配子与胚胎生物技术.ppt

第八章 配子与胚胎生物技术,第一节 动物胚胎移植,胚胎移植（embryo transfer）：将动物的早期胚胎移植到与胚胎相对应生理状态的雌性受体子宫中，使之发育为成熟的个体。 提供胚胎的个体称为供体，接受胚胎的个体称为受体。,一、胚胎移植发展历史,1890年英国剑桥大学Walter Heape首次获得兔胚胎移植成功。 20世纪30年代，在兔、大鼠和小鼠方面进行了更多的实验，成为实验生物学中研究受精、胚胎发育等问题的一个重要方法。 家畜的胚胎移植，最早是在20世纪30年代在绵羊和山羊方面进行的。 在20世纪60年代以来，对家畜胚胎的采取、保存、移植等技术环节进行了大量的试验研究工作，取得不少进展。 20世纪70年代以后，胚胎的移植技术可以说发展到在畜牧生产中实际应用的阶段。 近些年来，胚胎移植技术已在动物引种和改良方面广泛应用，已成为体外受精、嵌合体、转基因和克隆动物实现的应用技术，试管牛、转基因猪和克隆羊均是通过胚胎移植途径生出的。,二、胚胎移植的意义,1.充分发挥优良母畜的繁殖潜力，提高繁殖效率 2.加速品种改良，扩大良种畜群 3.诱发肉畜怀双胎，提高生产效率 4.代替种畜的引进 5.保存品种资源 6.防疫需要和克服不孕 7是实现克隆动物等的必需手段,三、胚胎移植的生理学基础和原则,(一)生理学基础,1.发情后生殖器官的孕向发育,2.早期胚胎的游离状态,3.胚胎移植不存在免疫问题,4.胚胎和受体的联系,5.胚胎的遗传特性,(二)胚胎移植的基本原则,1.胚胎移植前后所处环境的同一性,（）供体和受体在分类学上的相同属性 （）动物生理上的一致性 （）动物解剖部位的一致性,2.胚胎发育的期限,3.胚胎的质量,(三)胚胎移植应具备的基本条件,1.胚胎来源,2.技术条件,3.受体母畜,四、胚胎移植的技术程序,胚胎移植时，希望一次从供体母畜得到多数胚胎，所以要进行超数排卵处理，同时，胚胎移植成功的根本条件是供体和受体必须同时发情，故需人为控制供受体的发情时间，进行同期化处理。,（一）供受体准备,选择的供体不但应有育种上的价值，期望从它们得到很多的后代，而且生殖机能应处于较高的水平。 受体母畜可选用非优良品种的个体或土种家畜但亦应具有良好的繁殖性能和健康状态，体型中上等。,（二）超数排卵,在母畜发情周期的适当时间，注射促性腺 激素，使卵巢中比在自然情况下有较多的卵泡发育并排卵，这种方法称为超数排卵（superovulation），简称超排。 超数排卵主要应用于牛和羊，效果明显，对于产多胎的猪意义不大，而母马很难产生反应。一般认为以1020个最为理想。,1母牛,在预计自然发情的前4d，即发情周期的第16天或第17天肌肉或皮下注射PMSG15003000IU（或同时加注HCG10001500IU）。这种方式是按照发情周期的规律，在黄体期将要结束，卵泡期即将到来之前，顺势促进较多的卵泡生长和成熟。这样做必须和发情周期的进程配合好，所以在安排时间上受到限制，应用不方便。另一种方式是在发情周期的中期，在注射促性腺激素的同时，施用PGF2a或其类似物以溶解黄体。一般是在周期的第1013天（815天）内进行，一次肌注上述量的PMSG，隔日再注射以PGF2a。如用FSH（或FSH+LH），则连续注射34d，每天早晚各一次，总量为3040mg（国产品400500大鼠单位，第一天用量可稍多，第3天的第5次注射时，同时注射PGF2a。