质粒DNA的提取、酶切及检测.ppt

质粒DNA的提取、酶切及检测,相关知识,基因工程又称DNA重组技术 外源基因通过体外重组后，导入受体细胞内，使这个基因能够在受体细胞内复制、转录、翻译、表达的操作 包括基因的分离、重组、转移、基因在受体细胞内的保持、转录、翻译表达等全过程 基因工程四要素：目的基因、工具酶、载体、受体细胞,常用到的工具酶,限制性内切酶 连接酶 聚合酶 逆转录酶 DNA酶和RNA酶,结构的三大要素： 多克隆位点 选择标记（耐药性） 独立的复制单位 种类： 质粒 噬菌体 酵母人工染色体（YAC）,载 体,质 粒（plasmid）,是染色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复制并能稳定遗传的遗传因子。 常常编码一些对宿主有利的酶的基因，这些基因的表型包括抗生素抗性、产生抗生素、限制酶、修饰酶等 质粒的复制：严紧型复制（1n个） 松弛型复制（20个以上）,实验目的和要求 学习和掌握质粒提取的原理与操作、限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。,第一部分 质粒DNA的提取,碱裂解法,一、实验目的,通过本实验学习和掌握碱裂解法提取质粒的原理与操作。,二、实验原理,在EDTA存在的条件下，经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。 此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。 而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有蛋白质，实验中加入碱性酚（pH8.0）和氯仿混合液的抽提可以除去蛋白质。 含有质粒DNA的上清液用乙醇沉淀，获得质粒DNA。,三、主要试剂,溶液I，50 mM葡萄糖/ 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； Tris-Cl控制溶液的pH，葡萄糖使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，配在分子生物学试剂中的主要作用是：抑制DNase的活性，,溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；,NaOH是最佳的溶解细胞的试剂，这是由于细胞膜发生了从双层膜结构向微囊结构的相变化所导致。SDS是为下一步操作做的铺垫。,溶液III，3 M醋酸钾/ 2 M醋酸。,钾离子置换了SDS中的纳离子形成了不溶性的PDS，而高浓度的盐，使得沉淀更完全。钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了，大肠杆菌的基因组DNA也一起被共沉淀。因为基因组DNA太长了。 醋酸中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA。,平衡酚：氯仿（1：1） 作用：酚使蛋白质的变性，但是水饱和酚的比重略比水重，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收。 乙醇：除去DNA水化层，使DNA沉淀 TE缓冲液：溶解DNA,四、实验步骤,接含PUC18(或pET21a)质粒的单菌落于3ml LB Amp+液体培养基中 370C，190rpm振荡培养过夜 取1.5菌液入1.5ml的dorf管中 12000rpm、离心2s，弃上清，收集菌体 100uL溶液I悬浮菌体（充分振荡），室温（或冰浴）3min 加入200uL溶液II（轻轻混匀），冰上静置3min裂解菌体, 加入150uL溶液III（轻轻混匀），冰上静置5min质粒DNA复性 12000rpm，离心5min，取上清记录体积到一新管 上清加等体积的酚：氯仿：异戊醇（振荡混匀） 12000rpm，离心15min，取上清记录体积到一新管 （可省略）上清加等体积的氯仿：异戊醇（振荡混匀） 12000rpm，离心2min，取上清记录体积到一新管 上清加2倍体积的无水乙醇（充分混匀），室温2min ,12000rpm，离心5min 沉淀用70%乙醇1mL洗涤两次（振荡混匀、离心） 12000rpm，离心2min 沉淀风干 沉淀用20uL TE溶解，-200C保存,第二部分 质粒酶切,实验目的 理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具 掌握酶切的基本操作,实验原理,制性内切酶将质粒和外源基因用限制性内切酶酶切，再经过DNA连接酶连接，便可获得携带外源基因的重组质粒，重组质粒可以转移到另一个生物细胞中去，进而复制、转录和表达外源基因产物。限制性内切酶是能识别双链 DNA 分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。 EcoR和Hind的识别序列和切口是：EcoR:GAATTC;Hind:AAGCTT。G，A等核苷酸表示酶的识别序列，箭头表示酶切口。,限制性核酸内切酶的命名法 用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌Rd菌株用d，即Hind。 如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制与修饰体，则以罗马数字表示，如Hind, Hind，Hind等。,II型限制性内切酶能识别专一的核苷酸顺序，并在该顺序内的固定位置上切割双链。由于这类限制性内切酶的识别和切割的核苷酸都是专一的。因此，这种限制性内切酶是DNA重组技术中最常用的工具酶之一。这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸，少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的。 II 型限制性内切酶的识别顺序是一个回文对称顺序，即有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同。这种酶的切割可以有两种方式：,粘性末端；是交错切割，结果形成两条单链末端，这种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘性末端。 如EcoRI的识别顺序为： 5 GAA|TT_C 3 3 C_TT|AAG 5 垂直线表示中心对称轴，从两侧“读”核苷酸顺序都是GAATTC或CTTAAG，这就是回文顺序（palindrome）。_和表示在双链上交错切割的位置，切割后生成5G和AATTC3、3CTTAA和G5二个DNA片段，各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。,II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是： 5 GAT|ATC 3 3 CTA|TAG 5 切割后形成5 GAT和ATC 3、 3 CTA和TAG 5。这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。,平头末端：,影响核酸限制性内切酶活性的因素 (1) DNA的纯度； (2) 酶切消化反应的温度； (3) 溶液中离子浓度及种类； (4) 缓冲液的 pH值。,三、实验操作,加样时，严格操作，做到准确无误。该项操作环节是整个实验的关键之一。,置于37水浴酶解1小时。,第三部分 琼脂糖凝胶电泳,相关知识,琼脂糖凝胶 琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷，透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。,核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系,核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系,不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。,影响迁移率的因素,DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压 一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。,常用染料,EB:溴化乙锭，能插入DNA分子碱基对之间。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，呈橙红色。 EB染料优点：染色操作简便，快速；灵敏度高；可以加到样品中或胶中。 EB是诱变剂，使用时一定要戴手套。 EB废液要经过处理才能丢弃。 GoldView I是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，与核酸结合后能产生很强的荧光信号，在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光。,一、实验目的,通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。,二、实验原理,核酸pH8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。不同分子量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。,三、实验操作步骤,琼脂糖凝胶的制备 凝胶板的制备 加样 电泳 结果观察,将0.08g琼脂糖溶解在100 ml的1TBE电泳液中,配制成0.8%琼脂糖凝胶溶液 当琼脂糖溶液的温度降至6080时，加入GoldView I使其终浓度约为0.1l/ml,混匀后，迅