酶学第五章酶的分离纯化与制剂.ppt

第五章 酶的分离纯化与制剂,主要内容：酶分离纯化的一般原则、酶的抽提、酶的纯化原理与方法、酶的纯度与产量、酶的纯度与产量、酶的剂型与保存,第一节 酶分离纯化的一般原则,预防蛋白质变性失效的方法与措施 主要内容：防止酶变性失效 选择有效的纯化方法 酶活性测定贯穿纯化过程的始终,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,3,一、酶分离纯化的概述,酶工业生产中属于下游技术！ 最终目的（ ） 整个工作包括三个基本环节： (1) 抽提（extraction）：是要将酶从原料中抽提出来作成酶溶液； (2) 纯化（purification）：是将酶和杂质分离开来，或者选择地将酶从包含杂质的溶液中分离出来，或者选择地将杂质从酶溶液中移除出去； (3) 制剂（preparation）：是要将纯化的酶作成一定形式的制剂。,获得高度纯净的酶制剂,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,4,一、酶分离纯化的概述,3. 酶与一般蛋白质纯化过程相比独有的特点： (1) 特定的一种酶在细胞中的含量很少； (2) 酶可以通过测定活力的方法加以跟踪。,给纯化带来了麻烦,迅速找出纯化过程的关键,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,5,二、防止酶变性失效,除了少数例外，所有操作都必须在低温条件下进行，特别是在有机溶剂存在的情况下更应小心； 大多数酶在pH4或pH10的情况下不稳定，应控制整个系统不要过酸、过碱，同时要避免在调整pH时产生局部酸碱过量； 酶和其他蛋白一样，常易在溶液表面或界面处形成薄膜而变性，故操作时要尽量减少泡沫形成； 重金属等能引起酶失效，有机溶剂能使酶变性，微生物污染以及蛋白水解酶的存在都能使酶分解破坏，所有这些必须高度重视。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,6,三、选择有效的纯化方法,酶纯化的最终目的是要将酶以外的一切杂质(包括其他酶)尽可能地除去，因而，容许在不破坏待纯化的“目的酶”的限度内，使用各种“激烈”手段。 由于酶和它作用的底物、它的抑制剂等具有高的亲和性，因此可应用各种亲和分离法；而且，当这些物质存在时，酶的理化性质和稳定性往往会发生一些有利的变化。这样又扩大了纯化方法与纯化条件的选择范围。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,7,四、酶活性测定贯穿纯化过程的始终,酶具有催化活性，通过检测酶活性可以跟踪酶的来龙去脉，为酶的抽提、纯化以及制剂过程中选择适当的方法与条件提供直接的依据。 从原料开始，整个过程中每一步都要进行比活力与总活力的检测与比较，这样，我们就能知道在某一步骤中可采用些什么方法与什么条件，它们分别使酶的纯度提高了多少，回收了多少酶，从而决定其取舍。,第二节 酶的抽提,抽提的要求是要将尽可能多的酶、 尽量少的杂质从原料引入溶液。 主要内容：预处理和破细胞 抽提 浓缩,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,9,一、预处理和破细胞,着手酶的提取前，通常应先对酶的原料进行适当的预处理 (Pretreatmention)。例如： (1) 动物材料要先剔除结缔组织、脂肪组织和血污等 ； (2) 油质种子最好先用乙醚等脱脂； (3) 种子研磨前应去壳，以免丹宁等物质着色污染； (4) 对于微生物材料则应将菌体和发酵介质加以分离。 2. 在这些预处理后，尽可能以非常新鲜的状态直接应用; 否则，应将完整材料立即冰冻保存。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,10,一、预处理和破细胞,3. 根据酶的分布可分为细胞内酶和细胞外酶。 (1) 细胞外酶在合成以后就直接分泌到介质中，因而没有破细胞问题； (2) 细胞内酶却只有在细胞破裂后才能释放出来，而且抽提效果往往和酶在细胞内的分布位置、存在状态以及细胞破碎的程度有关。 周质酶”（periplasmic enzyme）通常只需将外层细胞壁或膜破坏后就可释放； “膜结合酶（membrane-binding enzyme）则往往还有一个切断酶与颗粒体或膜的连结问题。