,2、母羊,在周期第12天或第13天时，一次肌注（或皮下）PMSG7501500IU。出现发情后或配种当日再肌注HCG500750IU。也可像母牛一样在发情周期中期进行处理，在注射PMSG之后，隔日注射以PGF2a或类似物。如采用FSH，用量为1020mg（或200300大鼠单位）分3d6次注射之，PGF2a在第5次同时注射之。,（三）供体母畜的配种,超数排卵处理的母畜发情后，根据育种的需要，应选择优良公畜的精液，在适宜时间进行人工授精。为了得到较多的发育正常的胚胎，应使用活率高密度大的精液，而且将授精次数增加到2次或3次，两次间隔810h。,（四）胚胎的收集,胚胎的收集是利用冲洗液将胚胎由生殖道中冲洗，并收集在器皿中。 冲洗时要考虑到配种时间、发生排卵的大致时间、胚胎的运行速度和发育阶段等因素，只有这样，才能顺利迅速地进行操作，得到较高的收集率。关于各种家畜受精后胚胎发育的速度和运行情况（所处部位）收集时间不应早于排卵后的第一天，亦即最早要在发生第一次卵裂,之后，否则不宜辨别卵子是否已受精。一般是在配种后38d，发育至48个细胞以上为宜。牛胚胎最好在发育至桑椹胚晚期或胚泡早期进行收集和移植（配种后68d）。,1.手术法收集胚胎,按照外科手术的要求，在腹部适当部位作一切口，用注射器吸取冲洗液注入输卵管或子宫角内，进行冲洗，同时观察卵巢上的排卵情况，计算排卵率。冲洗部位决定于胚胎所处位置，亦即取决于冲洗是在配种后的第几天进行以及胚胎的运行速度。,用注射器的磨钝针头刺入子宫角顶端，注入冲洗液，然后从输卵管的伞部接取冲洗液，这种方式适用于牛、羊、兔等。,由伞部注入冲洗液，在子宫角上端接取。猪和马的子宫角与输卵管接合部有一活塞状结构，用第一种方式，冲洗液不易通过，只能采用第二种方式。,从子宫角上端注入冲洗液，由基部接取，或者相反。这种方式适合于各种家畜。,冲洗操作，要求迅速准确，防止对伤口、生殖器官和冲洗液的污染，避免对动物有过多刺激和对生殖器官造成损伤。一般来说，术后生殖道易发生不同程度的粘连，严重时会造成不孕。这是手术法的最大缺点。冲洗之后，立即缝合伤口，宜单独饲养，注意伤口愈合情况。,2.非手术法收集胚胎,牛的非手术收集胚胎可利用二路式导管冲卵器，将冲洗液通过内管注入子宫角内，然后导出冲洗液，外管前端连接以气囊，当将冲卵器插入子宫内时，充气使气囊胀大，堵住子宫颈内口以免冲洗液经子宫颈流出。,非手术法冲取胚胎，每侧子宫角需用冲洗液100150ml。应用非手术法冲洗收集胚胎时，只能当胚胎都进入子宫角后进行。牛、马的胚胎用非手术法收集时，一般在配种后68d进行。,3.冲洗液,收集胚胎的冲洗液有多种，在早期的胚胎移植试验中，各种生理盐液如林格氏液、洛克氏液、台氏液等和自体血清以及血清和盐液的混合液，曾作为冲洗收集胚胎之用。现在多采用杜氏磷酸盐缓冲液（PBS）、布林斯特液（Brinsters medium-3）、合成输卵管液（SOF）、惠屯氏液（Whittens medium）、海姆氏液（Hams F-10）以及199培养液（TCM199）。它们除含各种盐类外，还含有多种有机成分，不但用于冲洗收集胚胎，还用于体外培养、冷冻保存和解冻等处理程序。,（五）胚胎的检查,收集到的冲洗液，需静置10min。