、离心管、台式离心机、超声清洗机、试管架、移液枪、TP头、水浴箱、可见光分光光度计、比色杯。,表3-17 全血乳酸检测试剂盒的操作,5 实验参考方案,5 实验参考方案, 实验对象：实验对象为运动人体科学专业学生10名，采用功率自行车进行大强度运动训练建立运动实验模型：采用半自动生化分析仪检测血液标本。 运动训练方案：运动模型的建模，采用功率自行车进行有氧运动训练（运动方案可自行设计）。持续运动5分钟，运动强度由心率控制，为实验对象最大心率达85-95。 实验方法与步骤： 包被抗原：用包被液将抗原做适当稀释，一般为1-10 g/孔，每孔加200 l，37 温育1 h，或4冰箱放置16-18 h。,洗涤：倒尽板孔中液体，加200l洗涤液，反复3次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 加封闭液200l，37温育1h。 洗涤同。 采集受试者运动前与运动后血液制成血清 加被检血清：用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200l。同时作稀释液对照。37温育12h，或室温放置2 h。 洗涤同。 加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG，每孔200l，37温育1h，或室温放置2h。 洗涤同。 加底物：邻苯二胺溶液加200l，室温暗处5min。观察结果：用酶联免疫检测仪记录A190 nm读数。, 实验报告（实验结果与分析）内容 实验结果：实验结果为实验对象运动后，血乳酸含量显著升高，运动前血乳酸浓度为0.45-1.3 mmol/L，运动后即刻为10-15 mmol/L，两者差异具有统计学意义（P0.05）。 实验结果分析：乳酸是糖酵解供能系统的终产物，又是有氧代谢系统的重要氧化物质，运动时乳酸主要在骨骼肌中生成，可在肝内经糖异生途径转变为葡萄糖，在供能体系中占有重要地位，可直接用运动后血乳酸的浓度来评定无氧代谢的能力。如400 m跑后，血乳酸低于10 mmol/L表明无氧代谢能力差；达到14-15 mmol/L表明无氧酵解能力强。,6 注意事项,6 注意事项, 设计运动方案时，应