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,11,一、预处理和破细胞,4. 细胞破碎（cell disruption） (1) 机械破碎法 机械捣碎法，绞肉机、高速组织捣碎器 研磨法 匀浆法 高速捣碎器操作简便、破碎效果高，但易引起局部温度过高，导致酶失效； 加石英砂研磨，特别是用玻璃粉或氧化铝代替石英砂时，要注意有时也可能发生吸附变性。 在上述机械处理后，为了有利于下一步抽提，可进一步作成丙酮干粉，或者进行反复冰冻溶解处理。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,12,一、预处理和破细胞,4. 细胞破碎（cell disruption） (2) 丙酮干粉（acetone powder）处理法 适用于微生物材料 一般程序是先将材料粉碎、分散，然后在0以下的低温条件下、加入510倍预先冷至约-20的丙酮，迅速搅拌均匀，随即过滤，最后低温干燥，研磨过筛 丙酮处理优点： 能有效地破坏细胞壁（膜）； 有利于除去大量脂类物质，以免它在以后的步骤产生干扰； 能使某些膜结合酶易于溶解； 丙酮干粉含水量低，便于保存。 缺点：丙酮可能引起某些酶变性失效。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,13,一、预处理和破细胞,4. 细胞破碎（cell disruption） (3) 物理破碎法 温度差破碎法 压力差破碎法：高压冲击法；突然降压法；渗透压差法 超声波破碎法 (4) 化学破碎法 有机溶剂处理 表面活性剂处理 (5) 酶法破碎法 外加酶处理 自溶法(Autolysis),所谓自溶，就是将浓的菌体悬液在适宜的温度与pH条件下直接保温，或加甲苯、乙酸乙酯以及其他溶剂一起保温一定时间，让菌体自溶液化。 有人认为不是好方法，理由是： 第一，自溶液中成分十分复杂； 第二，有破坏目的酶的危险。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,14,一、预处理和破细胞,4. 细胞破碎（cell disruption） (6) 注意微生物的种类不同处理方法及难易程度也有差异。 霉菌：易处理 细菌：少量超声和溶菌酶；大量丙酮干粉法或自溶法；工业生产中，细菌材料可以用细菌磨或挤榨器等处理。 酵母：由于其壁厚较难对付，过去多用自溶法，后来采用的办法有：细胞壁溶解酶处理法；稀盐溶液振荡法；冷热破壁法。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,15,二、抽 提,1. 抽提方式 (1) “普遍”抽提； (2) 选择性抽提，即先后用不同溶剂进行选择性抽提。 2. 由于大多数酶属于球蛋白类，一般都溶于稀盐、稀酸或稀碱的水溶液。但抽提液的具体组成和抽提条件的选择则取决于酶的溶解性、稳定性以及如何最有利于切断酶和其他物质的联系。 3. 酶提取的主要方法 (1) 盐溶液提取 (2) 酸、碱溶液的提取 (3) 有机溶剂提取,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,16,二、抽 提,4. 酶提取的注意事项 (1) pH 应考虑的是酶的酸碱稳定性，选择的pH不能超出酶的稳定范围。 从最佳的抽提效果而言，选择的pH最好远离目的酶的等电点。也就是说，酶如果是酸性蛋白质，则宜用碱性溶液抽提，反之，碱性蛋白质宜用酸性溶液。例如胰蛋白酶的抽提，通常选用0.125mol/L的硫酸，这是因为除了考虑到酶的稳定性、溶解性外，这种抽提条件下溶入的杂质也较少。 考虑到有利于切断酶和细胞内其他成分间可能有的联系，通常以选用pH46为佳。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,17,二、抽 提,4. 酶提取的注意事项 (2) 盐 大多数蛋白质在低浓度的盐溶液中有较大的溶解度，所以，抽提液一般采用等渗盐溶液，最普通的有0.0200.05mol/L的磷酸缓冲液，0.15mol/L NaCl溶液等。 焦磷酸钠溶液和柠檬酸钠缓冲液，由于有助于切断酶和其他物质的联系，并有整合某些金属的作用，因此用得也很多。 某些报道表明，少数情况下，如抽提霉菌脂肪酶，用水的效果亦佳，这可能与低渗可破坏细胞结构有关。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,18,二、抽 提,4. 