待胚胎下沉后，移去上层液，再放于解剖镜下，检查胚胎数量和发育情况。正常发育的胚胎，其中细胞（卵裂球）一般外形整齐清晰，大小较一致，分布均匀而紧密，发育速度与胚胎日龄相一致。,（六）胚胎的保存和培养,保存是使胚胎在体外一定条件下（降温）停止发育，延长其在体外的生存时间，当需要时，升温后进行移植。 培养则是在体温条件下，于培养液中，使之继续发育。,放在室温条件下，胚胎只能存活1020h。当温度降至20以下时，胚胎即停止发育，存活时间可以延长。 胚胎在体温环境下（37）的培养，有一部分可正常发育，但发育持续的时间和达到的阶段也是非常有限的，一般只能持续34d。 利用兔体（输卵管）进行活体内培养（保存），然后再取出移植至同种畜体内，在羊、猪、牛、马都已试验成功，经过长途运输，移植后妊娠产仔，但必须进行两次冲洗和移植的手术，降低了它的实用价值。,冷冻长期保存牛、绵羊、山羊的胚胎经冷冻解冻后能够存活，且移植后均可受胎产仔。 在冷冻前需先依次经过含有由低浓度到高浓度防冻剂的杜氏培养液，防冻剂的最高梯度为1.01.5mol/L。每种浓度中停留510min，在最后一种浓度中降温冷冻。胚胎冷冻时必须采取缓慢降温。由室温降至-5-7，每分钟降1，在此温度下进行诱发结冰，然后按每分钟降0.30.5的速度降至-33-38，此后可直接浸入液氮保存。,解冻时不必控制升温速度，可直接放在室温条件下（2025）或在3537水浴中解冻。 解冻后必须再把防冻剂清除掉。方法是使胚胎按相反的方向（由高浓度向低浓度）依次通过含有不同浓度的防冻剂的培养液，最后移至不含防冻剂的培养液中进行移植。 牛胚胎冷冻较新的一种方法是在塑料细管中进行冷冻，一端装有胚胎和冷冻培养液，另一端为蔗糖液，解冻后随即被蔗糖液稀释，以冲淡防冻剂的含量，将塑料管直接装入移植器中，然后注入子宫。,（七）胚胎的移植,胚胎的移植也有手术法和非手术法两种方式，手术法一般用于所有的动物，主要用于小动物。而非手术法仅适用于牛、马及马鹿等大动物,1.手术法移植,在受体腹部作一切口，找到排卵一侧的卵巢并观察黄体发育情况，用注射器或移植管将胚胎注入到同侧子宫角上端或输卵管壶腹部内（以胚胎发育阶段而定）。只需吸取少量的冲洗液连同胚胎一块注入。,2.非手术移植法,牛的非手术移植，主要方式是将一只手伸入直肠，先检查黄体位于哪一侧和发育情况，然后握住子宫颈（如同人工授精操作一样），另一只手将移植管（注射器连接以导管或特制金属移植器）插入与黄体同侧的子宫角内，注入胚胎。,（八）供体和受体的术后观察,对术后的供体和受体不但要求注意它们的健康情况，同时要留心观察它们在预定的时间是否发情。 供体在下次发情时即可照常配种，或经过二、三个月再重复作为供体，收集胚胎。受体母畜术后如发情则说明未受胎，移植失败。,第二节 体外受精,哺乳动物精子和卵子的受精在自然情况下都是在动物生殖道内完成的，将这个生理过程在体外实验室的培养皿内进行，则称为体外受精（in vitro fertilization，IVF ）。,一、 发展简史,1951年，美籍华人张明觉和澳大利亚学者Austin分别发现了精子获能（cap acitation）现象，使动物体外受精研究进入了新纪元。 1959年张明觉在世界上首先获得了体外受精的的哺乳动物试管兔，推动了体外受精研究工作的开展。 1978年首例人类试管婴儿路易斯布朗（Louise Brown）诞生。