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文档简介
实验四 细菌的生理生化试验及肠杆菌科的鉴别、理化因素及生物因素对微生物的影响,一、目的要求,掌握细菌鉴定中常用生理生化反应的原理、方法、结果判定以及在诊断中的运用 熟悉大肠杆菌和沙门菌主要培养特性和常 规微生物学诊断方法 通过本实验加深理化因素及生物因素对微生物的影响的概念,二、实验材料,菌种:大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、巴氏杆菌 培养基:葡萄糖高层琼脂、普通琼脂斜面、水琼脂斜面、氧化-发酵培养基(小生化管)、普通平板、麦康凯平板、淀粉平板、三糖铁斜面、各类生化反应管等 器械:砂轮、试管架、接种环、接种针、灭菌吸管、灭菌刻度移液管、灭菌棉签、胶头、灭菌液体石蜡、酒精灯、废报纸等,三、实验内容,1、细菌对空气(氧气)的需要 菌种:大肠杆菌、枯草杆菌 方法:用吸管将两种菌各加入两支己溶化的葡萄糖深层琼脂管中, 培养基:葡萄糖深层琼脂(己溶化) 2、细菌对营养的要求 菌种:大肠杆菌、巴氏杆菌 培养基:斜面(水琼脂、普通琼脂) 方法:划线的方法,(一)细菌的生理生化试验,3、细菌氧化型与发酵型(O/F)的测定 菌种:大肠杆菌、枯草杆菌 培养基:加有葡萄糖和指示剂(1%溴麝香草酚蓝)的微型发酵管 方法:用接种针将两种菌各加入两支发酵管中,从不同菌里各取一管加入灭菌的液体石蜡,37 正置培养。 产酸(浅绿色 黄色 ),4、淀粉水解试验 菌种:大肠杆菌、枯草杆菌 培养基:普通营养琼脂平板 方法:一块平板上,一边划大肠杆菌,一边划枯草杆菌,第二天长出菌后,在菌落上滴加碘液。 5、触酶(过氧化氢酶)试验 菌种:大肠杆菌、枯草杆菌 培养基:普通营养琼脂平板 方法:一块平板上,一边划大肠杆菌,一边划枯草杆菌,第二天长出菌后,在菌落上滴加H2O2,(二)肠杆菌科的鉴别(大肠杆菌&沙门菌),肠杆菌科的生化试验,1、麦康凯琼脂平板 (乳糖、胆盐、指示剂:1%中性红) 方法:划线,分解乳糖 菌落变红 2、三糖铁琼脂斜面 (葡萄糖、蔗糖、乳糖、硫酸亚铁铵、指示剂:0.5%酚红) 方法:先划斜面再穿刺,3、糖分解试验 微量发酵管:葡萄糖、乳糖、甘露醇、蔗糖 方法:用接种针挑取菌种后接入发酵管内,用报纸包好口,置培养箱培养。发酵糖产酸:指示剂溴甲酚蓝由紫色 黄色 4、吲哚(靛基质)试验 培养基:蛋白胨水微量管 原理:细菌分解蛋白质中的色氨酸产生吲哚,吲哚与对位二甲基氨基苯甲醛作用形成玫瑰吲哚而成红色。 方法:接种针接种,培养12-24 h后,加入试剂显色,5、甲基红(MR)试验 培养基:葡萄糖蛋白胨水 原理:甲基红试验: 分解葡萄糖产生丙酮酸,进一步分解为甲酸、乙酸、乳酸等使pH下降,含甲基红指示剂的培养基变红 6、VP试验:葡萄糖蛋白胨水 原理:某些菌发酵葡萄糖产生丙酮酸,丙酮酸经多脱羧、氧化等反应生成二乙酰,其与蛋白胨中精氨酸胍基作用产生粉红色化合物,7、枸橼酸盐(柠檬酸盐)利用试验 培养基:Simmon氏枸橼酸钠微量发酵管 原理:细菌若能以枸橼酸钠为唯一碳源,磷酸铵为唯一氮源,则可利用枸橼酸钠产生碳酸盐,与利用铵盐产生的NH3反应,形成NH4OH,使培养基变碱,pH升高,指示剂溴麝香草芬蓝由草绿色变为深蓝色。 8、脲酶 培养基:尿素微量发酵管(指示剂:酚红) 原理:细菌分解尿素产生2分子NH4,使pH升高,指示剂变红。,9、硫化氢试验 培养基:营养琼脂中含FeSO4的微量反应管 原理:凡细菌能分解含硫氨基酸,产生H2S者,其所产生的H2S会使培养基中的醋酸铅或FeCl3形成黑色的硫化铅或硫化铁。 10、运动力试验 培养基:半固体琼脂微量反应管 方法:穿刺接种,(三)理化因素及生物因素对微生物的影响,1.紫外线与杀菌试验 菌种: 大肠杆菌、枯草杆菌 方法:取营养琼脂平板2个,一个涂大肠杆菌,另一个涂枯草杆菌。在其涂有细菌的表面贴上以剪出不同图案的硬纸片,然后在紫外灯下距离30厘米照射20分钟,照射完毕将硬纸片取走盖回原来平皿盖,于37培养24小时观察结果。,2.药敏试验:圆纸片扩散法 菌种: 大肠杆菌、金黄色葡萄球菌 培养基:营养琼脂平板 方法:,3.消毒剂抑菌和杀菌试验 菌种:大肠杆菌、枯草杆菌 方法:与药敏试验方法是一样的(纸片扩散法),将以上接好细菌的培养基置37培养箱培养。 经1824h培养观察细菌生长情况。有一些生化管则需要加试剂后观察其颜色变化,做好实验结果记录并记录抑菌圈大小。,肠杆菌科细菌的鉴别,三糖铁琼脂斜面,斜面/底层,产气;H2S,糖发酵,葡萄
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