酶提取的注意事项 (3) 温度 通常，抽提温度多控制在04左右。如果待纯化的酶比较稳定，则可以例外。 例如，胃蛋白酶就可在37条件下保温抽提。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,19,二、抽 提,4. 酶提取的注意事项 (4) 其他 破细胞时，某些亚细胞结构也往往受到损伤，这样就可能给抽提系统带来各种不稳定因素。因此，有时在抽提液中还需要加入某些物质。 例如，为防止蛋白酶的破坏性水解作用可加入苯甲基磺酰氟（PMSF），为防止氧化等因素的影响可加入半胱氨酸、惰性蛋白和底物等。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,20,二、抽 提,5. 结合紧密的结酶 常以脂蛋白络合物形式存在。 有的在做成丙酮粉末以后就可抽出，有的则需要使用较强烈的手段，用正丁醇等处理。正丁醇的特点是兼具高度的亲水性和亲脂性(特别是磷脂)，能破坏酶与脂蛋白的连结使酶进入溶液。 近年来广泛采用的还有各种表面活性剂和去污剂，如胆酸盐、Triton、Toween等，它们常用于抽提呼吸链系统的酶系。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,21,二、抽 提,6. 抽提液 (1) 用量通常为原料量的15倍，有时为了提高抽提效果，要进行反复抽提，这样，液量就可能大些。 (2) 抽提后的细胞残渣或发酵液的固体成分一般可用离心法或压滤法除去，植物原料的抽提液在冷室中放置过夜往往就会自动澄清。 某些情况下，在进行抽提液离心前，加入氢氧化铝凝胶或磷酸钙胶等物质，常有助于除去悬浮的胶体物质。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,22,典型的抽提液组成成分,0.15mol/L KCl 0.3mol/L 蔗糖,离子强度调节剂,pH缓冲剂,温度效应剂,蛋白酶抑制剂,抗氧化剂,重金属络合剂,增溶剂,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,23,二、抽 提,7. 新技术 “扩展床吸附层析”（expanded bed adsorption chromatography） 商品名：STREAMLINE 简化分离纯化工作，开发了一种将抽提液的分离和相继的纯化步骤结合在一起的技术 通过这一技术人们可以直接从含有颗粒体的物料，如发酵液、细胞破碎液中截获所需要的蛋白质或酶，移去颗粒成分，从而免除了离心、过滤，甚至浓缩等繁复的下游（downstream）步骤。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,24,三、浓 缩,抽提液和发酵液中酶的浓度一般都很低，所以在进行纯化前往往须先加以浓缩 (Concentration) 作用： (1) 每一步的回收率升高； (2) 酶和蛋白质在浓溶液中的稳定性也往往较高。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,25,三、浓 缩,3. 常用的浓缩的方法有以下几种 (1) 蒸发 (Evaporation) 减压蒸发浓缩法：效率低、费时间、要加热、产泡沫、易变性，不能用于稳定性较差的酶。同时，蒸发过程还可能出现增色现象，影响产品的质量 超蒸发浓缩法：让暖空气流通过冷的酶溶液表面，或让暖空气流通过装有酶液的透析袋使之加速蒸发，但此法效率不佳 薄膜蒸发浓缩：现在应用较多,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,26,三、浓 缩,3. 常用的浓缩方法 (1) 蒸发 薄膜蒸发浓缩，即将待浓缩的酶溶液在高度真空条件下变成极薄的液膜，并使之与大面积热空气接触，让其中的水分瞬时蒸发而达到浓缩的目的。 薄膜蒸发浓缩器有三种形式：升膜、降膜和刮板。 对于较粘稠的样品，后一种形式似乎更为适合，不过薄膜浓缩常会带来增色现象。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,27,三、浓 缩,3. 常用的浓缩方法 (2) 超过滤（ultrafiltration） 在加压情况下，将待浓缩液通过一层只允许水分子和小分子选择性透过的微孔滤膜，而将酶等大分子被滞留，从而达到浓缩目的的一种技术。 