植物组培快繁程序.ppt

第三章 植物组培快繁程序,植物快速繁殖就是应用组织培养技术,快速繁殖名优特新品物，使其在较短时间内繁衍较多的植株。快繁是当前植物细胞组织培养中应用最广泛，又最有效的方法之一。,一、供体植株的培养与取材 二、外植体的灭菌与接种 三、培养 四、驯化移栽 五、组培快繁计划安排与实施,主要内容,一、供体植株的培养与取材 一般来说，无论何种类型的细胞组织培养技术，起始阶段均涉及外植体取材、灭菌与接种培养等基本过程。 外植体来源的环境以及外植体的类型，均会影响将来培养的效果，而灭菌、接种和培养条件的选择与控制，也与外植体的来源和类型有关。,1、外植体的来源 -生长在自然环境下的植物 -有目的地培育在温室控制条件下生长的植物 -无菌环境下已经过离体培养的植物 自然环境中生长的植株，一般带有微生物，甚至与某些微生物具有寄生关系，使植株具有内生菌。取自这些植物的外植体，在培养过程中会有微生物滋生，从而影响培养效果。,自然环境生长植株,温室控制条件下生长植株,已离体培养植株,在多数情况下，应尽量使用温室或人工气候室控制培养的植物材料作为外植体来源，减少培养过程中的微生物感染概率。同时，生长在控制条件下的植物可以保持培养材料间的一致性，提高实验的可重复性，也便于培养技术的规范。,某些多年生植物或特殊材料，必须取自自然生长的植物，就需要尽可能避免使用那些生长过于潮湿和不洁净环境中的植物。对于培养过程中可能出现内生菌污染的材料，应尽量取生长旺盛期的生长点部位作为起始培养的材料。,2、供体植株的管理 取自室外的外植体材料，供体植株的管理十分重要，这与外植体培养时的污染率密切相关。植株管理中应注意： 避免昆虫危害 许多昆虫如蚜虫、螨类和飞虱是许多植物病虫害的传播媒介，会引起植物组织的潜在感染。,注意防病 尤其是真菌和细菌病害的侵染，取自感病植株的外植体，在培养中的污染率远远高于来自健康植株的外植体，必要时需使用化学药剂防治病害。 控制湿度 给供体植株浇水时应从根部给水，避免从上部浇水，以免上部形成易于病原侵染的湿度环境；尽可能降低温室湿度；取材前尽可能保持植株干爽。,3、材料取材 材料选择 培养材料应选择有代表性的主要植物、选择性状优良的种质或特殊的基因型。 快速繁殖时应在植株生长的最适时期取材，如花药培养应在花粉发育到单核期取材。,取材 从生长健壮的无病虫害的植株上选取发育正常的器官和组织。最好采用茎尖，后代性状较稳定，携带细菌较少。 选取材料的大小一般在0.5-1.0cm之间。胚胎培养或脱毒在0.5cm以下。材料太大易污染，材料太小难于成活。,1、预处理 先对植物材料进行修剪整理，去掉不需要部分，将准备使用的植物材料（外植体）在流水中冲洗20-60分钟，备用。如特别不洁的外植体，可先用加有洗涤剂的水清洗10-15分钟，再用流水冲洗干净。,二、外植体的灭菌与接种,2、表面灭菌 （1）操作人员穿戴灭过菌的工作服、口罩。进入接种室前双手用洗涤剂清洗干净，操作前再用70%酒精或消毒剂擦洗双手。 （2）操作期间双手和台面常用70%酒精或消毒剂擦拭。超净工作台使用前必须用紫外灯照射杀菌，然后开启风机。,（3）接种用工具（解剖刀、剪刀、镊子）可放入70-75%酒精中，使用时需火焰灼烧灭菌，冷却后使用。 （4）外植体放入超净工作台内，置70-75%酒精中5-60 秒，0.1氯化汞6-10分钟，或10%的漂白粉上清液中10-15分钟，然后用无菌水冲洗3-5次。灭菌时需进行搅动。