工艺技术_试谈超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺

第 26 卷第 5 期农 业 工 程 学 报Vol.26No.5 2010 年5 月Transactions of the CSAEMay 2010379 超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺 张丽萍 1,2，宋大巍2，马中苏1 （1吉林大学生物与农业工程学院，长春 130022；2黑龙江省农产品加工工程技术研究中心，大庆 163319） 摘要：为研究超声波处理对肝素提取效果的影响，并找出最佳的处理技术参数。采用商业屠宰猪的小肠，用超声波辅 助盐析法提取肝素，在超声功率、超声时间、超声温度和液料比 4 个单因素试验的基础上，采用四因素二次正交旋转组 合设计来优化工艺参数。试验结果表明，在超声功率 300 W，超声温度 40，超声时间 40 min，液料比为 15 mL/mg 条 件下肝素得率最高，达到 0.0184%，比盐析法的得率提高了 10%以上，节省提取时间 2 h 左右。试验结果表明，超声波 技术在肝素提取工艺中具有较高的应用价值，可作为一种新型工艺技术进行推广。 关键词：超声波，提取，优化，技术参数，肝素 doi：10.3969/j.issn.1002-6819.2010.05.065 中图分类号：O658.9，S872文献标识码：A文章编号：1002-6819(2010)-05-0379-06 张丽萍，宋大巍，马中苏. 超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺J. 农业工程学报，2010，26(5)：379384. Zhang Liping, Song Dawei, Ma Zhongsu. Process of heparin extraction using ultrasonic assisted salting outJ. Transactions of the CSAE, 2010, 26(5): 379384. (in Chinese with English abstract) 0引言 肝素是一种由艾杜糖醛酸和葡萄糖醛酸双糖重复单 位组成的酸性黏多糖，主要是通过肝素和抗凝血酶的结 合产生抗凝血功能1- 2。学者对肝素的深入研究过程中发 现，肝素不但有抗凝血、抗血栓形成的作用，还有抗炎、 抗过敏等生物学功能3- 4。肝素是一种资源依赖型产品， 主要原料是猪肠黏膜和牛肺，在小肠黏膜细胞内的含量 最高。中国是生猪资源大国，具有丰富的畜产品副产物 资源，肝素原料资源最为丰富，以猪肠黏膜为原料生产 的肝素抗凝活性高于牛肺肝素，在国际市场上更受欢迎。 中国是世界上肝素主要出口国家之一，但出口产品以低 效价的粗品肝素为主。原因是中国生产肝素精制品技术 还不过关，存在着产品效价低、提取率低及精制技术不 成熟等问题5- 6，每年要从国外大量进口精品肝素。针对 中国目前肝素利用、生产技术存在的问题，研究高效提 取和分离纯化肝素技术，具有重要意义。 中国畜禽加工副产物资源极为丰富，每年生猪屠宰 量 2 亿头以上，仅猪内脏一项每年就达 200 万 t，其中猪 小肠年产量约 50 万 t；每年肉牛屠宰量达到 4 400 万头， 其中牛肺的年产量约 20 万 t。但是，目前中国畜禽内脏 的利用率还很低，大部分以食品的形式出售和加工。在 中国大量畜禽副产物未被充分利用且畜禽副产物提取利 用技术水平落后的背景下，提出肝素提取纯化新工艺及 收稿时间：2009- 12- 12修订时间：2010- 02- 20 基金项目：黑龙江省“十一五”重点项目（GB06B403- 3） 作者简介：张丽萍（1957） ，女，吉林长春人，博士生，研究员，农副产 物综合利用研究方向。长春吉林大学生物与农业工程学院，130022。 Email: 通信作者：马中苏（1952） ，男，教授，博士生导师，农产品保藏与微 环境调控研究方向。长春吉林大学生物与农业工程学院，130022。 Email: 降解后的生物活性研究，可以大大提高畜产品加工副产 物的附加值，对于黑龙江省以及全国的肉类加工企业都 具有很好的应用前景。 国内外传统上采用盐析提取肝素，并结合离子树脂 交换进行肝素吸附分离7。