,直到20世纪80年代，家畜的体外受精技术才取得突破，尤其是牛的体外受精技术发展迅速。 1981年Brackett等用体内成熟卵母细胞获得试管牛犊，随后Hanada等（1985）获得绵羊和山羊体外受精后代，并于1986年获得体外成熟卵母细胞体外受精的第一头犊牛。 我国学者卢克焕（1987）在爱尔兰获得全体外过程的试管牛犊。,二、意义,1. 可以以较低的成本，大规模地批量生产各发育期的动物胚胎。 2. 作为胚胎移植技术常规服务的一部分。,三、技术程序,体外受精包括以下步骤：卵母细胞的获取、卵母细胞成熟、精子获能、卵母细胞受精和受精后的体外胚胎培养。,(一)卵母细胞的获得和成熟培养,1.屠宰场卵巢 从屠宰场采集卵巢保持在3035，运回实验室，吸取26mm直径的卵泡。 2.活体取卵母细胞 20世纪80年代末90年代初，超声波或腹腔镜引导经阴道穿刺采卵，吸取有腔卵泡中的卵母细胞的技术问世，这项技术与屠宰后动物卵巢取卵相比，称为活体取卵（OPU，ovum pick-up）。,3.卵母细胞成熟培养 选择卵丘细胞完整，形态良好的卵母细胞进行成熟培养。培养条件是39，5%CO2，卵母细胞在培养皿液滴内培养约24h。,(二)体外受精,1.精子的获能处理 哺乳动物的获能方法有培养和化学诱导两种方法。 2.受精 获能的精子和成熟的卵子共培养。,(三)胚胎培养,体外胚胎生产中，受精卵子在培养液中停留78d。 主要有两类培养系统：一是含有体细胞的共培养系统，二是限定或半限定的培养系统。 牛受精卵的共培养通常是用TCM-l99或其他液体添加血清，选用的体细胞有牛颗粒细胞，输卵管上皮细胞等。整个培养系统中不用体细胞的称为半限定或限定培养系统，取决于是否使用了血清和蛋白或合成的大分子添加物，,第三节 克隆技术,克隆（clongning）是指一个细胞或个体以无性繁殖方式产生遗传物质完全相同的一群细胞或一群个体。 在动物繁殖学中，它是指不通过精子和卵子的受精过程而产生遗传物质完全相同新个体的一门胚胎生物技术。 哺乳动物的克隆技术包括胚胎分割和细胞移植两种。,一、 胚胎分割,胚胎分割（embryo splitting）是运用显微操作系统将哺乳动物附植前胚胎分成若干个具有继续发育潜力部分的生物技术，运用胚胎分割可获得同卵孪生后代。,（一）发展简介,Spemann在1904年最先进行蛙类2-细胞胚胎的分割实验，并获得同卵双生后代。 1970年，Mullen等通过分离小鼠2-细胞胚胎卵裂球，获得同卵双生后代。 1979年Willadsen和Meineck-Tillman等成功地进行了绵羊早期胚胎的分割。 20世纪80年代以后，哺乳动物胚胎分割技术发展迅速，Willadsen等在总结前人经验的基础上，建立了系统分割方法，并运用这种方法获得绵羊的四分之一和八分之一胚胎后代和牛的四分之一胚胎后代。,（二）胚胎切割技术,1.切割器具的准备 胚胎分割需要的器械有体视显微镜，倒置显微镜和显微操作仪。 在进行胚胎分割之前需要制作胚胎固定管和分割针，固定管要求末端钝圆，外径与所固定胚胎直径相近，内径一般为2030m。切割针目前有玻璃针和微刀两种，玻璃针一般用实心玻璃拉成，微刀是用锋利的金属刀片与微细玻璃棒粘在一起制成。,2.胚胎预处理,为了减少切割损伤，胚胎在切割前一般用链霉蛋白酶进行短时间处理，使透明带软化并变薄或去除透明带。,3