SNT 2695-2010 杀鲑气单胞菌的检验操作规程.pdf

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 杀鲑气单胞菌的检验操作规程 犘 狉 狅 狋 狅 犮 狅 犾 狅 犳犱 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犳 狅 狉犃 犲 狉 狅 犿 狅 狀 犪 狊 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 前 言 本标准按照 给出的规则起草。 本标准参照了美国渔业协会的 鱼类某些病原的检测和鉴定程序 （ ） 版中“ 疖疮病” （犉 狌 狉 狌 狀 犮 狌 犾 狅 狊 犻 狊） 一节。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位： 中华人民共和国天津出入境检验检疫局、 中华人民共和国山东出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人： 张立怀、 岳志芹、 陈本龙、 霍蕾、 王建华、 侯艳梅。 犛 犖犜 杀鲑气单胞菌的检验操作规程 范围 本标准规定了杀鲑气单胞菌的检验程序。 本标准适用于进出口鱼苗、 幼鱼和成鱼的检疫。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件， 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本（ 包括所有的修改单） 适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法 设备材料 材料 胰蛋白胨大豆蛋白胨琼脂（ ） ： 见附录 实验用水应符合 规定。 胰蛋白胨大豆蛋白胨血琼脂（ ） ： 见附录 。 脑心浸液琼脂（ ） ： 见附录 。 脑心浸液血琼脂平板（ ） 见附录 。 胰蛋白胨大豆蛋白胨肉汤（ ） ： 见附录 。 考马斯亮蓝（ ） ： 分析纯。 微量生化反应管。 特异性抗血清。 设备 仪。 电泳仪。 凝胶成像系统。 生化培养箱： 。 生物安全柜。 解剖器械。 样品的采集 无临床症状鱼， 无菌采集其肾、 肝、 脾等。 对于体表有临床症状的鱼， 可以采集其病灶深处的组织。 犛 犖犜 细菌分离鉴定 样品的接种 用拭子或接种环将无菌操作采集的组织在 或 上划线。推荐接种在相应血琼脂平板 或 上， 于 培养 。从金鱼、 鲤鱼等病鱼的病灶部位分离时， 用拭子或接 种环取样接种到 或 上， 于 培养 。 为便于区分有毒力杀鲑气单胞菌的特异性菌落， 可在培养基中加入 的考马斯亮蓝（ ） 。 杀鲑气单胞细菌在含 的 或 培养基上为深蓝、 深紫色易碎的菌落， 无毒力的菌株 在该平板上为无色的菌落。 杀鲑气单胞菌的初步判定 杀鲑气单胞菌菌体为革兰氏阴性短的（ ）（ ） 杆菌或球杆菌， 两极 浓染。无运动性， 色素氧化酶绝大多数阳性。大多数产生弥散性棕色色素， 发酵葡萄糖。在 或 上， 菌落大多数溶血。符合上述特征的细菌可初步判定为杀鲑气单胞菌。 玻片凝集试验 初步判定为杀鲑气单胞菌的菌株， 可以用杀鲑气单胞菌的抗血清进行玻片凝集试验。在干净的载 玻片上， 加一滴生理盐水和一滴抗血清， 取一环细菌分别在生理盐水和抗血清中混匀， 内观察是 否出现凝集。如果细菌在生理盐水中不凝集， 在抗血清中凝集判定为杀鲑气单胞菌血清凝集阳性。如 果细菌在生理盐水中凝集， 则该菌为自凝菌株， 不适用本试验鉴定。 细菌的犘 犆 犚鉴定 引物 杀鲑气单胞菌 基因扩增的参考序列参见附录。按照表设计引物。 表 犘 犆 犚引物序列 靶基因引物序列号引 物 序 列 产物大小 表面阵列蛋白 基因（ ） （ ） （ ） 模板的制备 对于分离的菌株， 采用粗提的 进行鉴定。将平板上的菌落取接种环， 加到 的无菌去 离子水中， 摇匀后， 在 热处理 ， 置冰上冷却。 犵离心 ， 取上清液用于检测。用已知 杀鲑气单胞菌菌株作阳性对照， 用无菌去离子水作阴性对照。 