然而这种方法具有提取率低、 提取时间长、溶剂消耗多、污染环境等问题8。超声波技 术是利用热力学，机械震动和空化作用产生的协同效应 起作用的。超声机械震动能产生和传送很高的能量来破 坏细胞结构，并且使可溶性物质产生很高的速度，加速 进入震动状态9。 超声的空化现象产生的剪切力能够破坏 细胞结构，并且提高传质系数10。超声提取技术作为一 种新兴技术，被广泛应用在从植物和水果原料中提取功 能成分11- 13， 以及从草药中提取生物活性组分14- 17。 与传 统方法相比，超声提取技术能够提高目标组分的提取率。 有些学者研究将超声技术应用在畜产品加工领域，比如 超声波处理对鸡肉的理化性质、适口性和风味的影 响18- 23。但是很少有将超声技术应用到畜禽副产物综合 利用方面的研究，目前尚没有利用超声波辅助从猪小肠 中提取肝素的报道。为了综合利用畜产品加工副产物， 增加猪小肠肝素得率，本研究首次将超声技术应用在肝 素提取工艺中，同时利用 SAS 软件分析优化提取的条件 和参数24。 1材料与方法 1.1试验原料 新屠宰的 20 付猪小肠（购自大庆市农贸市场） ，采 用 Warda 描述的方法处理原料25。将新鲜猪小肠立即加 入 0.125 mol/L 的亚硫酸氢钠作为抗氧化剂保存，放在干 冰上用密封的盒子包装运输到实验室，然后储存在实验 室-70冰箱里备用。猪小肠肝素标准品（购自中国药物 生物检定所，北京） ；胰蛋白酶（购自北京奥博星生物技 术责任有限公司） ；其他试剂均为市售（分析纯） 。 380农业工程学报2010 年 1.2试验方法 1.2.1盐析提取肝素 将 10 g 猪小肠（新鲜猪小肠去内容物）切成小块， 放在 JJ- 2B 组织捣碎机匀浆（荣华设备有限责任公司，中 国） ，将匀浆液移入封口的三角瓶中（250 mL） 。向三角 瓶中加入 150 mL 蒸馏水搅匀，调节溶液至 pH 8.5，再加 入 6 g NaCl 粉末进行盐析提取。 盐析时控制温度为 55， 盐析 4 h。盐析提取后，将粗提取物在 4、4 000 r/min 下离心 30 min（LGR10- 4.2 离心机，北京医用离心机厂， 中国） ，过滤后用浓硫酸氧化法测肝素浓度。 1.2.2超声波处理辅助盐析提取肝素 同盐析法的前处理，将 10 g 新鲜猪小肠去内容物切 成小块，放在组织捣碎机匀浆，然后将匀浆液移入封口 的三角瓶中（250 mL） 。向三角瓶中加入 150 mL 蒸馏水 搅匀，调节溶液至 pH 8.5，按照表 1 中的设计，在间歇 式超声处理机中进行超声处理 （JBT/C- YCL400 型超声波 药品处理机，济宁金百特电子有限公司） 。超声后的料液 加入 NaCl 粉末，分别调节 NaCl 质量浓度为 30、40 和 50 g/L， 进行分级盐析提取 1 h。 盐析提取温度控制在 55 （DK- 450B 型电热恒温水浴锅，上海森信试验仪器有限 公司，中国）是通过将三角瓶浸入自动控温的水浴锅中 进行控制的。提取后，将粗提取物在 4、4 000 r/min 条 件下离心 30 min，过滤后采用浓硫酸氧化法测肝素浓度。 每组试验重复 3 次，取平均值。 1.2.3咔唑法分析肝素含量 采用咔唑分析来检测制备的肝素中糖醛酸的含量， 这种方法对 Bitter 和 Muir 的方法进行了简单改进，在 298 nm 检测肝素样品的吸光度26。使用猪小肠肝素标准 品来制作标准曲线，提取液中的肝素的质量分数，可以 根据标准曲线方程进行计算。肝素的得率可以根据公式 （1）进行计算。 100% 提取肝素质量 肝素得率 原料质量 （1） 1.2.4单因素试验 单因素试验项目包括：液料比对肝素得率影响试验， 超声功率对肝素得率影响试验，超声时间对肝素得率影 响试验，超声温度对肝素得率影响试验。液料比对肝素 得率影响试验：设定蒸馏水与小肠黏膜匀浆料的液料比 5、10、15、20、25、30、35 mL/mg 7 个水平组，在超声 温度 40、超声功率 300 W、超声时间 40 min 条件下处 理； 超声功率对肝素得率影响试验： 选择 100、 150、 200、 250、300、350、400 W 7 个水平组，在液料比 15 mL/mg、 温度为 40、超声时间 40 min 条件下处理；超声时间对 肝素得率影响试验： 选取 20、 25、 30、 35、 40、 45、 50 min 7 个水平组，在液料比 15 mL/mg、超声温度 40、超声 功率 300 W 条件下处理； 超声温度对肝素得率影响试验： 设置超声温度为 20、30、40、50、60、70、80 7 个水 平组，在液料比 15 mL/mg、超声时间 40 min、超声功率 300 W 条件下处理。