遗传病分析4基因组DNA提取与PCR扩增技术.ppt_第1页
遗传病分析4基因组DNA提取与PCR扩增技术.ppt_第2页
遗传病分析4基因组DNA提取与PCR扩增技术.ppt_第3页
遗传病分析4基因组DNA提取与PCR扩增技术.ppt_第4页
遗传病分析4基因组DNA提取与PCR扩增技术.ppt_第5页
已阅读5页,还剩13页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

遗传病的分析4 基因组DNA提取与PCR扩增技术,一、基因组DNA提取,实验目的,基因组DNA的制备是基因分析的前提。 本实验要求掌握基因组DNA提取的基本方法。,原 理,DNA在生物体内是与蛋白质形成复合物的形式存在的。核酸与蛋白质之间的结合力包括离子键、氢键、范德华力等,破坏或降低这些结合力就可把核酸与蛋白分开。 DNA、RNA所含有的嘌呤环和嘧啶环的共轭双键具有吸收紫外光的性质,吸收高峰在260nm处,所以,可用紫外分光光度法测定DNA的浓度。,原理,基因组DNA提取试剂盒:在高盐的状态下,DNA纯化树脂专一性地吸附DNA;而在低盐或水溶液状态下,DNA被洗脱下来。,器材与试剂,台式高速离心机、天平、水浴恒温箱、移液枪、塑料离心管等 试剂盒(纯化树脂、GN结合液、漂洗液、无水乙醇、离心纯化柱 )、TE缓冲液,操作,1、将全血轻轻混匀,转移0.5ml全血到1ml纯化树脂中,颠倒混匀5-6次,室温,3min。其间要颠倒混匀1次,5000r/min离心3sec; 2、取沉淀,加1mlGN结合液悬浮沉淀,颠倒混匀, 5000r/min离心3sec; 3、取沉淀,加0.5ml漂洗液纯化树脂2次,颠倒混匀, 5000r/min离心3ecs; 4、取沉淀, 加0.8ml无水乙醇悬浮沉淀,颠倒混匀;装入离心纯化柱,12000r/min离心1min,弃乙醇液; 5、空柱再12000r/min离心1min,进一步弃乙醇液; 6、取离心好的纯化柱套入一干净的1.5ml离心管中,加入100ul TE缓冲液于纯化树脂上(不能粘在管壁上),室温下放置3min,12000r/min离心2min。,注意事项,一般情况下,纯净的DNA OD260/OD280比值约为1.8,RNA为2.0。若样品中含蛋白质,则比值下降,必要时需重新抽提。若DNA的比值1.75,则加入SDS至0.5%; 从核酸中去除蛋白质时,常用到酚:氯仿等体积混合液。氯仿的作用是使蛋白质变性并有助于水相和有机相的分离; DNA用TE溶解,可增加DNA的稳定性,便于长期保存。,二、PCR扩增技术,实验原理,多聚酶链反应(PCR)技术的原理类似于DNA的天然复制过程。可简述为: 在微量离心管中加入适量缓冲液,加入微量模板DNA,四种脱氧核苷酸(dNTP),和耐热Taq聚合酶及两个合成的DNA引物,并有Mg2+存在。,实验原理,加热使模板DNA在高温下(94)变性,双链解链,这是所谓变性阶段。 降低溶液温度,使合成引物在低温(56)与模板DNA互补退火形成部分双链,这是所谓退火阶段。 溶液反应温度升至中温(72),在Taq酶作用下,以四种dNTP为原料,引物为复制起点,模板DNA的一条双链在解链和退火之后延伸为两条双链,这是延伸阶段。 如此反复,在同一反应体系中可重复高温变性、低温复性和DNA合成这一循环,使产物DNA重复合成,并且在重复过程中,前一循环的产物DNA可作为后一循环的模板DNA而参与DNA的合成,使产物DNA的量按2n方式扩增。经过2535个循环,DNA扩增倍数可达106109。,实验原理,实验目的,本实验以所提出的全血基因组DNA为模板,以线粒体基因上一段核苷酸为引物,扩增出924bp的扩增产物。学习并掌握PCR 反应的基本原理与实验技术。,器材和试剂,器材 PCR扩增仪,旋涡振荡器,台式离心机,加样枪及枪头等,器材与试剂,试剂: 1、PCR试剂盒: (Taq DNA 聚合酶、 dNTP 、Mg等 ) 2、引物 1(68kb上游) 引物 2(69kb下游) 3、无菌ddH2O 4、模板DNA:为本次实验所提出的全血基因组 DNA,操作,无菌ddH2O 21.5ul Taq酶等 25ul 引物1(68) 0.6ul 引物2 (69) 0.9ul 模板DNA 2ul 混匀后,离心5000r/min1min,置PCR仪,总体积50ul,操作,PCR扩增的设定: 设置PCR扩增仪的热盖温度为100 预变性:945min 循环: 94变性30s 56退火30s 30个循环 72延伸30s 末次延伸:72 5min 4 保存,注意事项,由于PCR技术非常敏感,可使一个DNA分子得以扩增,装有PCR试剂的微量离心管打开之前,应先在微量离心机上作瞬时离心使液体沉积

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论