优点： 没有破坏；没有相变化；保持原来的离子强度和pH；如果膜选择适当，浓缩过程还可能同时进行粗分，成本也不高，故为人们所乐用。 超过滤可用于小量样品，也可用于工业生产规模，现在已有各种超过滤装置可供选择。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,28,三、浓 缩,3. 常用的浓缩方法 (3) 胶过滤 (gel filtration) 利用葡聚糖凝胶Sephadex G-25或G-50等能吸水膨润，而酶等大分子被排阻于胶外的原理进行的浓缩。 通常采用“静态”方式，应用这种方法时，胶吸水膨润一定时间后，再借助过滤或离心等办法分出浓缩的酶溶液。 优点： 条件温和；操作简便；没有pH与离子强度等的改变。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,29,三、浓 缩,3. 常用的浓缩方法 (4) 反复冻融 (freeze-thawing) 溶液相对纯水，会发生融点升高、冰点降低的现象。 主要方式：先将溶液冻成冰块，然后使之缓缓溶解，这样，几乎不含蛋白质和酶的冰块将浮于液面，而酶等则融解并集中于下层溶液(至原体积的四分之一左右) 主要问题：浓缩过程可能会发生离子强度与pH的变化，从而导致酶失效。反复冻融实际上最好与超声波破碎或酶解一起使用，否则冻融后黏度很大，蛋白质容易聚集，通常都是反复冻融后超声波处理，效果较好。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,30,四、生物材料的选择,来源: 动物, 植物和微生物及其代谢产物 选择材料的要求 (1) 从工业生产角度，来源丰富, 含量较高, 制备工艺简单, 生产成本较低，不能同时具备时抓住主要矛盾决定取舍； (2) 从科研工作的角度，只须符合实验预定的目标要求; (3) 植物材料要注意季节性、地理位置和生长环境等; (4) 动物材料时要注意年龄、性别、营养状况、遗传素质和生理状态等; (5) 微生物材料要注意菌种的代数和培养基成分等。 材料选定后要尽可能保持新鲜，尽快加工处理，如暂不提取，应冰冻保存。,第三节 酶的纯化原理与方法,主要内容：根据溶解度不同、分子大小不同、 电学解离性质、专一亲和作用等。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,32,一、纯化工作前的准备,明确抽提液中的杂质成分 目的酶 + 小分子杂质 + 大分子杂质 (1) 小分子杂质一般会自然地除去，比较容易解决 (2) 大分子杂质包括核酸、粘多糖和杂蛋白 核酸可加硫酸链酶素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白使之沉淀移去，必要时也可使用核酸酶; 粘多糖则常用醋酸铅、乙醇、丹宁酸和离子型表面活性剂等处理解决，有时也可用酶； 杂蛋白的去除是纯化的主要工作，也是比较困难的工作,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,33,一、纯化工作前的准备,为了获得较理想的分离效果的注意问题 (1) 工作前全面了解所要纯化的酶的理化性质 在水和各种有机溶剂中的溶解性; 在不同温度、pH值和各种缓冲液中生物大分子的稳定性; 固态时对温度、含水量和冻干时的稳定性; 各种物理性质：如分子的大小、穿膜的能力、带电的情况、在电场中的行为、离心沉降的表现、在各种凝胶、树脂等填料中的分配系数等; 其他化学性质：如对各种蛋白酶、水解酶的稳定性和对各种化学试剂的稳定性; 对其他生物分子的特殊亲和力等。,这样，就可以知道应选择哪些方法与条件，而应避免哪些处理、 以及在什么情况下酶比杂蛋白更稳定而能加以利用。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,34,一、纯化工作前的准备,为了获得较理想的分离效果的注意问题 (2) 判断选择的方法与条件是否适当，始终应以活 力测定为准则。 一个好的步骤应该是比活力（纯度）提高大、总活力回收高，而且重现性好; 一般地说，纯化过程中不宜重复相同的步骤和条件，因为这样只能使酶的总活力下降，而不能使酶的纯度进一步上升。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,35,一、纯化工作前的准备,为了获得较理想的分离效果的注意问题 (3) 要严格控制操作条件。 