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文档简介

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 ? ? ? ? ? ? ? ? 国境口岸球孢子菌检测方法 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?发布 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 前 言 本标准按 给出的规则起草。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国厦门出入境检验检疫局、 中华人民共和国深圳出入境检验检 疫局。 本标准主要起草人: 熊焕昌、 李庶甘、 张毅、 林青、 苏水宽、 顾大勇、 杨坤宇。 犛 犖犜 国境口岸球孢子菌检测方法 范围 本标准规定了国境口岸球孢子菌的病原学检验、 酶联免疫吸附试验、 实时荧光定量 检测球孢 子菌核酸的实验室检测方法。 本标准适用于国境口岸球孢子菌的实验室检验。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件, 仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本( 包括所有的修改单) 适用于本文件。 实验室 生物安全通用要求 入出境特殊物品处理规程 危险物品安全航空运输技术细则( 年 年) 术语和定义 下列术语和定义适用本文件。 球孢子菌 犆 狅 犮 犮 犻 犱 犻 狅 犻 犱 犲 狊 犻 犿犿 犻 狋 犻 狊 球孢子菌为双相型真菌, 在组织内形成小球体, 亦称孢子囊, 产生内生孢子, 为孢子型; 在室温或自 然界则形成丝状分隔菌丝体, 产生关节孢子, 为关节菌丝型, 两者在一定条件下可互相转化。关节孢子 具有高度传染性。在沙氏琼脂培养基上室温 条件下培养为霉菌相, 菌落形态、 质地和颜 色多变, 而在组织中或 的富集培养基中以酵母或球形方式生长。 球孢子菌病 犆 狅 犮 犮 犻 犱 犻 狅 犻 犱 狅 犿 狔 犮 狅 狊 犻 狊 球孢子菌病由吸入球孢子菌引起的肺或其他器官的真菌病。可为原发或继发, 原发性感染以 肺部最为常见, 间或见于皮肤, 症状轻, 病程短, 常自愈; 少数免疫力低下或再吸入大量孢子者, 不 但肺部症状加重, 而且可播散至脑膜、 骨骼和皮肤等处, 愈后不佳, 临床上主要以肺和淋巴结的脓 性肉芽肿为特征。 检验对象 来自流行区的入出境人员, 申请检验的其他人员。 怀疑可能被球孢子菌污染的入出境特殊物品。 国境口岸可疑球孢子菌病人和球孢子菌感染者的尸体等。 犛 犖犜 检验程序 标本的采集、 运送 来自球孢子菌病流行区的人员、 申请检验的其他人员以及国境口岸可疑球孢子菌病人, 采血液、 尿液、 胸腔积液、 新鲜痰液、 脑脊液或皮肤碎片等。 怀疑死于球孢子菌感染的尸体, 采胸腔积液、 肺组织、 脑和神经等组织。 怀疑可能被球孢子菌污染的入出境特殊物品的采集按照 规定进行。 标本或活菌培养物运输应按国际民用航空组织 中类传染性物质的要求。 实验室生物安全及消毒措施 实验室生物安全符合 的规定。 直接镜检涂片制作及染色、 样本前期处理均应在级生物安全柜内进行。标本检测, 包括 样本的病原菌直接镜检、 酶联免疫吸附试验( ) 、 实时荧光定量 检测等初步检测, 在生物安全 二级( ) 实验室进行。大量活菌操作, 在生物安全三级( ) 实验室进行。 实验完毕后所有可用高压消毒的物品均应在实验室内进行高压消毒; 不能用高压消毒的物品及 实验台面和污染的设备表面用有效的消毒剂消毒; 实验室用紫外灯消毒。 实验室仪器设备 实验室设备配置根据不同检验方法来选择, 见附录、 附录、 附录、 附录。 实验室检测方法 病原学检验 直接涂片检查见附录; 分离培养、 血清学鉴定见附录。 免疫学检验 见附录。 核酸检测 实时荧光定量 检测球孢子菌核酸方法见附录。 结果判定和报告 样本的直接镜检观察到酵母样细胞或菌丝, 报告需描述观察所见结果, 如“ 样本荧光白染色可见酵 母样细胞, 有内生球体” 、 “ 样本荧光白染色可见酵母样细胞, 未见内生球体” 、 “ 样本荧光白染色可见菌丝 样细胞” 。直接镜检未观察到酵母样细胞或菌丝, 应报告“ 样本荧光白染色未见酵母样细胞或菌丝样 细胞” 。 