以上各组超声处理后经过滤、离心， 检测肝素得率。每组试验重复 3 次，取平均值。 1.2.5二次正交旋转组合优化试验 在单因素试验结果的基础上，以液料比、超声功率、 超声时间、超声温度为考察变量，以肝素得率为响应值， 采用二次旋转组合设计方案，用以优化超声波处理猪小 肠黏膜提取肝素的工艺参数。共设计了 36 组试验，每组 试验做 3 个平行样， 其因素水平编码见表 1。 利用 SAS 8.2 软件对试验数据进行统计分析，以获取最适工艺参数。 表 1因素水平及编码表 Table 1Table of factor levels and coding 水平 X1 液料比/ (mL/mg) X2 超声功率/ W X3 超声时间/ min X4 超声温度/ 252002520 1102503030 0153003540 - 1203504050 - 2254004560 1.2.6肝素提取物的红外光谱分析 采用红外光谱检测肝素的结构27。取 2.0 mg 猪小肠 肝素标准品或提取物与 200 mg KBr 进行混合压片。 用傅 里叶变换红外光谱仪对压片进行波长扫描，频率透射光 谱在 4 000400 cm- 1频率范围内进行检测。设置傅里叶 变换红外光谱仪的 DTGS（deuterated triglycine sulfatide， 氘化三甘氨酸硫酸脂）检测器的分辨率为 4 cm- 1，每个样 品进行 200 次扫描，将平均值累加。 2结果与分析 2.1盐析法提取肝素结果 将处理好的猪小肠黏膜采用盐析法提取肝素，在 55条件下盐析 4 h 后， 经过离心过滤后用浓硫酸氧化法 测肝素浓度。最终肝素的得率为 0.0165%。 2.2超声功率对肝素得率的影响 图 1 表明在不同超声功率下猪小肠提取肝素得率。 通过分析图 1 的趋势可知，当超声波功率在 100150 W 时，肝素得率较低；当超声波功率在 150300 W 时，肝 素得率随着超声波功率的增加而逐渐提高，超声功率在 300 W 时肝素得率达到最高点 0.0183%；当超声功率在 300350 W 时，肝素得率略有下降。 注：液料比 15 mL/mg，超声温度 40，超声时间 40 min 图 1超声功率对肝素得率的影响 Fig.1Effects of ultrasonic power on heparin yield 第 5 期张丽萍等：超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺381 由于肝素是细胞内的主要组分，在超声处理条件下 肝素能很快通过破坏的细胞膜溶解出来。当超声功率很 低时，超声没有达到声强的阈值，很难产生空化作用。 当超声功率达到 200 W 以上时则产生了空化作用，肝素 得率增加28。但超过 300 W 的超声功率可能产生空化气 泡塌陷，破坏了肝素的基本结构，导致肝素的分解，使 肝素得率下降29。 这与 He 等对大蒜素提取的研究结果类 似30。 2.3超声温度对肝素得率的影响 图 2 是在不同超声温度下猪小肠提取肝素得率。当 超声温度为 2025时，肝素得率较低；当超声温度升 至 25以上时，肝素得率开始逐渐提高，在 40时肝素 得率最高；超声温度在 4050时，肝素得率逐渐下降。 注：液料比 15 mL/mg，超声时间 40 min，超声功率 300 W 图 2超声温度对肝素得率的影响 Fig.2Effects of ultrasonic temperature on heparin yield 试验表明，超声温度在 40和 45之间较为适宜。 较高的温度可能会导致肝素的分解和活性损失，而且随 着温度的升高， 还会导致溶剂挥发加速、 能耗增加等问题。 2.4超声时间对肝素得率的影响 图 3 是不同超声时间下猪小肠提取肝素得率。 由图 3 可以看出，当超声时间在 2040 min 范围内，肝素得率 随着超声时间的延长而增加。 