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文档简介

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 sN/T3767。 - 2014 出口食品中转基因成分环介导 +E+TTg (LAMP) TOUU fi iE ffi 7 frl3r), EiK MrR604 ffi e Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticalty modiried ffi;iilH #;i;T export- 2010 13发 布2014-0g01实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发布 sN/T3767,7-2014 亠 一一日 艹 刚 SN/T3767 食品中转基 因成分环介导等温扩增 (LAMP)检测方法 共分为30部 分 : 第1部分 :通 用要求和定义 ; 第2部分 :筛 选方法 ; 第3部分 :玉 米Bt11品系 ; 第 4 部分 : 玉米B t 1 7 6 品 系 ; 第 5 部分: 玉米G A 2 1 品系 ; 第 6 部分 : 玉米M I R 1 6 2 品 系 ; 第 7 部分: 玉米M I R 6 0 4 品 系 ; 第 8 部分 : 玉米M O N 8 1 0 品系 ; 第 9 部分 : 玉米M O N 8 6 3 品系 ; 第 1 0 部分 : 玉米M O N 8 8 0 1 7 品 系 ; 第 1 1 部分 : 玉米M O N 8 9 0 3 4 品 系 ; 第12部分 :玉 米T-25品系 ; 第13部分 :玉 米3272品系 ; 第 1 4 部分 : 玉米5 9 1 2 2 品 系 ; 第 1 5 部 分 : 大 豆A 2 7 0 4 1 2 品 系; 、 第 1 6 部分 : 大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品 系 ; 第 1 7 部分 : 大豆D P 3 5 6 0 4 3 品 系 ; 第 1 8 部分 : 大豆G T 泓 0 3 2 品 系 ; 第 1 9 部分: 大豆M O N 8 9 7 8 8 品 系 ; 第部分 :水 稻Bt63品系 ; 第21部分 :水 稻KF6品系 ; 第22部分 :水 稻KF8品系 ; 第23部分 :水 稻KMD品系 ; 第 2 4 部分 : 水 稻L L R I C E 6 2 品 系 ; 第25部分 :水 稻M12品系 ; 第 2 6 部分 : 水稻T 1 G 1 9 品系 ; 第27部分 :水 稻T2A1品系 ; 第 2 8 部 分 : 小麦 B 7 3 - 6 1 品 系; 第29部分 :甜 菜H 1品系 ; 第30部分 :油 菜RT73品系。 本部分为SN/T3767的第7部分 。 本部分按照GB/T1.109给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。 本部分起草单位 :中 华人 民共和国广东出入境检验检疫局 、 仲恺农业工程学院、 中华人 民共和 国汕 头出人境检验检疫局 、 中华人 民共和国北京 出人境检验检疫局 、 中华人 民共和 国上海 出入境检验检疫 局、 中国检验检疫科学研究院、 中华人 民共和国天津 出人境检验检疫局 、 中华人 民共和国辽宁出人境检 I sN/T3767.7-2014 验检疫局、 中华人 民共和国珠海出人境检验检疫局 、 广州迪澳生物科技有限公司。 本部分主要起草人 :凌 莉 、 刘津 、 易敏英 、 高苏娟 、 蔡颖 、 刘静宇 、 卓锦雪 、 曾静 、 李晓虹 、 陈颖 、 郑文杰 、 曹际娟 、 冯家望 、 李志勇 、 石磊 、 张隽 、 陈源树 、 李婷 、 关丽军 。 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增 (LAMP)检测方法 第7部分 :玉 米MIR604品系 1 范围 SN/T3767的 本部分规定 了食 筛检测方法 。 本部分适用于玉米及其加工产 本方法的定性检测低限为0.5 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是,仅 注 日期 的版本适用于本文 件 。凡是不注 日期的引用文件 ,其 文件 。 