细菌 的提取也可以采用等效试剂盒按说明书进行。 犇 犖 犃扩增 采用 反应体系： 犛 犖犜 缓冲液 （ ） 混合物（ ） 引物 （ ） （ ） 模板 犜 犪 狇 聚合酶（ ） 灭菌去离子水 循环参数为： ； 变性 ， 退火 ， 延伸 ， 个循环。 延伸 。 电泳 用 电泳缓冲液配制的琼脂糖凝胶， 加入最终浓度为 的溴化乙锭。用 作为对照， 对 产物进行电泳。在凝胶成像系统上观察有无 大小的特异 性条带。必要时可以对扩增的条带进行测序分析。 结果判定 阴、 阳性对照成立， 检测检出特异条带的样品， 判为条鲑气单胞菌 检测阳性。 亚种确定 初步判定为杀鲑气单胞菌后， 可以进一步按表进行生化试验， 确定其亚种。 表 杀鲑气单胞菌不同亚种的生化特性犪 生 化 特 性 犃 犲 狉 狅 犿 狅 狀 犪 狊 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪犪 犮 犺 狉 狅 犿 狅 犵 犲 狀 犲 狊犿 犪 狊 狅 狌 犮 犻 犱 犪狊 犿 犻 狋 犺 犻 犪 吲哚 甲基红 硫化氢产生 赖氨酸脱羧酶 精氨酸双水解酶 葡萄糖产酸 葡萄糖产气 阿拉伯糖产酸 乳糖产酸 甘油产酸 麦芽糖产酸 甘露醇产酸 蔗糖产酸 海藻糖产酸 七叶苷水解 犛 犖犜 表 （ 续） 生 化 特 性 犃 犲 狉 狅 犿 狅 狀 犪 狊 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪 狊 犪 犾 犿 狅 狀 犻 犮 犻 犱 犪犪 犮 犺 狉 狅 犿 狅 犵 犲 狀 犲 狊犿 犪 狊 狅 狌 犮 犻 犱 犪狊 犿 犻 狋 犺 犻 犪 脂肪酶（ 玉米油） 棕色色素 注： ： 以上菌株呈阳性反应。 ： 菌株呈阳性反应。 ： 以上菌株呈阴性反应。 ： 菌株呈阳性反应。 ： 菌株呈阳性反应。 ： 反应不稳定。 生化试验的进行， 可以参照购买的生化试剂使用说明书。应培养 判定结果。 结果判定 分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌， 与特异性抗血清凝集， 符合杀鲑气单胞菌特性的， 报告杀鲑气单 胞菌检测阳性。 分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌， 检测为阳性的， 报告杀鲑气单胞菌检测阳性。 分离菌初步判定为杀鲑气单胞菌， 经进一步生化试验， 符合杀鲑气单胞菌发生特性的， 判定杀鲑气 单胞菌检测阳性。 未分离出细菌、 所分离菌不符合杀鲑气单胞菌特性的， 判定杀鲑气单胞菌检测阴性。 犛 犖犜 附 录 犃 （ 规范性附录） 培养基和试剂 犃 胰蛋白胨大豆琼脂平板（ 犜 犛 犃） 的配制 胰蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 琼脂 蒸馏水 先将以上成分溶解， 调好 到 ， 高压灭菌 ， 倒平板。也可使用合格的等效 成品培养基。 犃 胰蛋白胨大豆血琼脂平板（ 犜 犛 犃 犅） 的配制 胰蛋白胨 大豆蛋白胨 氯化钠 琼脂 蒸馏水 先将以上成分溶解， 调好 到 ， 高压灭菌 ， 将灭菌后的 冷却至 左右时， 加入终浓度为的马血， 混匀后倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。 犃 脑心浸液琼脂平板（ 犅 犎 犐 犃） 的配制 牛心粉 胰蛋白胨 酵母提取物 葡萄糖 高铁血红素 维生素 盐酸半胱氨酸 氯化钠 磷酸氢二钾 刃天青 琼脂 蒸馏水 将上述成分溶解后， 高压灭菌 ， 冷却至 左右时， 倒平板。也可使用合格的等效成 品培养基。 犛 犖犜 犃 脑心浸液血琼脂平板（ 犅 犎 犐 犃 犅） 的配制 牛心粉 胰蛋白胨 酵母提取物 葡萄糖 高铁血红素 维生素 盐酸半胱氨酸 氯化钠 磷酸氢二钾 刃天青 琼脂 蒸馏水 将上述成分溶解后， 高压灭菌 ， 将灭菌后的 冷却至 左右时， 加入终浓度为 的马血， 混匀后倒平板。也可使用合格的等效成品培养基。 犃 胰蛋白胨大豆肉汤（ 犜 犛 犅） 的配