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文档简介

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 sN/T3767。 - 2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增(LAMP)检测方法 第3部分 :玉 米 Bt-11品 系 Loop Jmediated isothermaI amplification detection method for genetically modified components in food for export- Part3:江 aize Bt-11 201午0卜 13发 布2014-08-01实施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发 布 sN/T3767.3-2014 亠 一一囗 亠刖 SN/T3767 出口食品中转基 因成分环介导等温扩增 (LAMP)检 测方法 共分为30部分 : 第1部分 :通 用要求和定义 ; 第2部分 :筛 选方法 ; 第3部分 :玉 米Bt-11品 系 ; 第4部分 :玉米Bt176品 系 ; 第 5 部分 : 玉米G A 2 1 品系 ; 第 6 部分 : 玉米M I R 1 6 2 品 系 ; 第 7 部分 : 玉米M I R 6 0 4 品 系 ; 第 8 部分: 玉米M O N 8 1 0 品 系 ; 第 9 部分 : 玉米M O N 8 6 3 品 系 ; 第 1 0 部分: 玉米M O N 8 8 o 1 7 晶 系 ; 第 1 1 部分 : 玉米M O N 8 9 0 3 4 品 系 ; 第12部分 :玉 米T-25品 系 ; 第 1 3 部分: 玉米3 2 7 2 品 系 ; 第 1 4 部分 : 玉米5 9 1 2 2 品 系 ; 第 1 5 部 分: 大 豆 A 2 7 0 4 - 1 2 品系 ; 、 第 16部分 :大 豆 A5547127品 系 ; 第 17部分 :大 豆 DP356043品 系 ; 第 18部分 :大 豆 GT泓32品系 ; 第 19部分 :大 豆 MON89788品 系 ; 第20部分 :水 稻Bt63品 系; 第21部分 :水 稻KF6品系; 第”部分 :水 稻KF8品系; 第23部分 :水 稻KMD品系; 第 24部分 :水 稻LLRICE62品 系 ; 第25部分 :水 稻M12品 系; 第 2 6 部分 : 水稻T 1 G 1 9 品系 ; 第27部分 :水 稻T2A1品系; 第 2 8 部 分: 小麦 B 7 3 - 6 1 品 系; 第29部分 :甜 菜H71品 系; 第30部分 :油 菜RT73品 系。 本部分为SN/T3767的第3部 分。 本部分按照 GB/T1,109给 出的规则起草。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本部分由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。 本部分起草单位 :中 华人民共和国辽宁出入境检验检疫局、 中华人 民共和国吉林出人境检验检疫 局、 中华人民共和国广东出人境检验检疫局、 广州迪澳生物科技有限公司。 本部分主要起草人 :徐 君怡、 郑秋月、 徐杨、 刘金华、 曹际娟、 李志勇、 徐静、 赵昕、 石磊、 凌莉、 常彦磊、 刘津、 唐大运。 sN/T3767.3-2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增(LAMP)检测方法 第3部分 :玉 米Bt-11品系 1 范围 SN/T3767的 本部分规定了 检测方法 。 本部分适用于玉米及其加工 本方法的定性检测低限为0, 2 规范性引用文件 的环介导等温扩增(LAMP)初筛 定性检测 。 下列文件对于本文件的应用件 ,仅 注 日期 的版本适用于本文 件。凡是不注 日期的引用文件 , 本文件 。 GB/T6682 分 析实验室用 G B / T 1 9 4 9 5 . 2 转 基 因 产 品 G B / T 1 9 4 9 5 . 3 转 基 因 产 品 检 测核酸提取纯 G B / T 1 9 4 9 5 . 5 转 基 因 产 品 检定 量 GB/T19495.7 转 基 因 产 品和 SN/T3767,2 2014 出 口 因 MP) 检 测方法 第2部分 : 筛选方法 3 防污染措施 环介导等温扩增检测过程的 4 抽 样与制样 按照 G B / T 1 9 4 9 5 . 