GB/T6682 分 析实验室用水 GB/T19495.2 转 基 因 产 品 GB/T19495,3 转 基 因 产 品 检 测 GB/T19495,7 转 基 因 产 品 检 测 核酸提取纯化 和制样 转基因植物及其产品成分检测米M定性PCR方法 (农 业部1485号 公告6 10) SN/T3767.2 2014 出 口 选方法 3 防污染措施 MP)检 测方法 第2部分 :筛 环介导等温扩增检测过程的防 4 抽样与制样 B/T1 按照 G B / T 1 9 4 9 5 . 7 的 规定执行。 5 核酸提取纯化 按照GB/T19495.3的规定执行 。 6 LAMP检 测方法 6.1 原理 6.1.1 一 般原理 根据转基 因玉米MIR604品 系外源基因和玉米边界序列设计 的内、 外引物各一对及环状卞游引物 sN/T3767.7-2014 的环介导等温扩增(LAMP)初 成分的定性检测 。 sN/T3767,72014 一条 ,特 异特性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立区域 ,利 用Bs莎酶启动循环链置换反应 ,在 玉米MIR604品系特异 目标序列启动互补链合成 ,在 同一链上互补序 列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物 ;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶 液中的Mg2+结合 ,产 生副产物(焦 磷酸镁 )形 成乳 白色沉 淀 ,加 人显色液 ,即 可通过颜色变化观察判定 结果 。 6.1,2 显色液显色原理 SYBR Green I是 一种高灵敏的DNA荧 光染料 ,可 以嵌人方式结合到双链DNA的小沟 内。当它 与双链DNA结合时 ,荧 光信号是游离状态的8001000倍 。在不发生扩增反应时 ,SYBR染料分子的 荧光信号不发生改变 ,颜 色显现为橙色 ;当 发生扩增反应时 ,随 着双链DNA的增加 ,SYBR染料 的荧光 信号也随之大幅度增强 ,其信号强度可代表双链DNA分子的数量 ,同 时颜色由橙色变为绿色。 6,2 仪器和设备 6,2.1 超 纯水发生器 。 6 , 2 . 2 水 浴锅或加热模板 : 6 3 , 0 0 , 5 和 8 0 . 0 0 , 5 。 6,2.3离心 管 :0,1mL、 1,5mL。 6 . 2 , 4 移液 器: 量 程 0 , 5 u L 1 0 u L ; 量 程 1 0 u L 1 0 0 u L ; 量 程 1 0 0 u L 1 0 0 0 u L 。 6 . 2 , 5 计 时器。 6.3 试剂和材料 除另有规定外 ,所 有试剂均为分析纯或生化试剂 。 6,3,1 实 验用水 :应 符合GB/T6682中 一级水 的规格 。 6 , 3 . 2 d N T P s 溶 液: 每种核苷酸浓度 1 0 m m 。l / L 。 6 , 3 . 3 B s 彦D N A 聚合 酶( 如: N E B 公 司 或 具 有 同 等 效 果 的D N A 聚合 酶 ) : 酶 浓 度8 U / u L 。 6 . 3 . 4 1 0 T h e r m o l P o l 缓冲 液: 含 2 0 0 m m o l / L T h s H C L ( p H 值 为 8 . 8 ) 、1 0 0 m m o l / L 硫 酸铵、 1 0 0 m m o l / I 氯 化钾、 m m l / L 硫 酸镁、1 % T r o n 1 0 0 。 6 . 3 , 5 硫 酸镁溶液: 1 5 0 m m o l / L 。 6 . 3 , 6 甜 菜碱: 5 m o l / L 。 6 . 3 . 7 显 色液: S Y B R G r e e n I 荧 光染料, 1 0 0 0 。 6,3,8 引 物 :根 据转基因玉米MIR604品系外源基 因和玉米边界序列设计一套特异性引物 ,包 括外引 物1,外引物2,内引物1和内引物2,下游环引物。 外引物扩增片段长度 :356bp 夕 卜 引 物 1(F3,5 -3 ):AATCTGCCTATCGAGAAGA 夕 卜 引 姥 勿2(B3,5 -3 ):CGGTTCTGTCAGTTCCAA 内 弓u吻1(FIP,5,-3):GTGTGATCTGGCGTCCAGGAACCAGTGAATGGAGATG 内 引 吻 勿2(BIP,5 -3 ):CGCACGCAATTCAACAGAACCTTAATTCTCCGCTCATG 下游环引物 (BLP,53):CGGGAAACGACAATCTGA 6.4 实 验步骤 6.4.1 阴 性对照 、 阳性对照和 空 白对 照 的设 置 6.4.1,1 阴 性对 照 : 采用不含有待测基 因序列 的植 物基 因组DNA为模板 。 