凋亡相关基因-Bax在不同细胞中表达产物差异检测.ppt

凋亡相关基因Bax 在不同细胞中表达产物差异检测,细胞损伤与保护实验（三）,原 理,免疫细胞化学（免疫组化）是将抗原、抗体间的免疫反应引入细胞标本，并通过对其所带有的特殊标记物的显示，籍以对细胞内某抗原或抗体作定性、定位以及定量检测。 亲和组织化学：则将一些具有双价或多价结合力的物质(生物素)，应用于免疫组化，使得抗原抗体的亲和力比免疫组化高出100万倍。其更具高灵敏性和高特异性。,原 理,Bax 凋亡相关基因 Bcl-2家族成员 细胞损伤时其蛋白构象发生改变（寡聚化） 作用线粒体膜，使其膜通透性增加，释放Cytc，细胞凋亡,原 理,本次实验以Bax构象蛋白为抗原，用小鼠特异性抗体（一抗）与其结合，再用生物素标记的羊抗小鼠抗体（二抗）与前者结合，形成了生物素复合物。 此复合物与SABC作用，使得检测物被放大，最后在显色剂DAB的作用下，Bax构象蛋白显色（褐色）。,器材与试剂,仪器：移液枪、枪头、滴管、显微镜 材料：培养细胞 试剂：甲醇、PBS、封闭液、一 抗、 二抗、 SABC、DAB 、0.3H2O2-PBS、,试 剂 说 明,PBS： 磷酸盐缓冲液（ 0.01M pH7.4 ） 封闭液： 山羊血清(或BSA)，用时PBS稀释 一 抗： 小鼠IgG，用时PBS稀释 二抗： 生物素标记的羊抗小鼠IgG 0.3 H2O2-PBS（甲醇） 消除内源性过氧化物酶活性作用 SABC (avidin-biotin-peroxidase complex 链酶亲和素 生物素过氧化物酶复合物) ： 抗生物素，起到放大作用 DAB(diaminobenzidine)显色液： 3,3-二氨基联苯胺,实验步骤,培养细胞（96孔板，每组3正常、3损伤、3损伤恢复） PBS洗，5min X 3次 (轻轻地洗涤) 甲醇固定10min PBS洗，5min X 3次 加入封闭液（1:10） 25l，37 ，30min 加一抗（1:300）25l，37，1h (或4过夜) PBS洗，5min X 3次 加二抗（1ml PBS加入生物素化山羊抗小鼠IgG 10l）25l，37 ，1h PBS洗，5min X 3次,实验步骤,加0.3 H2O2-PBS（甲醇），37 ，30min PBS洗，5min X 3次 SABC工作液（1ml PBS加入SABC 10l，混匀）20-30l，37 ，1h PBS洗，5min X 3次 DAB显色： DAB显色工作液配制（现配）：1ml蒸馏水，加试剂盒中A、B、C试剂各一滴，混匀后加至细胞孔板，镜下控制，以蒸馏水终止反应。 观察结果,实验结果,缺糖前 Hela 细胞,缺糖 24h Hela细胞,缺糖 48h Hela 细胞,缺糖前 PC 12细胞,缺糖 24 h PC 12细胞,缺糖 48 h PC 12细胞,注意事项,一、二抗的稀释度、孵育时间和温度与染色强度、背景有直接关系。 染色背景过高，在DAB显色之前，用含0.01-0.02TWEEN20的PBS洗涤标本4次，再PBS洗2次，然后DAB显色。 DAB有毒性（小心） SABC试剂盒保存在4 为佳(2年)，而