7 的 规定执行 。 5 核酸提取纯化 按照 G B / T 1 9 4 9 5 . 3 的 规定执行 。 6 LAMP检测方法 6,1 原理 6,1.1 一般原理 根据转基因玉米Bt-11品系外源基因和玉米边界序列设计特异性内引物、 外引物和环引物各一对 , sN/T3767,3-2014 特异性 目标序列和引物碱基序列参见附录A。引向特异性识别 目标序列上的六个独立 区域 ,利 用Bs莎 酶启动循环链置换反应 ,在 玉米Bt11品系特异 目标序列启动互补链合成 ,在 同一链上互补序列周而复 始形成有很多环的花椰菜结构 的茎-环DNA混合物 ;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液 中的 Mg2+结 合 ,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀 ,加 人显色液 ,即 可通过颜色变化观察判定结果 。 6,1.2 显色液显色原理 SYBR GreelI是一种高灵敏的DNA荧光染料 ,可 以嵌人方式结合到双链DNA的小沟 内。当它 与双链DNA结合时,荧 光信号是游离状态的8001000倍 。在不发生扩增反应时 ,SYBR染料分子的 荧光信号不发生改变 ,颜 色显现为橙色 ;当 发生扩增反应时 ,随 着双链DNA的增加 ,SYBR染料 的荧光 信号也随之大幅度增强 ,其信号强度可代表双链DNA分子的数量 ,同 时颜色 由橙色变为绿色。 6.2 仪 器和设备 6.2,1 超纯水发生器 。 6 , 2 . 2 水 浴锅或加热模板 : 6 3 . 0 0 . 5 和 8 0 . 0 0 . 5 。 6 , 2 . 3 离心 管 : 0 , 1 m L 、 1 . 5 m L 。 6 . 2 . 4 移液 器: 量程 0 . 5 u L 1 0 u L ; 量 程 1 0 u L 1 0 0 u L ; 量 程 1 0 0 u L 1 0 0 0 u L 。 6 . 2 . 5 计 时器 。 6.3 试 剂和材料 除另有规定外 ,所 有试剂均为分析纯或生化试剂 。 i 6.3,1 实 验用水 :应 符合GB/T6682中 一级水的规格 。 6 . 3 , 2 d N T P s 溶液: 每 种 核苷酸浓度 1 0 m m o l / L 。 6.3,3 Bs莎DNA聚合酶(如 :NEB公 司或具有同等效果 的DNA聚合酶):酶浓度8U/uL。 6,3.4 10ThermolPol缓冲 液:含 200mmol/L Tris-HCl(pH值 为 8.8)、 100mmol/L硫 酸铵、 100mmol/L氯 化钾、 mm。l/L硫 酸镁、1%T ton 100。 6.3.5 硫酸 镁溶液 :150mmol/L。 6.3.6 甜菜 碱:5m。 l/L。 6.3.7 显色 液:SYBR Green I荧 光染料,1000。 6.3,8 引 物 :根 据转基因玉米Bt11品系外源基 因和玉米边界序列设计一套特异性引物 ,包 括外引物 1,外 引物2,内引物1,内引物2,环引物1和环引物2。 外引物扩增片段长度 :192bp 夕 卜 引 物 1(F3,5 -3 ):GCTGTAGCTGGCCTAATC 夕 卜 引 牛 勿2(B3,5 3 ):GGCCAAGGTATCTAATCAGC 内 弓H吻1(FIP,5 -3 ):TATCTGTCTCAGGGGCAGACTCTCAACTGGTCTCCTCTCC 内 引 物 2(BIP,5 -3 ):GCCAAGAAGGCGCAAGTCCATCCCATTTGTGATCTTTGTC 环 引 牛 勿1(FLP,5 -3 ):GTGTTCCCTCGGATCTCG 环 引 物 2(BLP,53 ):ACCGCGAGTTGTTGTATCATA 6.4 实 验步骤 6,4,1 阴 性对照、 阳性对照和空白对照的设置 6,4,1.1 阴 性对照 : 采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板 。 2 sN/T3767.3-2014 6 , 4 , 1 . 2 阳 性对照: 采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板或含有 目的基因序列的质粒DNA代 替DNA模板 。 6.4,1.3 设 两个空 白对照 : 提取 DNA时 设置的提取空 白对照(以水代替样品); LAMP反 应的空 白对照(以 DNA溶 解液代替DNA模板)。 