植物生物工程实验二(植物DNA的提取).ppt

植物生物工程实验,植物DNA提取、质量检测 及特定基因片段操作,综合实验二,郝大海,实验目的,了解植物DNA提取方法，熟悉操作步骤 掌握植物大分子操作注意事项及试剂用具准备方法 掌握DNA质量紫外分光光度计检测方法 了解PCR原理，熟悉操作步骤 掌握核酸的琼脂糖电泳检测方法,保证DNA一级结构的完整性 排除其它分子的污染 RNA、蛋白质、多糖等,DNA提取的原则,实验原理（DNA提取）,DNA存在部位,主要存在于细胞核中，线粒体和叶绿体中也少量存在,基因组DNA的提取 CTAB法 SDS法 质粒DNA的提取 碱裂解法 煮沸法 线粒体、叶绿体DNA的提取 差速离心结合SDS裂解法,DNA提取的方法,在浓氯化钠溶液(12mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很大,RNA核蛋白的溶解度很小;而在稀氯化钠溶液(0.14mol/L)中,DNA核蛋白的溶解度很小,RNA核蛋白的溶解度很大.因此,可利用不同浓度的氯化钠溶液将DNA核蛋白和RNA核蛋白从样品中分别抽提出来.,分离得到核蛋白后,需进一步将蛋白等杂质除去,常采用的去除蛋白的方法有3种: 用含辛醇或异戊醇的氯仿振荡核蛋白溶液,使其乳化,然后离心除去变性蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相和氯仿相中间,而DNA溶于上层水相.用两倍体积95%乙醇溶液将DNA钠盐沉淀出来.如果用酸性乙醇或冰乙酸来沉淀,得到的是游离的DNA. 用十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂使蛋白质变性,与核酸分离,从而从材料中直接提取出DNA. 用苯酚处理,然后离心分层,DNA或溶于上层水相,或存在于中间残留物中,蛋白变性后则停留在酚层内.吸出上面水层,将其注入两倍体积的95%乙醇溶液中,得到白色纤维状DNA沉淀,CTAB法原理,CTAB（十六烷基三甲基溴化铵），是一种阳离子去污剂， 可溶解细胞膜，并与核酸形成复合物,高盐溶液中（0.7mol/L NaCl），该复合物可溶的 有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质,上清加入乙醇沉淀DNA。,CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,CTAB,CTAB提取缓冲液的经典配方,SDS法,原理 SDS 阴离子去垢剂 高温（5565）裂解细胞，蛋白变性，染色体离析 高盐(KAc或NH4Ac) 或降低温度（冰浴） 使蛋白质及多糖杂质沉淀 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提 乙醇沉淀水相中的DNA,SDS,SDS提取缓冲液的配方,DNA提取基本步骤,材料准备,细胞裂解,核酸分离纯化,核酸沉淀,核酸溶解保存,基因组DNA 新鲜材料，低温保存 细胞培养时间不能过长,材料准备,基因组DNA 材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低 针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式： 植物材料液氮研磨 培养细胞蛋白酶K,细胞裂解,采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系 采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀 离心分离两相时，应保证一定的转速和时间 针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法,核酸分离纯化,多糖的去除： 多糖水解酶,蛋白质的去除： 酚/氯仿抽提 使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等） 蛋白酶处理,多酚的去除： 加入还原剂：-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合 盐离子的去除： 70的乙醇洗涤,预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀 加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀 晾干DNA，让乙醇充分挥发,核酸沉淀,若长期储存建议使用TE缓冲液溶解 pH值为8.0，可防止DNA发生酸解,DNA质量检测,紫外分光光度计检测法 嘌呤和嘧啶的母环含有共轭双键，因此也有紫外吸收现象，且在260nm和280nm处也存在吸收峰。蛋白质中含苯环的氨基酸在这两个波长下也会发生光吸收。