,常用灭菌药剂的使用和效果,（1）材料吸干后，一手拿镊子，一手拿剪子或解剖刀，对材料进行适当的切割。如叶片切成0.5cm见方的小块；茎切成含有一个节的小段。微茎尖要剥成只含l2片幼叶的茎尖大小等。在接种过程中要经常灼烧接种器械，防止交叉污染。 （2）解开包口纸，将培养瓶口几乎水平拿着，避免灰尘落入瓶中。使瓶囗靠近酒精灯火焰，并将瓶口在火焰上方转动，使管口里外灼烧数秒钟。,3、外植体的接种,（3）迅速用镊子夹取切割分离下的所需组织、细胞、器官，送入培养容器内，轻轻插入培养基。若是叶片直接附在培养基上，以放13块为宜。接完种后，将管口在火焰上再灼烧数秒钟。然后及时盖上瓶盖或封口。,注意： 所有操作均应严格保持瓶口在操作区以内，且不远离酒精灯；工具用后应及时灭菌，避免交叉污染；工作人员操作时禁止不必要的谈话。,三、培养,指把离体植物材料放在培养室(有光照、温度条件)里，使之生长，分裂和分化形成愈伤组织或进一步分化成再生植株的过程。,1、培养含义,2、培养方法,(1)固体培养法 即用琼脂固化培养基来培养植物材料的方法。是现在最常用的方法。虽然该方法设备简单，易行，但养分分布不均，生长速度不均衡，并常有褐化中毒现象发生。 (2)液体培养法 即用不加固化剂的液体培养基培养植物材料的方法。由于液体中氧气含量较少，所以通常需要通过搅动或振动培养液的方法以确保氧气的供给，采用往复式摇床或旋转式摇床进行培养，其速度一般为50100r/min，这种定期浸没的方法，既能使培养基均一，又能保证氧气的供给。,培养步骤,初代培养,继代培养,生根培养,3、培养步骤,（1）初代培养,目 的：获得无菌材料和无性繁殖系。 无性繁殖系：是指由一个外植体继代增殖，繁殖出的具有相同遗传物质的植株群体。包括：芽丛、不定芽、胚状体、原球茎等。,培养基：诱导或分化培养基。 培养基中CTK多，IAA少。,类 型（根据发育方向）： 丛生芽增殖型 器官发生型 胚状体发生型 原球茎发生型,根、芽,胚状体,根、芽,愈伤组织,芽,根,芽,外 植 体,试 管 苗,原球茎,根、芽,外植体成苗途径,根,顶芽,腋芽,丛生芽增殖型,微型扦插,顶 芽,CTK刺激,带芽的茎切段,侧 芽,接种培养,形成的茎梢节长，直立向上呈小灌木丛状,获得较多嫩茎梢,茎段培养继代扩繁,试管苗,生根培养,无愈伤组织产生,初 代,继 代,丛生芽增殖型,器官发生型,脱分化,分 化,愈伤组织,芽、芽丛,切割芽丛 继代培养,大量芽丛,试管苗,生根培养,外植体,初 代,继 代,器官发生型,愈伤组织培养,愈伤组织,具分裂能力的细胞,已分化细胞,脱分化,继 代,愈伤组织,分 裂,诱导期,分裂期,分化期,愈伤组织诱导, 双子叶植物单子叶植物和裸子植物, 幼年细胞和组织成年细胞和组织, 二倍体细胞单倍体细胞, 根据培养目的选取外植体,愈伤组织诱导, 外植体大小一般为0.5cm的圆柱形或方形块, 添加植调剂和天然提取物利于诱导和维持, 生长旺盛的愈伤组织一般呈乳黄色或白色或浅绿色或绿色，老化的多为黄色或褐色,脱分化因植物种类、器官及生理状况有大差异：,禾谷类植物脱分化较难。,细嫩组织脱分化较易；成熟组织较难。,花器脱分化较易；茎叶难。,诱导期,诱导期长短与植物种类、生理状态有关。,诱导期长短与环境因素有关。,母株生长在弱光下的外植体易于诱导，分裂频率高。,增加O2和迅速释放CO2利于细胞分裂。,添加植调剂诱导分裂效果好。,合成代谢迅速。,分裂期,特征： 细胞分裂快，结构疏松，缺少有组织的结构，颜色浅而透明。,分化期,特征： 形成瘤状结构的外表和内部分化；出现多种类型的细胞。