甘氨酸螯合物结构分析现状与检测探索.ppt

甘氨酸螯合物结构分析现状与检测探索,龙远德 中国科学院成都有机化学有限公司 研究员 中国科学院成都分院分析测试中心 主任 2016年5月,氨基酸与金属离子形成的化合物究竟该称为有机盐、氨基酸络合物、氨基酸螯合物，还是其它的什么名称？是不是每个人都在猜想自己的产品究竟是什么型态！是不是很难拿出直接证据？ 目前大家都想制备螯合物，都觉得自己的产品是螯合物了。能不能弄得明白呢。 氨基酸有20个左右，分子结构最简单的是甘氨酸，因此从甘氨酸的金属化合物着手，寻找可行的检测鉴定方法，比较而言应该是最简单的。甘氨酸金属离子化合物都没有好的解决方案，恐怕其它的更难。,GB 1903.2-2015,甘氨酸锌 鉴别方法：锌的鉴别、氨基鉴别、红外光谱 含量测定：铬黑T为指示剂，EDTA滴定锌；用凯氏定氮法测定氮含量 该方法也许对纯品有用，对中间或者低含量的产品不适宜 不能说明结构式所代表化合物的含量,甘氨酸锌,2种甘氨酸锌络合物的晶体结构（文献） 1:1型 Zn(C2H5NO2)24H2OSO4ZnSO46H2O 2:1型 Zn(C2H5NO2)2H2O,1:1型晶体结构,1:1型晶体结构,2:1型晶体结构,2:1型晶体结构,GB 30606-2014 甘氨酸亚铁,鉴别方法：二价铁、氨基、红外光谱 含量测定：二价铁、氮、三价铁、总铁 同样不能说明结构式所代表化合物的含量,甘氨酸亚铁晶体结构,甘氨酸亚铁的合成和晶体结构研究（文献） 晶体结构给出分子式 Fe(C2H5NO2)24H2OSO4FeSO46H2O,甘氨酸亚铁晶体结构,1：1型,甘氨酸亚铁晶体结构,甘氨酸铜,没有搜索到国家标准 文献 给出了晶体结构 甘氨酸与铜比例为1:1,甘氨酸金属结合物结构总结,从上述3种甘氨酸金属化合物的结构可知，硫酸根的存在阻止了甘氨酸的氨基与金属离子的配位 水参与了配位，占据了配位空间 甘氨酸的氨基成为铵基阳离子，失去了配位能力,如何更多形成螯合物,要使甘氨酸与金属离子形成螯合物，必须使甘氨酸的氨基保持氨基状态-NH2，不能形成阳离子-NH3+ 尽可能去除无机阴离子(SO42-、Cl-、NO3-)，避免使用强酸盐为反应起始物 尽可能去除水，反应介质能不能采用非水体系,甘氨酸金属化合物质量检测问题,甘氨酸金属络合物检测，现有方法是测定游离金属离子和游离氨基酸的含量，与总的金属离子和甘氨酸含量相比，其差值就认为是络合物的含量 此方法的问题在于认为非游离态部分的就是络合物，甚至是螯合物 从前面介绍的晶体结构的结果可知，非游离态的称之为甘氨酸金属离子结合物更好,如果只有甘氨酸的羧基与金属离子形成离子键，只能称之为甘氨酸盐 在甘氨酸盐的基础上，只有当有确切证据表明甘氨酸的氨基（-NH2）与金属离子形成了配位键，可认为生成了甘氨酸络合物 在络合物基础上，能证明一个甘氨酸的羧基和氨基同时与一个金属离子形成离子键和配位键，可认为生成了甘氨酸螯合物,如何证明结构,能够直接确定化合物结构式的方法就是单晶衍射，其它方法都是推测 单晶衍射需要样品为单晶晶体，不是粉末 将样品粉末培养成单晶，就是面临的难题 单晶培养，需要将样品先完全溶解，然后缓慢挥发溶剂，使样品缓慢结晶，形成足够大小的晶体颗粒，只要能够形成单晶，用四圆单晶衍射上机检测基本上没有问题,单晶检测结果直接给出样品的结构式、原子的位置、原子的连接方式、键长、键角，直接得出甘氨酸与金属离子的连接方式。是否形成螯合物一目了然。 单晶培养首先要样品能够溶解，对难溶样品就很难采用这种方式 单个氨基酸与金属离子的化合物可以采用，但必须可以溶解 混合氨基酸金属离子化合物难以采用,用已经证明了结构的单晶样品为标准品，选用可以用固体为样品的检测方式，比如红外光谱、近红外光谱、拉曼光谱、热分析（TGA/DSC）、X射线粉末衍射、电子能谱，等等进行检测，得到对应的标准谱图。 用实际生产样品做相应的谱图，与单晶样品的谱图比较，确定相应的特征谱图，作为定性检测的依据,在定性检测的基础上，设计合适的定量方法。 定量方法尽可能采用固体样品方式，因为将样品溶解的方法只能得到甘氨酸和金属离子各自的含量。 目前固体定量检测方式未见报道，需要进一步探索。 可供选择的有红外光谱、近红外光谱、拉曼光谱、拉曼光谱成像、粉末衍射等。 固体定量最大的问题是误差能不能控制在适当的可接受范围内。,检测总结,1、样品先培养单晶 2、单晶证明样品的分子结构，是否螯合 3、建立其它光谱特征图谱，作为生产监控 4、建立固体定量方法 5、建立质量标准,螯合率、稳定常数、螯合强度,由于氨基酸金属离子结合物的定性定量的难度，目前文献上或者实际应用中使用螯合率、稳定常数、螯合强度等参数来标明产品的质量好坏，这种方法可行不？