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文档简介

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 食品中致泻大肠埃希氏菌检测 犕犘 犆 犚 犇 犎 犘 犔 犆法 犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犱 犻 犪 狉 狉 犺 犲 犪 犵 犲 狀 犻 犮犈 狊 犮 犺 犲 狉 犻 犮 犺 犻 犪 犮 狅 犾 犻犻 狀犳 狅 狅 犱 犕犘 犆 犚 犇 犎 犘 犔 犆犿 犲 狋 犺 狅 犱 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 前 言 本标准按照 给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准主要起草单位: 中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、 中华人民共和国西藏出入境检验检 疫局、 中华人民共和国黑龙江出入境检验检疫局、 北京盈九思科技发展有限公司。 本标准主要起草人: 徐君怡、 曹际娟、 郑秋月、 王顺芝、 高小博、 李苏龙、 李建民、 王秋艳、 赤列加措。 犛 犖犜 食品中致泻大肠埃希氏菌检测 犕犘 犆 犚 犇 犎 犘 犔 犆法 范围 本标准规定了食品中致泻性大肠埃希氏菌, 包括肠产毒性大肠杆菌、 肠致病性大肠杆菌、 肠出血性 大肠杆菌、 肠侵袭性大肠杆菌的 检测方法。 本标准适用于食品中致泻性大肠埃希氏菌, 包括肠产毒性大肠杆菌、 肠致病性大肠杆菌、 肠出血性 大肠杆菌、 肠侵袭性大肠杆菌的 快速检测。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文 件, 凡是不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 食品卫生微生物学检验 致泻大肠埃希氏菌检验 分析实验室用水规格和试验方法 实验室 生物安全通用要求 实验室质量控制规范 食品分子生物学检测 进出口肉及肉制品中肠出血性大肠杆菌 : 检验方法 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 ( ) : 聚合酶链式反应 ( ) : 多重 ( ) : 变性高效液相色谱 : 三乙基铵乙酸盐 生物安全措施 为了保护实验室人员的安全, 应由具备资格的工作人员检测致病菌, 所有培养物应小心处置。应按 照 的有关规定执行。 废弃物处理和防止污染的措施 检测过程中的废弃物需经 高压灭菌处理至少 后再弃置。 检测过程中防止交叉污染的措施参照标准 的规定执行。 原理 多重 , 又称多重引物 或复合 , 它是在同一 反应体系里加上两对以上引物, 同时 犛 犖犜 扩增出多个核酸片段的 反应, 其反应原理, 反应试剂和操作过程与一般 相同。 分析 技术是应用离子对反相液相色谱原理对 片段进行分离。离子对采用三乙基胺乙酸盐缓冲溶液 ( ) , 核苷酸片段分子中带负电荷的磷酸根基团与 分子中带正电荷的氨基发生静电作用相 互吸引, 同时 分子中的三个乙基与固定相 表面的烷基发生疏水作用力而相互吸引, 通过流动 相中的乙腈的梯度洗脱达到将不同大小的核苷酸片段分离。 试剂和材料 除另有规定外, 所有试剂纯度应为色谱纯, 水为灭菌超纯水。所有试剂均用无 酶污染的容器 分装。 水: 应符合 中一级水的规格。 犜 犪 狇 聚合酶。 : 、 、 、 。 缓冲液: 见 。 引物: 引物序列见表 。 溶液: 见 。 。 蛋白酶 ( ) 。 氯化钠溶液( ) : 和 。 ( 十六烷基三甲基溴化胺) 。 三氯甲烷。 异戊醇。 酚。 异丙醇。 乙醇。 缓冲液: 见 。 双料缓冲蛋白胨水: 见 。 主要仪器和设备 仪。 仪。 离心机( 离心转速 犵) 。 超净工作台。 微量可调移液器和灭菌吸头: 、 、 、 、 。 灭菌 反应管。 方法提要与检测程序 方法提要 本方法采用四重 同时扩增四种致泻性大肠埃希氏菌。四重 产物再利用 非变性 条件下的 分离技术, 根据 扩增片段长度的不同, 按照从小到大顺序依次洗脱核苷酸片段, 从 犛 犖犜 而对食品中致泻性大肠埃希氏菌进行快速检测。 检测程序 食品中致泻大肠埃希氏菌 检测的流程图见图。 