,石龙芮下胚轴培养产生胚状体过程,体细胞胚状体发生型,外 植 体,愈伤组织,小孢子,游离单细胞,器 官,胚 状 体,试 管 苗,体细胞胚状体发生型,胚状体形成植株的特征：,1.具两极性,2.胚状体的维管组织与外植体的维管组织无解剖结构上的联系,3.胚状体的维管组织的分布是独立的“Y”形,4.数量多，速度快，结构完整，成苗率高,原球茎：缩短的、呈珠粒状的、由胚性细胞组成的、类似嫩茎的器官。,原球茎发生型,1.初代培养时外植体发育途径有几条？ 2.正常的愈伤组织一般为何种颜色？其诱导有何特点？,思考题：,目的：扩繁无根苗（生产上边扩繁边生根）。,扩繁方法：以几何级数增加，可切割茎段，分离芽丛、胚状体、原球茎。,培养基：基本培养基或分化培养基,实质：增殖培养物。,（2）继代培养,（3）壮苗和生根培养,生根培养基：12或14MS基本培养基；不加或少加CTK，适量添加NAA；糖浓度1-1.5%。,培养条件：增加光强，达3000-10000lx。,壮苗,生根方法与途径,新梢基部浸入50或100ppmIBA液48h；,在含IAA类培养基中培养46d；,移入含活性碳的生根培养基培养。,其它方法,生根困难的则在培养基中搭滤纸桥或按,生根其它方法,延长在增殖培养时间,降低增殖倍率，减少CTK用量,对易生根植物，切割粗壮嫩枝在营养钵中直接生根,胚状体发育成小苗不经生根阶段，但需壮苗生根,接种只是完成了离体培养的第一步，植物离体培养和栽培植物一样，生长过程中也受到各种环境因素的影响。培养条件是离体培养能否成功的关键。在培养基条件适宜的基础上，影响试管苗生长的主要因素有光照、温度、湿度、氧气。,（4）培养条件,光照,1）光强 影响外植体细胞的增殖、组织和器官的分化。一般培养室的光照强度要求10005000lx。,愈伤组织的诱导有的在光照下有促进作用；光照强，幼苗生长健壮；光照弱，幼苗生长弱小，容易徒长。,不同波长的光对细胞的分裂和器官的 分化有影响。,2）光质,白光促进小花天竺葵愈伤组织 的生长，蓝光则无作用。,如：红光促进杨树愈伤组织的生长，蓝光阻碍其生长。,3）光照时间,根据植物生物学特性决定； 光照长短对试管内花的形成是个重要影响因素，一般给予周期性光照比较好。多数植物8-10小时黑暗为宜。光周期长短因植物种类而异。在胡萝卜组织培养中随着日照长度的增加，而促进生长。,1）大多数植物23-32，一般控制在252C。低于15C或高于35C，对生长都是不利的。 2）植株种类及外植体的不同，其最适温度也是不同的。如百合20；月季2527；番茄28。,温度,湿度,1）瓶内的湿度： 一般为100，主要受到培养基含水量和封口膜透性的影响。如培养基过硬，则不利于外植体接触和插入培养基，导致生长迟缓；封口膜过于透气，也会使瓶内湿度下降。,湿度过低会使培养基丧失大量水分，渗透势升高，影响材料对营养物质的吸收，也会阻碍外植体的生长。湿度过高会造成杂菌滋长，导致大量污染。一般为7080%。,2）环境湿度：,1）培养基适宜pH值5-6.5，一般为5.8，调整用0.1M的NaOH和HCl溶液 。,pH值,2）H影响培养基的硬度。 H 6.5 培养基会变硬； H 5.0 培养基不易凝固。,3）灭菌之前，培养基的pH要比标准提高0.20.3个单位。,气体(必要条件),1）培养瓶内氧气的充足与否与封口材料有关。 可用棉塞或特制的封口塑料。通气最好的是棉塞，但棉塞易使培养基干燥，夏季易引起污染。,2）培养基内氧气充足与否与培养基的种类和培养方式有关。 