因此，通过260nm和280nm下样品的吸收值比率可判断核酸纯度,A：测DNA： 纯的DNA样品OD260/OD280应为1.8，OD260mOD230应大于2.0。 1) OD260/OD280大于1.9时，表明有RNA污染。 2) 小于1.6时，表明样品中存在蛋白质或酚污染； 3) OD260/OD230小于2.0时，表明溶液中有残存的盐和小分子杂质，如核苷酸、氨基酸、酚等。 注： 可能出现既含蛋白质又含RNA的DNA溶液比值为1.8的情况。,测定结果分析,琼脂糖电泳,琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。,DNA、RNA在荧光染料溴乙锭(EB)嵌入碱基平面之间后，DNA、RNA样品在紫外光激发下，可发出红色荧光，荧光强度与核酸含量成正比。使用一系列已知的不同浓度DNA溶液作标准对照，可比较出被测DNA溶液浓度。 注意：此法的比较主要基于目测，是估计水平。 当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(Ethidium bromide, EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10ng的DNA条带，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置。此外，还可以从电泳后的凝胶中回收特定的DNA条带，用于以后的克隆操作,根据OD260定量：,測定260nm吸光值，OD=1.0代表值如下： a. ds DNA (double stranded DNA) = 50 mg/ml b. ss DNA (single stranded DNA) = 40 mg/ml c. oligonucleotide = 33 mg/ml,PCR实验原理,聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)，是一种在体外快速扩增特定基因或DNA序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。 在待扩增的DNA片断两侧和与其两侧互补的两个寡核苷酸引物，经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。,DNA复制（replication）,起始 解旋 引物酶结合 延伸 连接 终止,5,3,5,3,PCR反应的温度循环周期 PCR 反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94变性1min， 60 退火1min， 72 延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。,一般PCR反应条件,仪器药品,1.5ml离心管；5ml离心管；研磨棒；5ml吸头；1000ul吸头（盒）；200ul吸头（盒）；10ul吸头（盒）；5ml移液器；1000ul移液器；200ul移液器；30ul移液器；2ul移液器；试剂瓶；量筒 恒温水浴锅；高速离心机；紫外分光光度计；电泳仪；电泳槽；酸度计；电子天平；PCR仪 CTAB；NaCl；Tris；HCl；H3BO4；EDTA；NaOH；PVP；琼脂糖；EB；引物；dNTP；Taq酶；EB,实验步骤,试剂配制,1M Tris HCl, pH 8.0,先用蒸馏水溶解加至90ml左右，再用HCl调整pH至8.0，定容至100ml,0.5M EDTA, pH 8.0,先用蒸馏水，再加入NaOH（固体）调pH至8.0，定容至100ml,5M NaCl,2CTAB,10% CTAB,T10E1,5TBE,异丙醇；70%乙醇；90%乙醇；10mg/ml EB,抽提液,1M Tris HCl；0.5M EDTA；5M NaCl；T10E1以及所有需使用的离心管，各种吸头均需灭菌,操作流程,操作规程 1. 称取100mg新鲜叶片，置于预冷1.5ml离心管中，加入液氮，研为细粉。加入350l新鲜2CTAB缓冲液，再仔细研磨。（CTAB用于抽提DNA） 2. 用350l新鲜2CTAB缓冲液，冲洗研磨棒，加入2l巯基乙醇，混匀。65水浴45分钟，每15分钟摇动一次。冷却至室温，静置2分钟。 3. 每支离心管加入700l氯仿：异戊醇（24：1）（672氯仿:28异戊醇）混合液。轻柔短暂地混和，避免DNA断裂。颠倒几次。（氯仿、异戊醇、苯酚都用于沉淀蛋白质） 4. 在微型离心机中，以14，000rpm离心5分钟。移取上层水层，置于新的、标识好的1.5ml离心管中。注意避免取到中层物质。将氯仿：异戊醇废液倒入废液缸。 5. 加入50l 10CTAB（溶于0.7M NaCl），轻柔混和，并保证混和完全。,6. 重复第3、第4步。 7. 每支离心管中加入等体积异丙醇（400500l）。上下颠倒几次，4静置20分钟（或20，15分钟）。（异丙醇用于沉淀DNA） 8. 