细胞色素P450的特性

细胞色素P450的特性及其研究进展摘要：细胞色素P450是内质网膜上混合功能氧化酶系统的末端氧化酶，在生物体内分布广泛，主要催化机体内源和外源性物质在体内的氧化反应。在临床药物的生物学转化中，它参与大部分药物的生物氧化，因此具有重要的生物学意义。关键词：细胞色素P450 特性 机理 功能 Characteristics of cytochrome P450 and its research developmentABSTRACT: Being the terminal oxidase component of mixed function oxidase system in the membrane of endoplasmic reticulum,cytochrome P450 (CYP450) has been found in all living organisms and can catalyze the oxidation of a variety of endogenous and xenobiotic compounds. This article reviewed the mechanistic explorations on CYP450- catalyzed reactions , especially the recent investigations on the mechanism of ethanol oxidation catalyzed by CYP450, as well as those in CYP450 drug metabolism.Keywords cytochrome P450; structure; catalytic mechanism; function 前言细胞色素P450是一组结构和功能相关的超家族基因编码的含铁血红素同工酶，主要存在于肝细胞平滑肌内质网内，由血红素蛋白、黄素蛋白及磷脂三部分组成，相对分子质量在40 00060 000之间，因其具有血色素类似的结构，且其还原态与一氧化碳作用后，在450nm处有一个吸收高峰，因此而被命名为细胞色素氧化酶P4501。CYP450家族成员之间的一级结构差异很大，但空间结构却有着较大的相似性，含有由含铁血红素和半胱氨基酸组成的活性中心。 1 分布特点细胞色素P450酶系统广泛分布于动物、植物和微生物体内，是自然界中含量最丰富、分布最广泛、底物谱最广的相代谢酶系。其分布具有一定的选择性，它分布于外源化合物进入人体内的主要入口组织，这些组织是对经皮肤和口腔进入生物体的外源化合物的第一道防线。微粒体细胞色素P450分布于全身各组织中，但以肝脏细胞含量最丰富，参与药物、致癌物、类固醇激素和脂肪酸的代谢。人体内细胞色素P450主要存在于肝脏和小肠中，此外肾、脑、肺、皮肤、肾上腺、胃肠等脏器组织也有P450存在，不仅存在于内质网，在线粒体或核膜内均有P450的存在，肿瘤组织中也有细胞色素P450存在2-3。1李晓宇，刘皋林CYP450酶特性及其鹿用研究进展中国临床药理学与治疗学，2008，13(8)：942-9462Sissung TM，Price DK，Sparreboom A，et a1Pharmacogenetics and regulation of human cytochromeP450 1 BI：implications in hormone mediated tumor metabolism and a novel target for therapeutic interventionMol Cancer Res。2006，4(3)：135-1503Oyanul T，Sngio K，lm T，et a1Expression of cytochromeP450 in nonsmall cell lung cancerFront Biosci，2008，13：5787-57932 性质特点细胞色素有很多种，例如细胞色素a、b、c、d等。细胞色素P450属b类细胞色素，是一种含亚铁的卟啉蛋白，即血红素蛋白，本身具有典型的可见光吸收光谱。在一定条件下，与其他化合物结合时，原有的吸收光谱将发生改变，形成的吸收光谱称为“示差谱”(difference spectrum)。氧化型细胞色素P450可与多种药物（例如苯巴比妥）、环境污染物和农药（例如滴滴氧化型细胞色素涕）等在CYP的疏水部位结合，形成的吸收光谱称为型示差谱，最大吸收峰在390nm附近(385390nm)，最低吸收谷在420nm附近（418427nm）；所结合的化合物称为型配体（ligand），这些配体大的底物，有的对CYP还具有诱导作用。氧化型细胞色素P450，如与一些含氮的有机化氧化型细胞色素合物（如烟硷、烷基咪唑等）相结合，则形成型示差谱，其结合部位是细胞色素P450的血红素铁，最大吸收峰在430nm附近（430435nm），最低吸收谷在395nm附近（390410nm），所结合的化合物称为型配体，其中多数对CYP具有抑制作用。