当超声时间达到 40 min 时， 肝素得率最高。当超声时间超过 40 min，肝素得率不再 增加。分析认为，随着超声时间的延长，被提取组分的 溶解量增加，所以肝素得率增加。当提取率达到一定阈 注：液料比 15 mL/mg，超声温度 40，超声功率 300 W 图 3超声时间对肝素得率的影响 Fig.3Effects of ultrasonic time on heparin yield 值时，延长超声时间也不会促进提取率增加。这可能是 由于超声的长时间震荡使一些不溶性蛋白质进入提取液 中，这些杂质会导致提取液黏度增加，增大传质阻力， 降低肝素得率31。另一方面，长时间的超声处理也会带 来能耗和生产成本的增加。 2.5液料比对肝素得率的影响 图 4 为不同的液料比条件下猪小肠提取肝素得率。 分析图 4 的变化趋势并通过显著性分析可以确定：当液 料比在 515 mL/mg 范围内时，随着液料比的增加，肝 素得率增加，肝素得率呈上升趋势；当液料比在 15 35 mL/mg 范围内时，肝素得率没有明显的增加，这与 Yvonne32等人从花生中提取白藜芦醇的研究结果类似。 注：超声温度 40，超声功率 300 W，超声时间 40 min 图 4液料比对肝素得率的影响 Fig.4Effects of solution to material ratios on heparin yield 液料比在提取中有很重要的作用。增大溶剂的量有 助于目标组分的提取，随着物料和溶液界面的浓度差增 大，大量的溶剂能促进肝素进行传质，超声使大量溶剂 进入样品组织，增加了固相和液相的接触面积，这与 Capote 的研究结果一致33。在液料比为 15 mL/mg 时，肝 素得率最大，继续增加液料比已没有意义。太多的溶剂 还会导致更多的杂蛋白等溶解，给纯化带来困难，也会 带来成本的提高。 2.6二次正交旋转组合优化工艺参数 试验方案及结果见表 2。应用 SAS 软件对所得的数 据进行多元回归分析，得到肝素得率与超声波处理各因 素变量的优化回归方程，即回归模型： Y =181.6733+1.6125X1+4.5992X2+10.1292X3 0.9775X410.1144X12+6.2825X1X2+1.9350X1X3+ 3.1238X1X410.9256X226.8338X2X37.4300X2X4 7.9806X32+0.3475X3X412.7844X42 表 3 和表 4 方差分析结果表明：回归模型的 F 值为 18.01，P0.001，大于在 0.01 水平上的 F 值，而失拟项 的 F 值为 2.55，小于在 0.05 水平上的 F 值，说明该模型 拟合效果好。 一次项、 二次项和交互项的 F 值均大于 0.01 水平上的 F 值，说明它们对肝素得率有极其显著的影响。 对此回归方程应用 SAS 8.2 软件对肝素提取条件进行优 化，优化后的工艺参数为：超声功率 307.9 W、超声温度 40.7、超声时间 40.7 min、 液料比 14.8 mL/mg，根据 382农业工程学报2010 年 此参数计算出肝素的最大得率为 0.0185%（预测值） 。为 检验优化后的参数， 采用上述最优条件进行验证试验 （重 复 3 次） ，同时考虑到实际操作的方便，将工艺参数设计 为： 超声功率 300 W、超声温度 40、超声时间 40 min、 液料比 15 mL/mg， 应用此参数进行验证试验 （重复 3 次） ， 结果测得肝素得率为 0.0184%（实测值） ，与传统盐析方 法比较，提取率提高 10%，提取时间缩短 2 h 左右。实测 值与模型的预测值非常接近，且重复试验相对偏差不超 过 1%，说明提取条件重现性良好。 