SNT 2497.28-2010 进出口危险化学品安全试验方法 第28部分：穿梭质粒在突变检验中的应用.pdf

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 进出口危险化学品安全试验方法 第 部分： 穿梭质粒在突变检验中的应用 犜 犲 狊 狋犿 犲 狋 犺 狅 犱狅 犳 犻 犿 狆 狅 狉 狋 犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋犱 犪 狀 犵 犲 狉 狅 狌 狊 犮 犺 犲 犿 犻 犮 犪 犾 狊 犘 犪 狉 狋 ：犛 犺 狌 狋 狋 犾 犲狏 犲 犮 狋 狅 狉 犳 狌 狀 犮 狋 犻 狅 狀犻 狀犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犿 狌 狋 犪 犵 犲 狀 犲 狊 犻 狊 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 前 言 进出口危险化学品安全试验方法 系列标准共分为 部分： 第部分： 体内哺乳动物肝细胞程序外 合成（ ） 试验； 第部分： 空斑形成细胞（ ） 试验； 第部分： 大型溞繁殖试验； 第部分： 酿酒酵母有丝分裂重组试验； 第部分： 睾丸细胞 试验； 第部分： 哺乳类动物细胞姐妹染色单体互换体外试验； 第部分： 小鼠耳肿胀试验； 第部分： 腘窝淋巴结试验； 第部分： 血清溶血素测定试验； 第 部分：淋巴细胞增殖功能测定试验； 第 部分： 种系突变试验； 第 部分： 单细胞凝胶电泳分析试验； 第 部分： 荧光原位杂交试验； 第 部分： 聚丙烯酰胺凝胶电泳试验； 第 部分： 实验； 第 部分： 实验； 第 部分： 哺乳动物行为毒理学试验； 第 部分： 加合物的检测方法； 第 部分： 实验； 第 部分： 法测定蛋白质含量； 第 部分： 琼脂糖凝胶电泳试验； 第 部分： 的 值测定方法； 第 部分： 细胞器的分离实验方法； 第 部分： 细胞免疫功能体外检测方法； 第 部分： 体液免疫功能试验； 第 部分： 巨噬细胞功能试验； 第 部分： 流式细胞术检测凋亡； 第 部分： 穿梭质粒在突变检验中的应用； 第 部分： 生化需氧量（ ） 测定。 本部分为 系列标准的第 部分。 本部分修改采用 分子克隆 中的相关的检测方法， 其有关技术内容与上述方法完全一致， 在标准文 本格式上按 做了编辑性修改。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本部分负责起草单位： 中华人民共和国天津出入境检验检疫局、 中华人民共和国湖南出入境检验检 疫局。 本部分主要起草人： 冯智劼、 王利兵、 王华、 张园、 向雪洁、 赵好力宝。 本部分系首次发布的出入境检验检疫行业标准。 犛 犖犜 进出口危险化学品安全试验方法 第 部分： 穿梭质粒在突变检验中的应用 范围 的本部分规定了进出口危险化学品安全试验中穿梭质粒在突变检验中的应用技术的 术语和定义、 试验原理、 试验方法和试验结果。 本部分适用于进出口危险化学品安全试验中的致突变性检测。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过 的本部分的引用而成为本部分的条款。凡是注日期的引用文 件， 其随后所有的修改单（ 不包括勘误的内容） 或修订版均不适用于本部分， 然而， 鼓励根据本部分达成 协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本 部分。 分子克隆 术语和定义 下列术语和定义适用于本部分。 穿梭质粒 狊 犺 狌 狋 狋 犾 犲狏 犲 犮 狋 狅 狉 穿梭质粒是既能依靠质粒基因组在原核细胞中繁殖， 又能依靠病毒基因组在真核细胞中复制的一 类质粒。 靶基因 狋 犪 狉 犵 犲 狋 犵 犲 狀 犲 是诱变剂在哺乳动物细胞中作用的靶子， 有时又是赋予细胞某种生物特征的选择基因。 