超速离心高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白和低密度脂蛋白胆固醇一种候选参考方法.ppt

超速离心-高效液相色谱测定血清高密度脂蛋白 和低密度脂蛋白胆固醇：一种候选参考方法,董军 国汉邦 陈文祥,卫生部老年医学研究所,HDL-C降低 和LDL-C升高，是明确的心血管病独立危险因素 心血管病防治工作需要准确的HDL-C和LDL-C测定结果 建立和保证HDL-C和LDL-C常规测定结果的准确性需要 可靠的参考方法,HDL-C 和LDL-C准确测定 必要性,美国疾病控制与预防中心(CDC) 定量法,D=1.006 超速离心分离极低密度脂蛋白（VLDL）， 制备底部组分（BF）( 包括IDL, LDL, HDL和Lp(a)等） 用肝素-锰离子试剂沉淀BF中的脂蛋白，制备HDL组分 分别用AK胆固醇参考方法测定BF 胆固醇(BFC)和HDLC， 自BFC中减去HDLC得LDL-C (包括IDL和Lp(a),样品量大(5 mL)，其应用受到可得样品量限制 LDL和HDL的分离采用化学沉淀法，影响因素较多 样品制备需多部手工容量操作，费时，技术要求高 受超速离心转头品种的限制，每次分析最多18 个样品 由于脂蛋白的不稳定性，样品制备过程（约需24-28小时） 本身造成HDL-C和LDL-C的变化,-定量法存在的问题,血清脂蛋白胆固醇的体外再分布,超速离心法: 各类脂蛋白的定义方法，在分析化学上可能 也是最可靠的脂蛋白分离方法，是一种物理分离方法， 影响因素最少。 电泳法: 很难用于精密脂蛋白分析。 沉淀法: 沉淀剂和沉淀条件多种多样，影响因素多， 较难实现一致的特异性。,脂蛋白的分离方法,超速离心中的定量操作困难、繁琐，样品量大 部分Lp(a)在HDL密度范围内，造成HDL测定偏差,超速离心法（结合精密胆固醇分析） 参考方法,血清脂蛋白的密度分布,LDL,HDL,VLDL,Lp(a),Lp(a)是二硫键连接的LDL-apo(a)复和体，还原剂 可使Lp(a)解离为LDLLp(a-)和apo(a). Lp(a-)密度与LDL相近，或略小于LDL. 若能建立条件，使Lp(a)解离，又不改变HDL的密度 性质，则可实现HDL的超速离心分离.,Lp(a) LDL-apo(a)复合体,不同密度下ME对超速离心BFC的影响,ME对血清脂蛋白密度的影响,样品溶液中ME浓度对1.063密度下超速离心BFC的影响,取来自不同个体的血清49 份 在1.063背景密度及ME（0.05 mol/L）存在和不存在下 超速离心，测定BFC（BFC1.063ME(+)和BFC1.063ME(-)） 用免疫比浊法测定Lp(a)质量 用DCM测定HDLC（HDLCDCM）,ME 解离Lp(a) 有效性,BFC1.063ME(-)与BFC1.063ME(+)之差与Lp(a)的关系 (r=0.848),BFC1.063ME(-)与BFC1.063ME(+)之差与HDLC的关系 ( r=0.093,),BFC1.063ME(+)与 HDLCDCM之差与Lp(a)的关系 （r = 0.414, P0.005）,Lp(a)可与 脂蛋白发生非共价键结合 此种结合不能被超速离心完全解离 脯氨酸可以消除Lp(a)与其他脂蛋白的非共价结合 在d =1.150背景密度下试验脯氨酸的作用: 在ME存在下，无脯氨酸时约10的Lp(a)免疫原性分布在顶部 在ME存在下，含脯氨酸时顶部组分中无Lp(a)免疫原 性 提示血清经ME作用后，部分游离apo(a)仍与某些脂蛋白以 非二硫键形式结合，这种结合可被脯氨酸解离,脯氨酸可以解离Lp(a)与其他脂蛋白的非共价键结合,脯氨酸存在下BFC1.063ME(+)与 HDLCDCM之差与Lp(a)的关系 （r = -0.232, P0.05）,用ME使 Lp(a) 解离为游离apo(a)和Lp(a)Lp(a-) 用脯氨酸解离Lp(a)或apo(a)与脂蛋白的可能非共价键结合 1.063密度下超速离心，将HDL（BF1.063）与其他脂蛋白分离 1.006密度下超速离心，将HDL和LDL（BF1.006）与VLDL分离 用HPLC测定BFC1.006和BFC1.063 HDLC = BFC1.063 LDLC = BFC1.006 - BFC1.063 (含IDLC和Lp(a)C),方法原理,超速离心密度液配制: 密度液I: 含0.1M脯氨酸的溴化钠溶液，使密度为1.006 密度液II: 含0.1脯氨酸和0.05M ME的溴化钠溶液，调节溴 化钠浓度，使密度为1.0666 (两种密度液（0.8 ml）与血清（0.05 ml）混合 后分别给出背景密度1.006 g/ml和1.063 g/ml) 标准溶液和内标溶液配制: 胆固醇乙醇溶液: 浓度 0.646, 1.293, 2.586 , 5.172 , 7.758 mmol/L 豆甾醇乙醇溶液: 浓度5.17 mmol/L，作内标溶液,密度液及标准溶液配制,样品制备: 用稀释器的稀释功能加入血清样品(体积为0.05ml)和 稀释剂（密度液, 体积为0.8 ml) 超速离心条件: 20, 23000 rpm, 离心18.5 h 离心管切割: 用离心管切割器在离心管中液体的中间位置切割离心管，取下部 离心管，内含1.006 g/ml背景密度下的BF（BF1.006）和1.063 g/ml 背景密度及ME存在下的BF（BF1.063），进行胆固醇分析 HDLC = BFC1.063 LDLC = BFC1.006 - BFC1.063,超速离心分离脂蛋白组分,高效液相色谱测定胆固醇 I,将内含不同BF的下部离心管，置10-ml具盖试管中 标准溶液0.05 ml，用0.5 ml乙醇冲入10-ml具盖试管中 向各试管中加乙醇-8.9 mol/L氢氧化钾（9:1）4 ml 各管加内标0.05 ml，用0.5 ml乙醇冲入10-ml具盖试管中 水平式振荡器振荡20 min 50 水解2h,高效液相色谱测定胆固醇 II,400ul Acetone,20l, 4MH2SO4-4MCrO3,vortex, RT 5min,0.5ml Hexane, 0.5ml water,Vortex, 5min,200ul supernatant dry down for chromatography,0.5ml 水解液,0.5mlH2O, 1mlHexane,Vortex, 20min,0.5ml,Hexane, 挥干,高效液相色谱分离胆固醇和6-氯豆甾醇,超速离心法HDLC(BFC1.063ME(+)与 HDLC DCM的关系 (r = 0.998),血清 平均值 (mmol/L) 平均批内CV(%) 总CV (%),HDLC LDLC HDLC LDLC HDLC LDLC,1.342 2.897 0.67 0.48 0.96 1.12 2.202 2.778 0.60 0.78 1.01 0.92 1.292 4.148 0.91 0.45 1.73 0.65 0.880 2.874 1.21 0.68 2.07 0.82,超速离心HPLC法测定血清HDLC和LDLC的精密度,用超