固体培养基可加进活性炭来增加 通气度,以利于发根。 液体培养时，可考虑采取振荡培 养的方式，以增加通气性。,2）个大气压以上就对生长有阻碍作用，5个大气压生长就完全停止，个大气压细胞就不能生存。,渗透压,1）1-2个大气压促进生长。,复习思考题： 1.继代培养有何意义？其目的和实质是什么? 2.组培苗生根方法有哪些？ 3.外植体成苗途径有几条？,四、驯化移栽,高温且恒温 高湿 弱光 无菌,1、试管苗生态环境与自然环境的差异,2、试管苗的特点,生长细弱，角质层不发达 光合作用差 叶片气孔数少，活性差 根吸收功能弱 对逆境的适应性和抵抗能力较差,3、试管苗的驯化,目的：提高试管苗的适应性，促其健壮， 最终提高移栽成活率 原则： 从温、光、湿度及有无杂菌等环境因素考虑。 驯化开始数天内，与培养环境条件相似；后期与预计栽培条件相似，逐步适应。 方法：即炼苗。不开口自然光下2-3天，然 后开口1-2天。,试管苗的移栽方法,组培驯化移栽常用基质,组培驯化移栽用穴盘,试管苗的移栽方法,试管苗的移栽,移栽方法：取出试管苗，全部轻洗去培养基栽入基质(事先浇透水)后，栽后轻浇薄水， 移入高湿环境(90%以上)。 移栽场所：日光温室 塑料大棚 驯化室 注意： 1.保持小苗水分供需平衡 2.防止菌类滋生 3.给予一定温光条件 4.注意基质配比并保持适当的通气性,1）保持小苗水分供需平衡,1周内： 环境高湿，遮光。,1周后：,小苗生长后逐渐降湿，拱棚两端通风。,半个月后：,揭膜，控水，增加光强。,2）防止菌类滋生,基质高压灭菌或3h烘烤灭菌或太阳能灭菌。 适当使用杀菌剂、消毒剂。 移栽时少伤苗。 喷水加0.1%尿素或1/2MS大量元素液追肥，加快苗生长。,3）给予一定温光条件,适宜生根温度：1820，温度低可加地热线。 移栽初期弱光，后逐渐加强光照，过渡到自然光照。,保持基质通气性： 选颗粒状基质，浇水勿多。,4）注意基质配比并保持适当的通气性,基质配比： 珍：蛭：草( 腐殖土)=1：1：0.5 珍：草(腐殖土)=1：1,提高试管苗移栽成活率的途径？ 1、壮苗移栽比弱苗移栽成活率高 2、生长素（NAA）利于生根 3、低无机盐浓度生根效果好 4、活性炭利于嫩茎生根 5、避免太阳直射，温度25-30，湿度在85%以上 6、使试管苗逐渐从无菌向有菌过渡,组织培养工厂化育苗生产流程简图,五、组培快繁计划安排与实施,商业化生产规模的确定应以市场需求为标准，否则试管苗难以销售，造成经济损失。 外植体的入瓶；器官形成及增殖；试管小植株出瓶等试管苗生产过程均是在无菌条件下进行的，因此，试管苗生产规模可以用无菌工作台的数量来衡量的。,1.试管苗生产规模的确定,一般一个单人无菌工作台可年生产10万15万株苗，一个1.2m0.6m2.0m的6层培养架可年繁殖1.5万2万株试管苗。年产100万株的组培苗生产工厂，需810个无菌工作台，培养架4050个。接种室面积应为4050m2，培养室面积则为100120m2。 培养容器的数量取决于生产规模，一个6层培养架(1.2mX0.6mX2.0m)可放置900个左右三角瓶或360个左右兰花瓶，还需增加1015的周转用培养容器。,驯化室可内装喷灌设施和可移动苗床。每平方米苗床可栽种800株试管苗，一茬苗的过渡周期为30d，年产100万株苗的过渡培养室，建造面积应为400600m2。,2.试管苗增殖率的估算,Y=xn,年增殖率,全年增殖周期数 n=365/每周期天数,每周期增殖倍数,例如：增殖周期为1