可保证高的重复率; 可防止酶的变性失效，特别是随着酶逐渐纯净、杂蛋白逐渐移除、溶液中的蛋白浓度逐渐下降，蛋白质间的相互保护作用随之减小，酶的稳定性也因之降低，这一点尤为重要。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,36,一、纯化工作前的准备,纯化方法 (1) 依据：酶与杂蛋白在理化性质、稳定性上的差异; 酶的生物特性 (2) 现有方法： 根据溶解度的不同，有盐析法、有机溶剂沉淀法、共沉淀法及选择性沉淀法等。 根据分子大小的差别，有胶过滤(层析)法、超过滤法及超离心法等。 根据电学、解离性质，有吸附(层析)法、离子交换层析法、电泳法以及集层析与电泳之长的聚焦层析法等。 基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用特点而建立的各种亲和分离法等。 利用稳定性差异而建立的选择性热变性法、酸碱变性法和表面变性法,这些方法中往往同时有两种或多种因素在起作用,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,37,二、根据溶解度不同进行纯化,盐析法 有机溶剂沉淀法 共沉淀法 选择性沉淀法 等电点沉淀法 液-液分离法 萃取分离法,沉淀分离法： 改变某些条件或添加某种物质，使酶在溶液中的溶解度较低， 从溶液中析出。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,38,* 盐析法,(1) 原理：酶和杂蛋白在高盐浓度的溶液中溶解度差别 (2) 常用盐：硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠等 (3) 公式 不同的盐对某种蛋白质具有不同的盐析常数； 同一种盐对不同种蛋白质有不同的盐析常数。 分段盐析：Ks; (4) 影响因素 (5) 饱和硫酸铵,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,39,补 萃取分离法,(1) 萃取是利用系统中组分在溶剂中有不同的溶解度来分离混合物的单元操作，利用相似相溶原理。 (2) 两相一般为互不相溶的两个液相，按照组成不同分为： 有机溶剂萃取：乙醇、丙酮、丁醇、苯酚等 液膜萃取：液膜是悬浮在液体中很薄的一层乳液微粒。它能把两个组成不同而又互溶的溶液隔开，并通过渗透现象起到分离的作用。乳液微粒通常是由溶剂(水和有机溶剂)、表面活性剂和添加剂制成的。 双水相萃取 超临界萃取,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,40,三、按照分子大小进行的纯化,胶过滤（层析）法 筛膜分离法 超速离心分离法,过滤分离法： 借助于过滤介质将不同大小、不同形状的物质分离的技术过程; 滤纸、纤维、多孔陶瓷、烧结金属;,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,41,过滤的分类及其特性,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,42,* 胶过滤（层析）法,(1) 原理 (2) 胶的选择：定义、种类 (3) 柱层析的基本过程与要求,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,43,四、建立在电学解离性质进行的纯化,吸附交换（层析） 电泳分离法 聚焦层析 快速液相层析 疏水层析,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,44,* 电泳分离法,成层胶（spacer胶或称stack胶）,分离胶（separate胶或称run胶）,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,45,五、利用专一亲和作用进行的纯化,亲和层析法 亲和电泳法 融合蛋白亲和分离法 其他相关的亲和分离法,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,46,* 融合蛋白亲和分离法,(1) 亲和层析中常用作配基的物质 (2) 常用融合蛋白标签,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,47,六、根据稳定性差别建立的纯化,选择性热变性（selective heat denaturation） 选择性酸碱变性法 表面变性法,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,48,七、结晶,所谓结晶，是指分子通过氢键、离子键或分子间力，规则且周期性排列的一种固体形式。 