转化 狋 狉 犪 狀 狊 犳 狅 狉 犿 犪 狋 犻 狅 狀 将 导入大肠杆菌或酵母细胞， 并稳定地整合于基因组中， 从而使受体细胞发生永生化改变的 现象。 转染 狋 狉 犪 狀 狊 犳 犲 犮 狋 犻 狅 狀 病毒 或 导入感受态大肠杆菌的过程。也指将任何 （ 包括质粒 ） 或 导入 受体细胞的过程。 试验原理 穿梭质粒除了含有在真核和原核细胞中复制的起点外， 穿梭质粒带有对突变敏感的靶基因， 将诱变 剂处理的质粒转染哺乳动物细胞或先转染细胞后经诱变剂处理， 在细胞内修复和复制后， 回收质粒转化 宿主菌， 在一定条件下筛选突变子， 并进一步对突变子靶基因测序以分析突变的位点、 类型、 序列特异性 等信息， 从而研究诱变剂的诱变机制。由于诱变是在哺乳动物细胞内发生的， 因而能够较真实地反映高 等动物的诱变机制； 且诱变的发生通过宿主菌显色反应来显示， 其任一位置发生的单碱基置换都能从表 犛 犖犜 型改变表现出来； 进一步对突变子靶基因进行序列分析， 使表型的改变在 分子水平上得到证明， 敏感性极高。 试验方法 试剂耗材 细胞、 质粒及其宿主细菌可根据试验目的进行选择。 选择剂可根据试验目的和质粒上的选择基因进行选择， 如 、 等。 显色剂， 需要根据试验目的选择。常用的有： （ 溴 氯 吲哚 半乳糖苷） 、 （ 异丙基 硫代半乳糖苷） 。 基因工程所需的各种试剂和酶。 受试物溶液 试验所需各个浓度受试液通过稀释受试物储备液所得。储备液的配置应采用机械方法（ 如搅拌或 超声） 进行充分溶解。可采用饱和度值（ 溶解度值） 来得到合适浓度的储备液。可使用助溶剂或分散剂。 相应的溶剂对照组不能引起突变。 试验步骤 重组质粒的构建鉴定 操作质粒提取、 酶切、 连接、 重组质粒转化等均按 分子克隆 进行。转化到细菌中的重 组质粒经选择基因的筛选， 随机挑选其单菌落进行 鉴定和核苷酸序列测定。 染毒和转染 转染前一天接种 个细胞于 培养瓶中， 用不含双抗的 培养基常规培养使细胞 密度达 备用； 于细胞体外直接将不同剂量的受试物溶液 作用质粒一段时间（ 根据质粒 的性质选择作用时间） 。需设立对照组。将染毒后的质粒转染至目的细胞。具体方法可根据试验目的 选择， 详细方法可按照 分子克隆 进行。然后将转染后的细胞置于含 小牛血清的 培养基 中常规培养 后收获质粒。 细胞内染毒 将已经转染了质粒的细胞进行培养， 当细胞密度达到 时加入不同剂量的受试物溶液， 避光培养 ， 移去受试物溶液， 开始收获质粒。 细胞内质粒犇 犖 犃的抽提 可以根据实际情况选择抽提方法。此处介绍 法进行抽提。将转染后的细胞用 洗 两遍， ， 各 洗两遍。加裂解液（ ， ） 皿，将脱落的细胞移至 管， 加入 使其终浓度为 ， 缓慢混匀，放 置以上， 犵离心 ， 取上清液用酚氯仿抽提， 乙醇沉淀， 犵离心 ， （ ， ） 溶解。 转染细菌 将抽提的质粒转入宿主细菌， 具体方法参见 分子克隆 。常用氯化钙法。 显色反应 涂板及培养 将感受态细菌涂布于特定的培养基上， 室温放置 。 培养 ， 计数转化子。 显色 可以根据预先选好的显色方法， 判断是否有突变。例如： 采用含有 、 和抗性药物的 培养基上野生菌落为蓝色， 而突变型为白色。分别计数。 表型鉴定 为了避免假阳性和假阴性， 随机挑选野生型和突变型菌落， 重复 ， 如果结果一致， 则可以进一步 犛 犖犜 验证试验结果。 用于筛选突变的穿梭质粒的条件 可以得到含有质粒的克隆细胞。 自身突变率小于 。 具有较多的转化子。 试验结果 观察结果 观察结果可填入表， 受试物诱发穿梭质粒的突变频率， 其中 突变频率突变子转化子 表 受试物诱发穿梭质粒的突变频率 组别转化子个突变子个突变频率 对照 剂量 剂量 剂量 结果分析 根据加入受试物后突变子的增减， 判断受试物对质粒突变作用的影响。通过检验和方差分析等 统计学方法， 比较不同剂量之间的差异。 犛 犖犜 书