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RAPD标记和基因芯片技术在中医药领域的应用摘要：当今，以分子生物学理论为基础，以基因工程为主导的生物技术正以其巨大的活力推动着生命各学科的发展。近年来分子生物学理论和技术在中医药研究领域中也发挥着重要作用。本文从RAPD标记技术和基因芯片技术两个方面探讨如何将这一新兴技术结合到古老的中医药的研究中去，为中医药客观化、定量化、标准化研究提供便利。关键词:RAPA标记；基因芯片；中医药RAPD markers and gene chip technology in the field of application of Traditional Chinese MedicineAbstract: Today, the basis of molecular biology to genetic engineering biotechnology is dominated by its huge energy to promote the development of various disciplines of life.In recent years, theory and techniques of molecular biology research in the field of Chinese medicine also plays an important role.In this paper, RAPD markers and gene chip technology are two aspects of how this emerging technology into the ancient Chinese medicine to the study, a Chinese medicine objective, quantitative, standardized research facilities.Key words: RAPA marker; gene chip; traditional Chinese medicine 分子生物学是从分子水平来研究生命现象的一门基础学科。20世纪40年代由W.Astbury首先提出分子生物学一词,50年代J.D.Watson和F.Crick关于DNA双螺旋结构的发现,60年J.Monod和F.Jacob有关基因调控的操纵子学说的提出,以及70年代初期DNA限制性内切酶的问世和DNA体外重组技术的形成,推动了分子生物学的飞速发展。随着科学的不断发展,分子生物学与中医药领域互相渗透越来越深入。目前,多种分子生物学技术已被引进中医药研究领域,例如核酸探针和分子杂交技术、聚合酶链反应(PCR)、杂交瘤和单克隆抗体技术、基因工程和转基因动植物技术等。其中RAPD标记技术和基因芯片技术在中医药领域的研究中取得不少成就。1、 RAPA标记技术1.1 RAPA标记技术的基本原理RAPD技术是建立在PCR技术的基础上,用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基序列的寡核苷酸单链(一般为10 bp)作为引物,对所研究的基因组DNA进行单引物扩增。模板DNA经9094变性解链后在较低温度(3637)下退火,这时形成的单链模板会有许多位点与引物互补配对,在72下,通过链延伸,形成双链结构,完成DNA合成。重复上述过程,即可产生片段大小不等的扩增产物,通过电泳分离和显色便可得到许多不同的条带,从中筛选出特征性条带。扩增产物片段的多态性反映了基因组DNA的多态性。如果基因组在这些区域内发生DNA片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点的分布发生相应的变化,而使PCR产物增加、缺少或发生相对分子质量的改变。因此,通过对PCR产物的检测即可测出基因组DNA在这些区域的多态性。1.2RAPD标记技术在中药领域的应用1） 种属分类及亲缘关系的鉴别在药材的种属分类及亲缘关系上，因遗传背景复杂，亲缘关系不清，传统的分类方法不能提供种类的遗传信息，学者们一直以来存在着分歧，而RAPD标记技术对解决这些分歧点提供了可靠的方法。比如，运用RAPD技术刻划了国产姜黄属(Curcuma)药用植物的遗传背景差异，并结合经典分类和异地栽培观察和聚类分析，初步澄清了姜黄属植物的一些分类学争议，从DNA分子水平上为姜黄属植物分类与中药鉴定提供了参考依据。2） 药材道地性研究中药十分讲究道地性,道地药材是传统公认来源于特定产区的名优正品药材。道地药材从生物学内涵讲是居群,其一个重要特征是遗传特征,应看成是一个具有共同基因库的由交配和亲缘关系联系起来的同一物种的个体群,因此DNA分子标记技术可以用于道地药材的鉴别和道地性的研究。3） 药材真伪的鉴定中药的传统鉴定是利用植物或动物形态分类学和解剖学特征,从基原、性状、显微特征、理化等方面进行药材鉴别。大部分经药材加工、炮制等处理后,往往失去了原来的形态和解剖特征,甚至显微特征也会发生改变,从而使药材的真伪优劣难以鉴别。如对冬虫夏草及其伪品的鉴定,人参与假人参的鉴定,对射干及混淆品共5种原植物的鉴别等,都取得了比较理想的结果。1.3发展前景RAPD技术目前主要应用在中药领域的种属亲缘关系、道地性、真伪鉴定，但是尚缺少鉴别中药材正品的技术标准。另外，因其操作步骤稍显复杂，需要专业技术人员，推广应用到生产实际，成本高，不容易为企业所接受。但随着RAPD技术的发展，设计出高度特异性引物和开发出相应的检测试剂盒，使得该项技术使用更方便、经济、快捷。同时也可以根据RAPD的分析结果，模拟出质优高产的道地药材内、外形成机制及其生长形成条件，培育出更多优质的中药材，并可寻找出珍稀、濒危动植物药材的替代品，从根本上解决中药资源的匮乏。2、 基因芯片技术2.1基因芯片技术的基本原理基因芯片(gene chip)又称DNA微阵列(DNAmicroarray),在20世纪90年代初由美国Affymetrix公司的Fodors等提出并开始研究,是在芯片片基上按照特定的排列方式,固定上大量DNA探针,形成一种DNA微阵列。