由于不纯的蛋白溶液、变性的蛋白质不能和酶形成结晶，各种分子形成结晶的条件也不同，因此，结晶既是一种酶是否纯净的标志，也是一种分离纯化的手段。 结晶也是利用酶和杂蛋白在溶解度上不同而进行的一种纯化方法，但是和其他利用溶解度降低的方法不同，它要求以极为缓慢的速度逐渐降低酶的溶解度，使之能从溶解状态以特定的固体形式析式。 为获得纯净,粒大,收得率又高的结晶，有两个重要因素,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,49,(1) 酶溶液应该达到相当的纯度 除了少数例外，不纯的溶液通常不能得到结晶，因为晶核很快地为杂质所包围掩盖，无法长成晶体。 究竟要达到何种纯度才能着手进行结晶? 这个问题尚无确定标准，不过在很多情况下，酶溶液如果很纯的话，即使末结晶，也常可观察到某些可结晶的征候，如具有较大的密度、较高的闪烁性、较易分散、颗粒从球形趋向椭圆等。 酶溶液如果一旦获得结晶，再结晶一般是很容易成功的,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,50,(2) 酶的浓度要恰到好处 一般以15为宜，最低不宜小于0.2。 浓度高虽然较易结晶，但如果接近过于饱和，结果往往只能获得大量微晶，难以形成大晶体。 酶结晶形成以后，摇动酶溶液多可看到丝状闪烁，用l00400倍显微镜观察时，根据结晶的酶和结晶的条件不同，形状也可能多种多样。在偏振光显微镜下，多呈弱的双折射。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,51,八、纯化方法的排列顺序,一般地说，选择性热变性由于能以很小的代价除去大量的杂蛋白，而且不需要引入其他物质，也不增加液体的体积，所以可以放在最先进行。 吸附法简便，很多情况下，吸附前不一定要求脱盐，吸附平衡后，通常放置片刻就会澄清，除去母液后，即能转入小体积进行操作，因此可安排在前面的步骤进行。 结晶由于它要求酶液有相当纯度，应放在较后的环节。 至于其他方法则难以概言，要由实验确定。,第四节 酶的纯度与产量,主要内容：活力测定 纯化方法与条件的比较标准 纯度的标准,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,53,一、活力测定,如何进行酶的活力测定？ (1) 两个重点： 测定用的酶反应时间应选择在酶反应的初速度范围内； 测定用的酶量必须和测得的活性有线性关系。,酶促反应的速度是用单位时间内、单位体积中底物的减少量 或者产物的增加量来表示。 单位：浓度/单位时间 反应速度只在最初时间内恒定，随着反应时间的延长，酶反应速度逐渐下降，所以测定酶活时要以酶促反应的初速度为准。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,54,一、活力测定,如何进行酶的活力测定？ (2) 三个问题： 由于测定工作量较大，而且有时“立等”结果，所以要求测定方法快速、简便，而准确度在一定程度上比较次要，甚至可容许510的误差，故常用分光光度法等测定； 由于分离纯化过程可能丢失辅助因子，因此有时需要在反应系统中加入相应的物质，如煮沸过的抽提液、辅酶、盐或半胱氨酸等； 由于纯化过程中引入的某些物质可能对酶的反应和测定有影响或干扰，故还应在测定前进行透析或加入整合剂等。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,55,一、活力测定,2. 酶活性（Enzyme activity），又称 酶活力 定义：酶活力是指酶催化一定化学反应的能力 意义：表示酶的存在及含量 应用：在提取和制备中，酶的定性和定量测定 表示方法：酶活力用酶促反应的速度来表示 即酶催化的反应速度愈快，酶的活力就愈高。 测定酶活力就是测定酶促反应的速度,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,56,一、活力测定,3. 