还原型细胞色素P450可与胡椒基丁醚、SFK-525A、乙基胩等相结合，形成的吸收光谱称为型示差谱，最大吸收峰在430nm，最低吸收谷在390nm；所结合的化合物称为型配体，胡椒基丁醚和SFK-525A两种配体是重要的CYP抑制剂。还原型细胞色素P450与CO相结合，形成一种特殊的吸收光谱，称为CO示差谱，最大吸收峰为450nm（448450nm）。3 结构特点细胞色素P450与一氧化氮合酶(NOS)一样都是以硫醇盐结合血红素为活性中心催化氧原子转移的氧化还原酶, 都需要亚铁血红素(HEM)活化氧. 活性中心HEM的铁离子一侧与半胱氨酸的硫络合, 另一侧可与水中的氧分子络合. 细胞色素P450中绝对保守的半胱氨酸与催化活性中心亚铁血红素中铁元素形成硫醇盐离子键, 成为铁的一个配体2. 这正是细胞色素P450中的铁能与一氧化碳络合, 并在450 nm存在特征吸收的原因, 最初名称也由此而来. 数十个细胞色素P450晶体结构显示不同种属间的序列差异较大, 但其三维结构高度保守. 所有细胞色素P450都基于序列维持整个结构折叠弯曲的相似, 其二级结构用典型细胞色素P450折叠命名法标示, P450 StaP的折叠结构和对应折叠弯曲结构的名称3. 从链霉菌分离出的咔唑生物碱星孢菌素(Staurosporine)具有强抗癌作用, 其生物合成的关键步骤是由P450 StaP催化底物色素吡咯(chromopyrrolicacid, CPA)氧化脱氢,形成分子内CC键成咔唑环, 经氧化脱羧完成. 尽管P450 StaP催化反应不同于常见的细胞色素P450对碳氢键的羟基化, 但是其结构具有细胞色素P450家族的酶特有的相似折叠结构和相同的氧化活性中心(HEM), 从N端到C端包含螺旋结构为A, B, C, D, F, E, G, H, I, J, K, L以及相似的折叠结构. 不尽相同的过渡螺旋结构, 则通过标注区别, 如B, K等. 晶体结构显示P450 StaP结合底物CPA的三种方式: 一种是位于由Hem, B2和I螺旋、连接F, G螺旋的回转结构(F/G loop)“缝制”而成的活性中心口袋中, 其它两种结合方式的意义尚不十分清楚, 但可能揭示了底物进入活性中心的可能通道3.从另一角度观察一些细胞色素P450与底物结合的空间构象, 可以明显看到围绕I 螺旋表面形成通向活性位点的开/关运动的通道. 在钌与光敏剂络合后与底物结合, 再与P450 cam酶结合, X 光晶体衍射显示出P450 cam的亚分子结构和隐藏在深处活性位点的立体结构和性质,其中钌到活性中心铁的间距即具有催化活性的大沟的深度为21 . 综合几种细胞色素P450的结构显示, 亚铁血红素基团均被限制在末端的螺旋I和邻近的螺旋L之间.接近催化中心的半胱氨酸与邻近主链的氨基形成两个氢键; 长螺旋I形成了亚铁血红素口袋内壁, 并且包含了特征氨基酸序列; 高度保守、具有酸性残基的苏氨酸位于活性位点, 参与催化作用35,8,9. 尽管细胞色素P450酶系的折叠结构高度保守, 但还是有足够的结构差异, 以便大小不同的底物与不同种类细胞色素P450结合.2 Wang, B.; Su, X.-S.; Zhang, S.-H. Chin. J. Org. Chem. 2005, 25(3), 342 (in Chinese). (王斌, 苏喜生, 张声华, 有机化学, 2005, 25(3), 342.)3 Masatomo, M.; Hiroshi, S.; Yoshitsugu, S.; Shumpei, A.; Hiroyasu, O.; Shingo, N. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.2007, 104(28), 11591. 4 Ivan, J. D.; Brian, R. C.; Jonathan, J. W.; Jay, R. W.; Harry, B. G. Proc.Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999, 96(23), 12987. 5 Scott. E. E.; He, Y. A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100(23), 13196. 6 Zhao, Y.-H.; White, M. A.; Muralidharaet, B. K.; Sun, L.; Halpert, J. R.; Stout, D. C. J. Biol. Chem. 2006, 281(9), 5973. 7 Muralidhara, B. K.; Negi, S.; Chin, C. C.; Braun, W.; Halpert, J. R. J. Biol. Chem. 2006, 281(12), 8051. 8 Pylypenko, O.; Schlichting, I. Annu. Rev. Biochem. 2004, 73, 991. 9 Wade, R. C.; Winn, P. J.; Schlichting, I. J. Inorg. Biochem. 