图 犕犘 犆 犚 犇 犎 犘 犔 犆法检测食品中致泻大肠埃希氏菌流程图 操作步骤 样品制备、 增菌培养和分离 以无菌操作取样品 , 粉碎后加入装有 双料缓冲蛋白胨水的无菌三角瓶或拍击式均质 袋中, 摇晃 或拍击 , 将三角瓶或均质袋封口后在 培养( 样品在冷藏或 冷冻条件下保存 之内的需要培养; 保存时间在 以上的需要培养) 。从增菌肉汤中取出 加入到装有 双料缓冲蛋白胨水的试管中, 混匀后在 培养 。 增菌液模板犇 犖 犃的制备 取 中培养的二次增菌液 , 加到 无菌离心管中, 犵离心 ; 吸弃上清 液, 取沉淀, 加 溶液( ) , 悬浮, 加 和蛋白酶 ( ) , 混 匀, 温浴 ; 加 氯化钠( ) , 混匀, 加 溶液( 和 氯化钠) , 混匀, 温浴 ; 加等体积三氯甲烷异戊醇( 体积比为 ) , 混匀, 犵离心 ; 取 上 清 液, 加 等 体 积 酚三 氯 甲 烷异 戊 醇 ( 体 积 比 为 ) , 混 匀, 犵离心 ; 取上清液, 加 倍体积异丙醇, 轻轻混匀, 犵离心 ; 取沉淀, 用 乙醇清洗次, 干燥, 加 溶液( ) 溶解, 此即为 溶液。若不能立即检测, 可保存于 备用。也可使用商业化的 提取试剂盒并按其说明制备模板 。用于阳性对照的菌株 应按 的步骤同时进行 的制备操作。 犇 犖 犃浓度和纯度的测定 取 溶液加 梯度稀释至 , 使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测 犛 犖犜 和 处的光密度值。 的浓度按照式( ) 计算获得: 犮犃犖 () 式中: 犮 浓度, 单位为微克每微升( ) ; 犃 处的吸光值; 犖 核酸稀释倍数。 双链 。 当 比值在 之间时, 适宜于 扩增。 犘 犆 犚扩增 反应体系( ) : 缓冲液; ( ); 犜 犪 狇 聚合酶 ( ) ; 模板 ( ) ; 肠致病性大肠杆菌、 肠出血性大肠杆菌、 肠产毒性大肠 杆菌、 肠侵袭性大肠杆菌各引物对( ) 浓度分别为、 、; 水补足至 。 反应条件: 预变性 ; 变性 , 退火 , 延伸 进行 个循环; 延伸 ,保存反应产物。将 产物进行 分析。 注: 反应参数可根据基因扩增仪型号的不同进行适当的调整。 犇 犎 犘 犔 犆检测 犇 犎 犘 犔 犆分析条件 色谱柱: 色谱柱( , 粒度 ) 。 柱温: 。 流动相: , 缓冲溶液 , 缓冲溶液; , 缓冲溶液 , 缓 冲溶液; , 缓冲溶液 , 缓冲溶液; , 缓冲溶液 , 缓冲溶 液 ; , 缓冲溶液 , 缓冲溶液; , 缓冲溶液 , 缓冲溶液。 流速: 。 检测器: 荧光检测器( 光源: 灯; 激发谱带宽: ; 发射谱带宽: ; 检 测灵敏度: 在波长 积分) 。 上样量: 产物。 犇 犎 犘 犔 犆分析 将装有 产物的反应管放置在 金属板的微孔中。 登录 分析系统, 按照 设置 分析条件, 建立检测程序并运行。 质控对照设置 检测过程中应分别设阳性对照和阴性对照。阳性对照为扩增片段的阳性克隆分子 或阳性菌 株 , 阴性对照为非目标致病菌 。 结果及判断 质控标准 阴性对照: 无吸收峰出现。 阳性对照: 出现典型的 产物吸收峰, 且峰吸收值大于。 犛 犖犜 不符合上述对照质控标准的视为无效。 结果判定和报告 若在与阳性对照相同的出峰时间, 检测样品无扩增吸收峰出现, 可判定样品结果为阴性, 直接 报告未检出相对应的致病菌。 若在与阳性对照相同的出峰时间, 检测样品出现典型的 产物吸收峰( 参见附录 ) , 且吸 收峰值大于 时, 可判定该样品结果为可疑阳性。 若在与阳性对照相同的出峰时间, 检测样品出现典型的 产物吸收峰, 但吸收峰值小于 时, 建议样本重做。重做结果峰吸收值仍小于 则为阴性, 否则为可疑阳性。 对于可疑阳性结果, 应按照相关检测方法( 和 ) 做进一步的生化鉴定 和报告。 犛 犖犜 附 录 犃 ( 规范性附录) 试剂和引物序列 犃 试制配制 犃 犘 犆 犚缓冲液 、 , 氯化钾, 氯化镁。 犃 犜 犈缓冲液 、 , 、 , 用 处理过的水配制并进行高压灭菌。 犃 犇 犎 犘 犔 犆缓冲液 缓冲溶液 为 ; 缓冲溶液 为 乙腈, 缓冲溶液 为 乙腈; 缓冲溶液 为 乙腈。 犃 双料缓冲蛋白胨水 蛋白胨 氯化钠 磷酸氢二钠( 含 个结晶水) 磷酸二氢钾 蒸馏水 将各成分加入蒸馏水中, 搅混均匀, 静置约 , 加热煮沸至完全溶解, 调至 , 高压灭菌 。 犃 引物序列 食品中致泻大肠埃希氏菌 检测所用引物序列见表 。 表 犃 食品中致泻大肠埃希氏菌 犕犘 犆 犚 犇 犎 犘 犔 犆检测所用引物序列 序 号基因名称致病菌名称引 物 序 列 预期片段 犾 狋肠产毒性大肠杆菌 犫 犳

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