酶活力单位 (active unit) 酶活力单位用U表示，它是表示酶量的指标。 (1) 针对个别酶的酶活力单位：用某种酶在最适条件下，单位时间内被酶作用的底物的减少量或产物的增加量来表示。 不同的酶不同，甚至同一种酶也不同。 (2) 酶活力国际单位(international unit) 1961年EC规定的酶活力国际单位: 1个酶活力国际单位是在标准条件(T=25,最适pH,最适底物浓度)下,1分钟内催化1mol底物转化所需的酶量,用IU表示(目前常采用)。 1972年EC推荐新的酶活力国际单位: 以Katal(Kat)为单位。一个Kat单位是在最适条件下,每秒钟使1mol底物转化所需的酶量。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,57,一、活力测定,4. 酶的比活力 定义：指在特定条件下，单位质量的酶蛋白具有的活力单位数。 活力单位数 酶的比活力 = 单位酶蛋白 单位质量用每mg表示，工业、商业上也用每g酶制剂或每mL酶制剂含有多少活力单位表示酶的比活力。 意义：表示酶纯度的指标，比活力愈高，酶愈纯。 应用：酶纯化的每个过程。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,58,一、活力测定,5. 测定酶溶液中的蛋白质含量，常用的方法有 紫外吸收法: 简便快速，不损耗样品，但干扰因素很多； 双缩服法: 简单； 酚试剂法: 较繁，但是灵敏度、准确度都比较高； 染料结合法，又称Bradford法: 灵敏、简便、快速而且极少于扰，是近年来常用的检测法。 蛋白氮通常采用凯氏定氮法。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,59,某生物化学家发现并纯化了一种新的酶，纯化过程及结果如下表,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,60,根据表中结果：,分析表中都采用了哪些方法？ 计算每一步纯化程序后酶的比活性？ 将第一步的产率定为100%, 纯化倍数定为1.00, 完成表 指出哪一步对酶的纯化最有效？ 指出哪一步对酶的纯化最无效？ 表中结果能否说明酶已经被纯化？ 若估计酶的纯化程度还需要做什么？,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,61,二、纯度的标准,纯度提高和回收率的检定能帮助我们选择纯化方法与纯化条件。但是经过一定的纯化步骤后，为了了解所获得的样品是否均一纯净还要进行纯度检定。 酶均一纯净性的鉴定有以下几种方法。 溶解度法 电泳法 超离心法 免疫学法,第五节 酶的剂型与保存,酶制剂是指从生物中提取的具有酶特性的一类物质 主要内容：酶的剂型 酶的稳定性与保存,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,63,一、酶的剂型,液体酶制剂 这包括稀酶液和浓缩酶液。 一般在除去菌体等杂质后，不再纯化而直接制成或加以浓缩。 比较经济，但不稳定，而且成分繁杂，只适于就近的某些工业部门如纺织工业等直接应用。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,64,一、酶的剂型,2. 固体酶制剂 有的是发酵液经过杀菌后直接浓缩干燥制成; 有的是发酵液滤去菌体后喷雾干燥制成; 有的加有淀粉等填充料。 多用于皮革软化脱毛、水解纤维素等方面。 这类制剂中也有的是在发酵液或抽提液除去杂质并经初步纯化后制成，如用于洗涤剂、药物等生产的酶制剂。 用于加工或生产某种产品的制剂，必须去掉其中起干扰作用的杂酶，否则影响产品质量。 固体粗酶制剂便于运输和短期保存，成本也不高。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,65,一、酶的剂型,3. 纯酶制剂 包括结晶酶在内，通常用作分析试剂或医疗药物，要求有较高的纯度。 用作分析工具酶时，除了要求没有干扰作用的杂酶存在外，还要求单位重量的酶制剂中酶活性达到一定单位数。 用作基因工程的工具酶则要求不含核酸酶。 作为蛋白质结构分析对象的酶必须“绝对的”纯净，而注射用的医用酶则应设法除去热源物质。,主讲教师：赵丹丹,第五章 酶的分离纯化与制剂,66,一、酶的剂型,3. 纯酶制剂 热源是染菌后细菌分泌出来的一类类毒素，带有这类物质的制剂注射到动物体后，能引起体温升高