2004, 98(7), 1175.4 催化反应特点细胞色素P450酶系在自然界可能是最具有催化多样性的酶系，已从动物、植物、真菌和细菌等研究表明有多种不同的催化反应归功于细胞色素的作用（Black et al.1987，Gonzalea 1989）。的化学 结 构 是 一 种 含 个 铁 原 子 的叶琳 蛋白。其 参 与氧 化代 谢 的总 反应式如下:RH+O2+NADPH+H+ P450 ROH+H2O+NADPH+4.1 底物识别与结合的诱导-契合机制细胞色素P450催化的反应在以水为溶剂的环境中进行, 而底物是反应惰性的多种结构不同的脂溶性有机物, 难溶于水. 细胞色素P450在维持其折叠方式的同时, 需要适应和容纳不同结构的底物、兼顾水与有机相, 让底物进入深埋着的活性中心. 细胞色素P450通过诱导-契合机制识别底物是由六个“底物识别位点”(substrate recognition sites, SRS)来执行的: B螺旋区(SRS1), 螺旋F和G的一部分(SRS2和SRS3), 螺旋I的一部分(SRS4), 螺旋K的2连接区(SRS6), 以及发夹区(SRS5). SRS是柔性蛋白质区域, 能够移动到底物, 并结合在一起, 在“诱导-契合”机制作用下, 促成与底物的结合, 以及随后的催化反应. SRS的点突变很大地影响酶识别与结合底物的特性. P450 2B4的晶体结构显示了从蛋白质表面穿过周围细胞色素P450特有的螺旋和折叠结构延伸到活性中心HEM所敞开的裂缝57,10. 裂缝开口与闭合的构象变化主要限于F到G, B和C螺旋, N端的I和区域形成的“盖帽”结构域. 将P450-2B4与抑制剂4-(4-氯苯)咪唑(CPI)结合前后的构象对比, 可以明显看到构象的重排变化6. 显示了大规模的构象变化主要由结构保守的部分之间再布局, 伴随显著的少许二级结构的重塑。4.2 催化氧化反应过程细胞色素P450催化反应过程典型的反应是通过电子传递系统，将分子氧还原，并将其中的一个氧原子加到底物中，反应需要细胞色素p450还原酶 （NADPH）。后者通过2个辅基FAD和FMN，从NADPH转移2个电子给不同的P450酶系。由细胞色素P450与NADPH组成的单加氧酶系能够催化多种内源外源物在体内的氧化反应，使化学物质的活性或毒性、药物的药效发生变化。然后释放氧化的底物，P450酶回到初始状态。P450BM-3由含HEM结构域和FMN/FAD还原酶结构域两部分通过一个单肽链连接而成19.细胞色素P450活性中心的铁被还原形成亚铁血红素后, 容易结合到分子氧, 形成亚铁P450-二氧复合物. 三价铁还原和结合氧气分子的反应方程如下21: P-Fe(III)O2e- P-Fe(II)-O2过氧化氢可取代氧气分子氧化底物, 使细胞色素P450催化氧化过程产生捷径22. P-Fe(III)H2O2 P-Fe(III)-O-OHHP-Fe(II)-O2 经第二个单电子还原和质子化, 形成Fe(III)-氢过氧化复合物P-Fe(III)-O-OH. P-Fe(II)-O2eHP-Fe(III)-O-OHH2O卟啉环的体系富含电子, 容易被Fe(III)-氢过氧化复合物中的氧氧化, 即氧的电负性较大, 电子流向氧, 形成阳离子自由基, 得到体系部分的稳定作用. 过氧键不稳定, 经结合质子和异裂产生一分子水和高活性的氧合铁中间体. 铁表观化合价升为5价, 得到卟啉环体系的络合稳定. PFe(III)-O-OH H PFe(IV)OH2O 高价铁氧中间体PFe(IV)O的形成是整个催化循环过程中的限制性步骤, 正是该氧铁卟啉阳离子自由基, 即能提供单电子, 又含正电荷, 提供活性氧原子, 在水溶液中能够实现转移氧原子, 插入到惰性的CH键中, 实现温和条件下烃的羟基化2326。氧合铁中间体PFe(V)O中的铁为高价五价, 具有较高的氧化能力, 而细胞色素P450底物上的碳氢键正好接近高价铁原子. 氧原子从氧合铁中间体迁移到底物上, 形成氧化产物. 最后, 产物被水或新的底物取代, 从复合状态解脱离去, 完成循环. 至此, 细胞色素P450完成了羟基化作用.21 Han JH, Yoo SK, Seo JS, et al. Biomimetic alcohol oxidations by aniron(III) porphyrin complex: relevance to cytochrome P-450 catalyticoxidation and involvement of the two-state radical rebound mechanism J. Dalton Trans, 2005, 2: 402 - 40622 Machman R, Guo Z, Guengerich FP, et al. The mechanism of oxidation of allylic alcohols to unsaturated ketones by cytochrome P450 J.Chem Res Toxicol, 1996, 9: 223 - 22623 Wang Y, Yang C, Wang H. et al. A new mechanism for ethanol oxidation mediated by cytochrome P450 2E1: Bulk polarity of the activesite makes a difference J. Chem Bio Chem, 2007. 