14，000rpm离心20分钟。小心倒出上清夜，避免DNA颗粒丢失。倒置离心管，空气干燥（12分钟）。 9. 用1ml70乙醇清洗DNA（3分钟），14,000rpm离心30分钟。小心倒出70%乙醇，用1ml 90乙醇清洗DNA，14,000rpm离心30分钟，小心地倒去乙醇。倒置离心管，空气中干燥，或用真空泵干燥15分钟。（乙醇用于去除低分子量寡核苷酸和核苷三磷酸） 10. 以150l T10E1或蒸馏水溶解DNA，加入12l不含DNA酶的RNA酶A（10mg/ml）。37反应1小时。 11. 4保存（20长期保存）。,冷却至 室 温,冷却至 室 温,琼脂糖凝胶电泳,取5TBE缓冲液20mL加水至100mL，配制成1TBE稀释缓冲液，待用。 胶液的制备：称取0.4g琼脂糖，置于200mL锥形瓶中，加入50mL 1TBE稀释缓冲液，放入微波炉里加热至琼脂糖全部熔化，取出摇匀，此为1琼脂糖凝胶液。加热过程中要不时摇动，使附于瓶壁上的琼脂糖颗粒进入溶液。,3. 胶板的制备：将有机玻璃胶槽两端分别用橡皮膏紧密封住。将封好的胶槽置于水平支持物上，插上样品梳子，注意观察梳子齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙。 向冷却至50-60的琼脂糖胶液中加入溴化乙锭(EB)溶液使其终浓度为0.5g /mL。用移液器吸取少量融化的琼脂糖凝胶封橡皮膏内侧，待琼脂糖溶液凝固后将剩余的琼脂糖小心地倒入胶槽内，使胶液形成均匀的胶层。待胶完全凝固后拨出梳子，注意不要损伤梳底部的凝胶，然后向槽内加入1TBE稀释缓冲液至液面恰好没过胶板上表面。,加样：取10L DNA样品与2L 6上样液混匀，用微量移液枪小心加入样品槽中。若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量。每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。 电泳：加完样后,合上电泳槽盖，立即接通电源。控制电压保持在60-80V，电流在40mA以上。当溴酚蓝条带移动到距凝胶前沿约2cm时，停止电泳。 染色：未加EB的胶板在电泳完毕后移入0.5g/mL的EB溶液中，室温下染色20-25min。 观察和拍照：在波长为254nm的长波长紫外灯下观察染色后的或已加有EB的电泳胶板。,紫外分光光度计测定核酸浓度的操作步骤,a吸取一定量的DNA样品或RNA样品，加水至特定体积后，转入分光光度计的石英比色杯中。 b分光光度计先用一定量的水校正零点。 c测定待测样品在230nm、260nm和280nm的OD值。 d计算浓度。 双链DNA样品浓度(g/l) = OD260核酸稀释倍数 50/1000； e分析纯度。,PCR反应体系,PCR反应程序,EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套，并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB的垃圾要专门处理后才可丢弃。 当EB太多, 胶染色过深，DNA带看不清时，可将胶放入蒸馏水冲泡，30min后再观察。 制备凝胶时，倒胶的温度不可太低，否则凝固不均匀：速度也不可太快，否则容易出现气泡。,实验注意事项,CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵)，是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性。在高离子强度的溶液中(0.7mol/L NaCl),CTAB与蛋白质和多聚糖形成复合物，只是不能沉淀核酸.通过有机溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。 注：CTAB溶液在低于15 时会形成沉淀析出，因此，在将其加入冰冷的植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15。,(1) PVP(聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多糖结合，有效去除多糖； (2) 蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂变性(SDS、异硫氰酸胍等)高盐洗涤蛋白酶处理核酸分离，纯化； (3)多糖的去除：高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。用多糖水解酶将多糖降解。在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500 L DNA液中加入200l 20% PEG8000 (含1.2 M NaCl)，冰浴20min.核酸分离，纯化； (4) 多酚的去除:在抽提液中加