高效液相色谱HPLC简介.ppt

高效液相色谱（HPLC）简介,盛 卫 坚,目 录,1, 液相色谱分析法的发展 2, 高效液相色谱的特点 3, 高效液相色谱仪简介 4, 液相色谱法介绍 5, 分析方法的选择 6, 实际分析操作过程,1、液相色谱分析法的发展,20世纪初： 俄国植物学家茨维特提出经典液相色谱法。经典液相色谱法包括柱色谱、薄层色谱、纸色谱。 20世纪60年代末： 随着色谱理论的发展、高效细微固定相的开发、高压恒流泵及高灵敏度检测器的应用，高效液相色谱法得到了突破性的发展。,2.1 HPLC的特点（一）,2 HPLC的特点,.2 HPLC的特点（二）,3、液相色谱仪简介,贮液罐A 高压输液泵A 阻尼器A 贮液罐B 高压输液泵B 阻尼器B 初步混合器 压力传感器 混合器 进样器 色谱柱 检测器 谱图输出,3.1 高效液相色谱仪构造,3.2 高压输液泵简介,高压输液泵的一般要求： 泵体材料耐酸、耐碱、耐化学腐蚀； 耐压40 50MPa，能连续工作； 输出流量稳定，重复性佳； 输出流量范围宽，对填充柱：0.1 100mLmin。,注射型泵-输出精确，无脉动，需更换溶剂而中断工作。 恒流泵 往复型泵-造价低廉，溶剂更换方便，但存在脉动。 恒压泵-压力恒定，但流量不恒定；,3.3 阻尼器介绍,阻尼器-消除、减轻往复式柱塞泵输出的压力脉动。,3.4.1 检测器简介（一）, 紫外吸收检测器（UVD） 原理：用特定波长的紫外光照射样品池，通过检测透光率的变化来测定样品浓度的检测器。它具有波长固定，波长可变和光二极管阵列三种类型。 特点：选择性检测器、对流量和温度敏感性低、灵敏度较高（10-9g）。 折光指数检测器（RID） 原理：监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测量试样浓度的检测器。 特点：通用性检测器，温变化要保持在0.001、灵敏度低（10-6g）。,3.4.2 检测器简介（二）, 电导检测器（ECD） 原理：监测溶液的电导率变化的检测器。 特点：选择性检测器、测量时要求恒温、对流动相的组成变化有明显响应、灵敏度低（10-3g）。适用于离子型化合物。 荧光检测器（FLD） 原理：某些溶质在紫外光激发后能发射可见光（荧光）的性质检测。 特点：选择性检测器、灵敏度高（10-12g）、对流量和温度敏感性低。,3.4.3 检测器简介（三）, 蒸发光散射检测器（ELSD） 原理：通过检测光散射程度而测定溶质浓度的检测器。色谱柱后流出物在通向检测器途中，被高速载气（氮气）喷成雾状液滴，再进入蒸发漂移管中，流动相不断蒸发，含溶质的雾状液滴形成不挥发的微小颗粒，被载气载带通过检测器。在检测器中，光被散射的程度取决于溶质颗粒的大小与数量。 特点：消除了溶剂的干扰，不受温度变化影响，灵敏度高，是通用型检测器。,4、色谱分析法简介,液固色谱-以固体吸附剂为固定相，依靠吸附脱附平衡实现分离，常用的固定相有碳酸钙、硅胶、三氧化二铝、氧化镁、活性炭等。 特点：有时会发生不可逆吸附，应用受到限制。 液液色谱-以吸附载带在惰性固相载体上的极性或非极性固定液为固定相，依靠溶解解吸平衡实现分离。 特点：固定液可选择余地大，重现性、分离效果好。,4.1.1 色谱分析法介绍（一）,4.1.2 色谱法简介（二）,体积排阻色谱法-以多孔性凝胶为固定相，借助多孔性凝胶孔径的大小，使样品中的大分子不能进入凝胶孔洞而完全被排阻，只能沿凝胶粒子之间的空隙通过色谱柱，而首先被洗脱出来。被分析样品可按分子的相对大小分别先后流出。 特点：洗脱时间短，但不适于分离组成复杂的混合物。 适用范围：分子量差别较大的样品。 离子对色谱法-分析离子化的强极性化合物。 亲和色谱法等等,4.1.3 色谱法简介（三）, 键合相色谱法简介 键合相色谱-是由液液色谱发展起来的，在高效液相色谱法中占有极其重要的地位。将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶（载体）表面的游离羟基上，生成化学键合固定相，解决固定液的流失问题,是目前用的最多的一种色谱分析法。 根据键合固定相与流动相相对极性的强弱，分为正相键合相色谱法与反相键合相色谱法。 正相键合相色谱-固定相极性强； 反相键合相色谱-固定相极性弱。,.2.1 色谱柱简介（一）,正相柱-固定相通常为硅胶以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2）和氰基团（CN）的键合相填料。 由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷，氯仿，二氯甲烷等。 反相柱-固定相通常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。 常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。,4.2.2 色谱柱简介（二）,聚合物填料柱-通常为聚苯乙烯二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等. 优点：PH值为114均可使用；具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。 缺点：色谱柱柱效较低。 其它无机填料柱-如石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用，石墨化碳可用于分离某些几何异构体。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。,4.2.3 色谱柱简介（三）,手性柱-将手性聚合物共价键和到硅胶上，实现外消旋物的广泛分离。如下图：,特点：具有专一性、通用性不广。 价格较贵。,5、分析方法的建立,5.1 色谱柱的选择： 疏水性的样品反相键合色谱； 亲水性的样品正相键合色谱； 生物大分子 体积排阻色谱； 无机离子化合物离子对色谱； 高分子聚合 凝胶色谱； 同系物的分离吸附、分配和键合色谱； 同分异构体 双键或取代基异构用吸附色谱； 多环芳烃异构选用反相键合； 对映异构体 流动相加入手性选择剂或具有光学活性的固定相。,5.2 流动相、配比、流量、梯度洗脱的选择,根据分析样品的结构、性质，结合色谱分析法确定流动相。 为达到较好的分离效果，确定流动相配比。 流动相的总流量增加，通常柱效增加。 梯度洗脱-在洗脱过程中连续或间断的改变流动相的组成，来改善分析效果的技术。适用范围：当样品中溶质组分较多及不同溶质的性质差别较大时。 特殊要求：当分析弱酸、弱碱性化合物时，可通过采用缓冲溶液及调节流动相的Ph值来改善峰型。,5.3 样品组分保留值和容量因子的选择,1. 分析时间控制在1030min ； 2. 容量因子控制在110，对于复杂的样品，容量因子范围较宽的通常使用梯度洗脱技术。 容量因子定义：调整保留时间与死时间之比，即可表示为: 3. 相邻组分分离度的要求： 对于难分离的样品,要求分离度R1.0。,6、样品分析方法介绍,1，流动相的准备 流动相的选择-有机相（甲醇、乙腈）与水（去离子水、缓冲溶液） 流动相的过滤-用孔径为0.45m滤膜过滤除去固体颗粒杂质。 流动相的脱气-超声脱气、吹氦脱气、加热回流法、抽真空脱气法、在线真空脱气法。 2，样品的准备 称量、用流动相超声溶解、过滤。,6.1 流动相及样品的准备,流动相过滤器 样品过滤器,6.2 分析方法的设定,流动相的配比及流量-选择何种有机相，纯水或缓冲溶液，有机相与水相的比例，流动相的总流量。 紫外检测波长的确定-通过测定被分析样品的