8: 277-28124 Wang Y, Kumar D,Yang CL, et al. Theoretical study of N-demethylation of substituted N,N-dimethylanilines by cytochrome P450: Themechanistic significance of kinetic isotope effect profiles J. J Phys Chem B, 2007, 111: 7700-771025 Wang Y, Wang HM, Wang YH, et al. Theoretical study of the mechanism of acetaldehyde hydroxylation by compound I of CYP2E1 J. J Phys Chem B, 2006, 110: 6154-615926 Li DM, Wang Y, Yang CL, et al. Theoretical study of N-dealkylation of N-cyclopropyl-N-methylaniline catalyzed by cytochrome P450: insight into the origin of the regioselectivity J. Dalton Transactions,2009, 2: 291-2975 影响P450活性的因素某种化合物在体内的新陈代谢受多种因素的影响,包括基因差异,环境的物理、化学特性和生物体的生理状态等。5.1 诱导作用生物体中的酶可分为结构酶和诱导酶。就P450同工酶来说,其基 因超过200种。在一般条件下,只有一小部分基因在细胞中被持续地 转录、翻译,其数量恒定,为结构酶而很大一部分基因的表达则在一定程度上受激素和化学物质刺激的影响。这些在细胞中数量不恒定的酶 被称为“诱导酶”。酶的诱导通常伴随着一定的单氧氧化酶活力的提 高但酶数量的增加并不意味着酶活力一定有相应的提高。能诱导P450基因的外来物至少可分为3类2-3:3-MC(3-甲基胆蕙)型、PB(苯巴比妥)型和混合型(介于前两者之间)。不同动物对同一诱导剂的敏感性不同; 而且,即使是在的同一亚族中,诱导剂对不同同工酶的调节也是不同的。这表明诱导作用可能涉及到不同的受体。对于芳烃及其类似化合物二嗯瑛类,来说,细胞中有一种溶质受体 蛋白受体与它们有很高的亲和力。在某些啮齿类动物中,与 受体结合 的能力约为苯并花或3-MC的10000倍4,5。此类化合物在小鼠体内的诱导途径如下诱导剂和受体结合后,此复合物转移到细胞核内,启动核 内的结构基因开始转录。而受体本身也是此种位点的调节基因的产物。对甾族化合物诱导基因的研究表明,它可能涉及到糖皮质激素受体,该受体控制着肝脏中许多酶。而在对降脂类药物基因的诱导作用研究 中,用亲和层析纯化了一种安妥明(clofibrate)受体6-8。5.2 抑制作用外来化合物通 常对P450酶表现为复合作用,即低浓度时诱导,而 高浓度时抑制。抑制剂对P450的抑制方式是多样的:主要作用于P450的辅酶(减少或破坏NAPDH/NADH)。其次是作为竞争电子的物质或抑制性抗体作用于还原酶。还可直接作用于P450本身,如CO等可与P450中的血红素不可逆地结合。此外,与酶作用底物结构相似的化合物及 抑制性抗体的竞争作用,或缺氧也可抑制。某些抑制剂如烷基化试剂可与蛋白共价结合,导致酶功能不可逆的破坏10.参考文献见手机照片6 功能特性细胞色素P450吸引人们的注意不仅在于它参与了许多生物过程，也因为它催化作用的独特的化学原理，即将分子氧断裂并将其中一个氧原子插入到底物内。虽然P450催化反应的化学机理已经受到了广泛的研究，但是很多呈现出迷人的挑战性的难题和争议仍然摆在人们的面前。对细胞色素P450催化反应机理的研究可以使我们更深刻的认识这些生理过程，从而可以进一步对生理活动进行调控，使其的有利于我们的一面得到发展和应用，不利的一面得到抑制甚至排除。P450的功能不仅降解化合物以获得碳源，而且还解毒外源化合物以及合成具生物学活性的化合物如甾醇、前列腺素（protaglandins）和花生四烯酸酯（arachidonate）代谢物。由于底物结构通常是疏水化合物，而产物的水溶性更高，因此P450可用于处理环境有毒物质，如多环芳烃和碳氟化合物（fluorocarbons）。P450也被用于基因治疗以补偿重要代谢途径缺损，如补偿CYP21或CYP17这些在甾醇发生中起重要作用的蛋白。另外，P450可被用于使立体和位置选择性的化合物加单氧化作用以产生重要的生物活性，如将花生四烯酸转化为14,15-EET，这一活性在调节K+Ca2+注入肾中起重要作用细胞色素P450酶系催化的药物的生物转化是药物代谢中最重要的一个系统，因此，细胞色素P450催化反应的机理