表 2二次正交旋转组合优化试验设计方案及结果 Table 2Design and results of quadratic orthogonal rotation combination experiments 试验号 X1 液料比 X2 超声功率 X3 超声时间 X4 超声温度 Y 肝素得率/ (%) 111110.0151 2111- 10.0159 311- 110.0132 411- 1- 10.0154 51- 1110.0167 61- 11- 10.0136 71- 1- 110.0117 81- 1- 1- 10.0105 9- 11110.0115 10- 111- 10.0149 11- 11- 110.0123 12- 11- 1- 10.0130 13- 1- 1110.0154 14- 1- 11- 10.0152 15- 1- 1- 110.0123 16- 1- 1- 1- 10.0120 1720000.0142 18- 20000.0150 1902000.0161 200- 2000.0126 2100200.0171 2200- 200.0139 2300020.0136 24000- 20.0136 2500000.0167 2600000.0176 2700000.0183 2800000.0182 2900000.0181 3000000.0182 3100000.0181 3200000.0179 3300000.0193 3400000.0178 3500000.0188 3600000.0190 表 3回归方程的方差分析表 Table 3Variance analysis of regression equation 方差来源自由度平方和均方和FP 回归模型1419 897.00001 421.214318.010.0001 误差211 656.882078.8991 总误 R2=0.92313521 553.8820 表 4回归方程各项的方差分析表 Table 4Variance analysis of regression equation items 方差来源自由度平方和均方和FP 一次项43 055.3923763.84819.680.0001 二次项414 362.00003590.545.510.0001 交互项62 479.9623413.32715.240.0019 失拟项101 157.5693115.75692.550.0702 纯误差11499.312745.3921 2.6各因素重要性分析 在组合效应中每个因素的作用程度是不同的，为进 一步明确各个因素的重要性，通过分析各个因素的贡献 率予以确定。因素的贡献率的计算过程为：通过回归方 程可以获得每个因素的回归系数 F 值，并用公式（2）进 行计算因素的贡献率 j： = 0 (当 F1 时)； = 11/F (当 F1 时)， 1 1 2 m jjijjj i （2） 式中：因素的贡献；F各回归系数的方差比； i,j分别代表不同变量的取值； j第 j 个因素的一 次项；jj第 j 个因素二次项中的贡献；ij交互 项的贡献。 计 算 得 出 1=1.6607 ， 2=3.1640 ， 3=2.3765 ， 4=1.6876，通过各个因素的贡献率数值可知：23 41， 由此确定各个因子对肝素得率影响效应的重要性 如下：超声功率超声时间超声温度液料比。 2.7红外光谱分析肝素提取物 对超声波处理后提取的猪小肠肝素进行红外光谱分 析，与标准品肝素的特征吸收峰比较，2 种样品的峰型基 本一致，可以证明采用超声波处理猪小肠获得的肝素产 品与肝素标准品的结构性质一致。 3结论与讨论 试验以猪小肠黏膜为原料，采用单因素试验、二次 旋转组合试验和 SAS 统计分析法对超声波处理的工艺参 数进行了优化，获得了适宜的工艺参数：超声波液料比 15 mL/mg、超声温度 40、超声功率 300 W、超声时间 40 min。在最优条件下进行验证试验，结果肝素得率为 0.0184%。通过红外光谱分析证明获得的肝素产品与肝素 标准品的峰型一致。试验结果表明： 1）超声波辅助盐析法提取肝素的工艺参数优化，并 建立了超声波辅助盐析法提取肝素的回归方程模型，验 证试验后，实测值与模型的预测值非常接近，且重复试 验相对偏差不超过 1%，说明回归方程模型具有较好的实 际应用价值。 2）肝素提取纯化工艺中使用超声波处理料液，与传 统的盐析法比较提取率可提高 10%，超声后再行酶解和 分级盐析，使整个提取时间减少了 2 h 左右。说明超声波 技术在动物活性成分提取方面具有极好的应用效果。 第 5 期张丽萍等：超声波辅助盐析提取猪小肠中肝素的工艺383 参考文献 1Day J R, Landis R C , Taylor K M. 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