2 sN/T3767,7-2o14 6.4.1.2 阳 性对照 : 采用含有 目标基 因序列的植物DNA或质粒DNA作为模板 ,浓 度应略高于方法检测低限。 6,4,1,3 设 两个空 白对照 : 提取 DNA时 设置的提取空 白对照(以水代替样品); LAMP反 应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模 板)。 6,4.2 内 源基因检测 LAMP检 测前应先进行 内源基因检测 ,结 果 阳性则表 明从样 品中提取的DNA可以进行外源基 因 检测 ;否 则应重新进行DNA提取和纯化 。内源基因的检测参照本SN/T3767,2 14的 规定进行 。 6,4.3 玉 米MIR604品系 LAMP反 应体系 LAMP反 应体系见表1。每个样 品各做2个平行管 。加样时应使样晶DNA溶液完全加人反应液 中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后 ,将 1uL显 色液滴在管盖 内侧 ,盖管盖时应小心 ,防 止 显色液混合进人反应液中。 表 1 玉米MIR604品 系LAMP反应体 系 6 , 4 , 4 L A M P 反 应参数 6 3 , 0 o , 5 恒温扩增 6 0 m i n , 8 0 . o o . 5 5 m i n 使 酶灭活, 反应 结束。 6.4,5 显 色反应 反应结束后 ,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀 ,立 即在黑色背景下进行颜色观察 。 6.5 质 量控制 6.5.1 基 本原则 :实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况 。否则 ,任 一种对照如果 出现非下述正常结果 ,应 重做实验 。 6,5.2 空 白对照 :反 应管中液体呈橙色。 组 分 工作液浓度加样量/l I 反应体系终浓度 T h e r m P l 缓 冲液 1 外引物1(F3)1 0 u m o l / L o,5 0 . 2 u m o l / L 夕 卜 引爿 勿2(B3) 10uml/L 0 . 2 u m o l / L 内引物1(FIP) 40umol/L 1,0 1,6umol/L 内引物2(BIP40umol/L1.6umol/L 下游环引物(BLP)20umol/L 0 , 8 u m o l / L dNTPs 1 0 m m l / L 1.4mml/L 甜菜碱5mol/L40,8mol/L 硫酸镁 150mmd/L l 6mmol/L B s 莎D N A 聚 合酶8U/uL 1 0.32U/uL DNA模 板100 nglpl B ng/pL 水 补足至 25.0 sN/T3767,7-2014 6.5.3 阴 性对照 :反 应管 中液体呈橙色 。 6.5.4 阳性对照 :反 应管中液体呈绿色。 7 结果判断和确证 7.1 待 检样品2个平行样反应管 中液体均呈橙色 ,同 时各种实验对照结果正常 ,可 判断该样 品检测结 果为阴性 。 7.2 待检样品2个平行样反应管 中液体至少1管呈绿色 ,同 时各种实验对照结果正常 ,可 判断该样 品 转基因玉米MIR604品系初筛阳性 ,还 应通过下列方法之一进行确证(见 附录A): 按照农业部 1485号 公告 按照欧盟的方法(CRLV 可对外引物 PCR扩 增产 8 结 果表述 8.1 检测结果为阴性 ,表 述为“该样 M I R 6 0 4 品 系 ” 。 8.2 检测结果 为转基 因玉米MI 表述 。 证 实验情况进行 结果判 断和 附 录 A (资 料性 附录) 转基 因玉米MIR604品系基 因序 列 A , 1 转 基因玉米M I R 6 0 4 品 系特异目标序列( 来自A c c e s s i o n n o , D J 4 3 7 6 5 1 . 1 ) 556AATCT GCCTATcGAG AAGAGAAGAA 601GGCCTCTTCTGG GGCATTT GGG叮GTGAA 661G胛GCTGCTCAG 721GGCTGGCTGG sN/T3767.7-2014 ATGGGGCCAc C0GTG丿屺刂 G GAG丿 叮 GG丿 CG ACGGGGGGAG CTGGCTGGCT

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