基因芯片技术是建立在基因探针和杂交测序技术上的一种高效快速的核酸序列分析手段。它将大量的基因探针有序地、高密度地排列在一块12cm2大小的玻片或胶片上,形成可与目的分子相互作用的固相表面,然后与标记的样品进行杂交,通过检测杂交信号的强度及分布来进行分析。它与其他分析基因表达谱的技术,如RNA印迹(Northern blot)、cDNA文库序列测定、基因表达序列分析等的不同之处在于,基因芯片可以在一次试验中同时平行分析成千上万个基因。2.2基因芯片技术在中医药领域的应用1) 中医研究随着基因芯片技术的日益成熟，运用大规模、高通量的基因芯片技术，对足够数量的同一证型患者的基因表达进行定量分析，建立辨证要素的基因表达谱数据库，再相互组合便可建立证型基因表达谱数据库，以此可作为辨证的客观规范化标准，因此基因芯片技术片为中医的客观化、微观化研究提供了思路与方法，有望成为中医现代化的有效手段。在针灸经络研究方面，针灸由于其为传统方法无法了解不同系统间动态作用,针灸的研究总是难以深入发展。采用基因芯片技术进行针灸的研究成为发展趋势。通过基因芯片技术,建立不同针灸条件下的基因表达谱,分析其中表达差异的基因,进一步通过这些差异基因的功能分析,可以了解不同针灸条件作用下的基因组背景资料;进而了解针灸的可能作用,优化临床针灸疗法的参数选择,提高针灸临床疗效。基因芯片还有助于揭示针灸的作用机制。引入基因芯片,可以高通量地检测细胞内基因表达的时空特征,有助于了解针灸促进基因表达的特点;进而再利用蛋白组学、生物信息学分析技术,有望揭示针灸作用机制。2) 中药研究由于中药成分非常复杂，单纯应用传统的药物研究方法，很难从整体上其对进行研究。通过基因芯片在同一实验条件下，一次性检验上万个生物信息的改变，为多靶点药物作用机制的研究提供了有效的工具。中药主要是通过调节机体的整体功能，即通过对基因的表达调控而起作用的。利用基因表达谱芯片对比研究某种中药或其提取物作用于动物前后特定细胞中相关功能基因表达mRNA水平的异常变化，可提示该中药在研究剂量下是否有细胞毒性及产生毒性作用的机制。2.3发展前景基因芯片技术发展到今天不过短短十几年时间,虽然还存在一些技术难点,但其在基因表达谱分析、基因诊断、药物筛选及序列分析等诸多领域已呈现出广阔的应用前景。随着研究的不断深入和技术的更加完善,基因芯片在中医药研究领域一定会发挥出其非凡的作用,尤其是有效中药、中药有效成分的筛选,新发现中药的功能鉴定,经脉脏腑相关的分子、基因机制,不同证型的基因组表达谱比较,疾病证型演化的基因组表达谱等,这些将是中医药研究的重大领域。3、 结语当前医学研究的一个重要动向是向分子或基因水平深入,不仅 RAPD标记技术和基因芯片技术，分子生物学的许多理论和技术已渗透到现代医学和中国传统医药学的各种领域,它使得传统的研究方法和诊治手段有了质的更新,经典科学概念得以延伸和升华,为从更深层次更本质地认识生命现象内在的基本规律开辟了新途径,也为中医药研究带来了新的机遇。相信分子生物学理论和技术在中医药研究领域中的广泛应用必将极大地推动中医理论和临床实践向前发展,迎来我国传统医药学发展史上的又一个春天。参考文献：1王会玲.浅谈分子生物学技术在中医药学上的应用.中国中医药信息杂志,1997,4(11)37382李杰芳.分子生物学技术在中药研究中的应用.广州中医药大学学报,1996,13(3,4)971093ShiLiming，Genetiediversityanditspreservation.ChlneseBiodiversit，1993，i(l):255124曾明,严继舟,张汉明,等.RAPD技术在葛属药用植物分类和鉴定中的应用J.中草药2000,31(8):620-622.5梁之桃,秦民坚,王峥涛,等.柴胡属5种植物RAPD分析与分类鉴定J.中草药2002,33(12):1117-1119.6王慧中,卢江杰,施农农,等.利用RAPD分析13种石斛属植物的遗传多样性和亲缘关系J.中草药2006,37(4):588-592.7肖小河,刘峰群,史成和,等.国产姜黄属药用植物RAPD分析与分类鉴定J.中草药2000,31(3):209-212.8杨丽萍,王明臣,王米渠,等.基因芯片技术研究针灸对肾阳虚证骨关节炎患者免疫相关基因表达的影响J.辽宁中医杂志,2006,33(3):257258.9徐仿周,吴继洲.基因芯片技术在中药中的应用研究进展J.国外医学药学分册,2005,32(5):300-305.10陈勇，韩凤梅，蔡敏.中药肝脏毒性评价的基因芯片技术研究J.中国医药学报，2003，18（6）：336-338.11Hara A，lizuka N，Hamamoto Y，et al.Molecular dissection of amedicinal herb with anti-tumor activity by oligonucleotide microar-rayJ.Life Sci，2005，77（9）：991-1002.12Kiela P R,Midura A J,Kuscuoglu N,et al.Effects of Boswellia serra-ta in mouse models of chemically induced colitisJ.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2005,288(4):798-808.13卢江，随机放大多态性DNA(RAPD)一一新种的遗传标记技术。植物学报，1993，35(增刊):11912714Kozal MJ,Shah N,Shen N,et al.Extensive polymor-phisms observed in HIV-I clade B protease gene using high-den-sity oligonucleotide arraysJ.Na