6.4.2 内 源基因检测 LAMP检 测前应先进行 内源基因检测 ,结 果 阳性则表明从样 品中提取 的DNA,可以进行外源基 因 检测 ;否 则应重新进行DNA提取和纯化 。内源基因的检测参照SN/T3767.214的规定进行 。 6.4,3 玉 米 Bt-11品 系 LAMP反 应 体 系 LAMP反 应体系见表1。每个样品各做2个平行管。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液 中,不 要粘附于管壁上。在反应体系配制完成后 ,将 1uI显 色液滴在管盖内侧,盖 管盖时应小心,防 止 显色液混合进入反应液中。 表 1 玉米Bt-11品 系 LAMP反 应体系 6,4.4 LAMP反 应 参数 6 3 . 0 o . 5 恒温扩增 9 0 m i n , 8 0 , 0 0 , 5 5 m i n 使 酶灭活, 反应 结束。 6.4,5 显 色反应 反应结束后 ,将 显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀 ,立 即在黑色背景下进行颜色观察 。 6.5 质 量控制 6.5,1 基 本原则 :实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则 ,任 一种对照如果 出现非下述正常结果 ,应 重做实验 。 组 分 工作液浓度 加样量/uL反应体系终浓度 T h e r m P o 1 缓 冲液 1 夕 卜 狈 刂 L游引物 (F3)10umol/L 0 . 2 u m o l / L 外侧下游引物(B3)10um1/L 0.5 0 , 2 u m l / L 内侧上游引物(FIP)4 0 u m o l / L 1.6umol/L 内侧下游引物(BIP)4 0 u m l / L 1.6uml/L 上游环引物(FLP)20umoI/L 0.8um1/L 下游环引物(BLP)20umoI/L 1.00.8umo1/L dNTPs 1 0 m m o l / L 1 , 6 m m o l / L 甜菜碱 5moI/L 5 1mol/L 硫酸镁150mmol/L l 6mm l/L B 踮D N A 聚合 酶 8U/uL l0,32U/uL DNA模板 I00 ns/pL 2 B ng/pL 水 补足至 25,0 sN/T3767.3-2014 6,5,2 空白对照 :反 应管中液体呈橙色 。 6,5.3 阴性对照 :反 应管中液体呈橙色 。 6,5.4 阳性对照 :反 应管中液体呈绿色 。 7 结 果判断和确证 7.1 待检样品2个平行样反应管 中液体均呈橙色 ,同 时各种实验对照结果正常 ,可 判断该样 品检测结 果为阴性 。 7.2 待检样品2个平行样反应管 中液体至少 1管呈绿色 ,同 时各种实验对照结果正常 ,可 判断该样 品 转基因玉米Bt-11品系初筛阳性0 附录A): 按照 GB/T19495,5进 可对外引物PCR扩 增 8 结 果表述 8,1 检测结果为阴性,表 述为“该样 8.2 检测结果为转基因玉米 Bt- 进行结果判断和表述 。 sN/T3767.3-2014 附 录 A (资 料性附录) 转基因玉米Bt-11品系基因序列 A . 1 转 基 因 玉 米B 1 1 品系 特 异 目 标 序 列 ( 来自 A c c e s s i o n n o 。A Y 1 2 3 6 2 4 . 1 和A Y 6 2 9 2 3 6 ) GCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGGAGGG ATTCTTGGA A,2 引 物碱基序 列及构成 F3: GCTGTAGCTGGCCTA B3: GGCCAAGGTATCTAATCAGC F1c FIP: TATcTGTCTCAGGGGCA CTGGTCTCCTCTCC B1c GCCAAGAAGGCGCATTTGTC GTGTTCCCTCGGAT ACCGCGAGTTGTTG I : L L F B 寸一O甲而 .卜 卜卜z 丌 N “ s 中华人民共和国出人境检验检疫 行 业 标 准 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增(LAMP)检测方法 第3部分 :玉 米Bt-11品 系 sN/T3767, -2014 中 国 标 准

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