,文献定义：络合物是指由中心离子的金属离子与氨基酸配位体（离子或分子）通过配位键的结合形成 文献定义：螯合物是指每个配位体至少有两个或两个以上的配位原子同时与中心金属离子成键形成环状结构,螯合率,螯合率是产品中螯合元素量占总元素量的比例 GB/T 13080.2-2005饲料添加剂 蛋氨酸铁铜锰锌螯合率的测定 凝胶过滤色谱法 该方法的大体操作如下： 1、氨基酸螯合物样品在水中加热溶解，离心后分成沉淀和溶液两部分 2、溶液中所含的可溶性氨基酸螯合物及金属离子经过凝胶分离,3、在规定的条件下洗脱，金属离子形成氢氧化物沉淀，将固定在凝胶柱顶端无法洗脱，可溶性氨基酸螯合物则可通过配体氨基酸的携带从凝胶柱上洗脱下来，实现和金属离子的分离 4、可溶性氨基酸螯合物洗脱分离完成后，加入EDTA溶液使金属离子从凝胶柱上洗脱 5、用原子吸收方法分别测定沉淀态氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物、可溶性金属离子中金属离子含量,6、计算出沉淀态氨基酸螯合物、可溶性氨基酸螯合物占金属总量的比例即可得到相应的氨基酸螯合物的螯合率 7、实际遇到的问题是检测结果极不稳定，容易出现同一批样品多次检测结果不一致的现象 为什么会出现结果不一致？,不一致的原因分析 该方法首先就认为产品已经是螯合物了，但事实上根本就没有直接证据。建议称为氨基酸金属离子结合物更恰当，至于氨基酸与金属离子是通过哪些化学键连接，都不影响产品叫结合物。称为螯合物就必须确定同一个氨基酸的多个功能基团与一个中心金属离子形成化学键。 该方法的第一步采用水溶解提取，沉淀部分就认定为螯合物了，谁能证明这沉淀就是螯合物。 同样经凝胶柱分离出来的可溶性部分也难说是螯合物，因此过凝胶柱时难以保证得到相同结果。 洗脱凝胶柱不易掌握,用原子吸收检测金属离子，一般用于极低浓度的溶液，用于常量规模的分析，误差较大。（比如低于ppm级的检测，相对误差超过10%，都可以接受，但常量分析有这么大的误差，没人会接受） 小结：这种测定螯合率的方法误差可能来自凝胶柱洗脱、原子吸收测金属离子误差大、螯合率的说法有错。该方法也许叫游离金属离子含量测定更恰当。,另外一种方法就是GB/T21996-2008饲料添加剂 甘氨酸铁络合物 采用的测定产品中总甘氨酸含量和游离氨基酸含量，其差值除以总甘氨酸量，得到螯合率。 此方法与上一个方法有同样的问题，认为非游离态的甘氨酸就是螯合了。 建议：在没有别的方法可采用的情况下，用上述两种方法可以测定游离态金属离子和游离氨基酸的含量，设置一个含量高限，产品可以规定游离态的不得高于某个限度值，就像药品里面规定杂质限度一样。,稳定常数,稳定常数是指产品中已经络合部分的稳定程度。螯合物在溶液中的稳定性常用螯合物稳定常数表示。 字面意思好理解，但测定稳定常数可不太容易，实际用处难说。,螯合强度,用极谱法测定金属离子与配位体形成络合物后，在电压作用下还原为金属（汞极）的难度加大，电位向更负的方向移动，络合物与金属离子还原为金属的E1/2差值，从而计算络合物的螯合强度。 该方法也是同样问题，先不论产品究竟螯合没有，直接就定位螯合强度。,我的想法是 这三个指标分别称为氨基酸金属结合物的 结合率 结合物稳定常数 结合强度 不要被络合、螯合 搞混了，反正也理不清。,甘氨酸与金属离子可能形成的结构片段,其它具有3个官能团的氨基酸的结合成键方式远远超过2个官能团的甘氨酸，成键绝不只是甘氨酸的简单几何倍数关系,最简单的甘氨酸都有至少6种结合状态，最理想的形式是第一种结构 但实际的存在状态，会因其它分子（水分子）、离子（硫酸根）的加入，导致复杂的结合状态，大量有用的结构分析手段失效 这种复杂的结合，致使检测质量的方法无所适从，采用单一的检测手段基本上判断不了产品的优劣,去年，国家陆续发布了几个关于仿制药一致性评价的文件,（直接引用）,（直接引用）,一致性评价的主要对象就是固体制剂 在药物方面已经意识到药物的有效性不仅仅是与药物API的含量相关 一般的合成化学药物的API(Active Pharmaceutical Ingredient) 基本上是分子量较小的有机物，结构式明确，同样API生产的制剂现在面临生物有效性不等效，生产企业遇到前所未有的挑战 而动物营养微量元素添加剂（氨基酸金属离子化合物）与固体药物的情况相同,而我们面临的问题应该比固体药物更难，表现在：分子结构式都不知道，只晓得有某个氨基酸、某个金属离子 固体药物的评价采用的方式也许可以借鉴 多数情况下，不能将药物进行样品前处理，前处理的结果就是改变了原有存在状态，从结果反推回去的结论不能说明原有状态,我们现在对固体检测的一点摸索 采用显微镜观察粉末结晶形态（见显微镜图），结晶形态都有区别，根据现在药物晶型的知识，晶型差别会导致生物有效性差别，显微镜图用于粗略外观监测产品工厂容易操作，可以配备 采用X射线粉末衍射进行分析（见XRD图），定性监测比较好，基本上能够区别不同的产品，但从衍射峰强度来看还有不一致的地方，如果要用XRD来定量分析，还需要进一步研究,其它可以用于固体样品检测的方法，还在进一步尝试 1 X-射线衍射法 1.1