分离培养阳性, 且至少与抗 、 抗 、 抗血清中的一种凝集( 、为球孢菌特异菌表面 抗原物质) , 报告“ 检出球孢子菌” ; 分离培养阳性, 且与抗 、 抗、 抗血清均未凝集, 报告“ 检出双 相型真菌( 非球孢子菌) ” ; 分离培养八周无菌落生长为阴性, 报告“ 培养八周未见菌落生长” 。 用 方法从样本中检测到球孢子菌 或 抗体, 判定为球孢子菌 或 结果阳性。报告为“ 样本 法检测球孢子菌 阳性, 阳性” 或“ 样本 法检测球孢子菌 犛 犖犜 阳性, 阴性” 或“ 样本 法检测球孢子菌 阴性, 阳性” 。如果两者均未检测到, 则 报告“ 样本 法检测球孢子菌 阴性, 阴性” 。 样本用 检测到球孢子菌基因, 判定为球孢子菌 检测结果阳性, 报告为“ 样本经实时荧光 定量 检测, 检出特异球孢子菌核酸片段” 。如果用 未检测到球孢子菌基因, 判定为球孢子菌 检测结果阴性, 报告为“ 样本经实时荧光定量 检测, 未检出特异球孢子菌核酸片段” 。 阳性结果的处置: 对检测阳性标本应送上一级实验室( 或指定的实验室) 做复检或鉴定。阳性结果 应按规定向上级主管部门报告。 犛 犖犜 附 录 犃 ( 规范性附录) 球孢子菌直接镜检方法 犃 材料准备 犃 仪器设备 犃 离心机。 犃 级生物安全柜。 犃 荧光显微镜。 犃 试剂 犃 氢氧化钾 犃 荧光白溶液 荧光白 偶氮蓝 蒸馏水 犃 应用液 氢氧化钾 荧光白溶液 犃 直接镜检方法 样本的直接镜检可以对球孢子菌的诊断提供快速的检测。取 新鲜痰液、 脑脊液、 尿液于载玻 片上, 滴加 应用液染色 ; 皮肤碎片、 组织涂片和类似标本 于载玻片上, 滴加 应用液染色 , 加上盖玻片, 用荧光显微镜放大 倍 倍进行观察, 观察是否存在酵母样细 胞或菌丝。 球孢子菌的成熟球体是厚壁, 一般直径 , 大的球体直径可达 , 内生孢子 ( ) 在压碎的球体中能够观察到; 未成熟或小的球体( 直径 ) 缺乏内生孢子, 成 熟球体破裂释放内生孢子。菌丝可在胸腔积液、 脑脊液等中观察到。 犃 结果判定 样本直接镜检观察到酵母样细胞或菌丝, 报告需描述观察所见结果, 如“ 样本荧光白染色可见酵母 样细胞, 有内生球体” 、 “ 样本荧光白染色可见酵母样细胞, 未见内生球体” 、 “ 样本荧光白染色可见菌丝样 细胞” 。直接镜检未观察到酵母样细胞或菌丝, 应报告“ 样本荧光白染色未见酵母样细胞或菌丝样 细胞” 。 犛 犖犜 附 录 犅 ( 规范性附录) 球孢子菌的分离培养 犅 材料准备 犅 仪器设备 犅 恒温培养箱( 和 ) 。 犅 显微镜。 犅 高压灭菌器。 犅 普通冰箱() 。 犅 离心机。 犅 全排式生物安全柜。 犅 水浴锅。 犅 无菌试管( , ) 。 犅 无菌培养皿( 直径 ) 。 犅 玻璃器皿、 接种工具。 犅 试剂 犅 沙氏琼脂培养基(犛 犇 犃) 犅 组成 葡萄糖 蛋白胨 琼脂 蒸馏水 犅 制法 各组分混合后 灭菌, 冷却至 左右加入庆大霉素 、 放线菌酮 , 混 匀, 分装试管( ) , 每管加培养基 , 置斜面; 倾注平板, 每皿 。冷却后备用。 犅 脑心浸汁培养基(犅 犎 犾 ) 犅 组成 脑心浸膏 琼脂 蒸馏水 犅 制法 各组分混合后, 灭菌后冷却至 左右, 分装试管( ) , 每管加 培养基 , 置斜面, 冷却后备用。不加琼脂为液体培养基。倾注平板, 每皿 。冷却后备用。 犛 犖犜 犅 氯化钠溶液 犅 组成 氯化钠 蒸馏水 犅 制法 各组分混合后, 灭菌后冷却至 左右, 分装试管( ) , 每 管加溶液, 冷却后备用。 犅 抗犎 犛血清、 抗犉血清、 抗犎 犔血清( 犎 犛、犎 犔、犉为球孢菌特异菌表面抗原物质) 由有资质的机构提供。 犅 分离培养 犅 分离接种 取 血液 犵离心 后, 分别取 中间层划线接种沙氏琼脂培养基( ) 斜面和 平板各一个; 另分别取 中间层划线接种脑心浸汁培养基( ) 斜面和平板各一个。 尿液、 胸腔积液、 新鲜痰液或脑脊液等其他标本直接分别取 划线接种沙氏琼脂培养基( ) 斜面和平板各一个; 另分别取 划线接种脑心浸汁培养基( ) 斜面和平板各一个。 犅 沙氏琼脂培养基( 犛 犇 犃) 培养 接种了样本的沙氏琼脂培养基( ) 斜面和平板, 置于恒温培养箱 培养, 观察是否有 呈霉菌相特征菌落生长。球孢子菌菌落生长慢, 一周内形成具有分生节孢子的有隔菌丝和透明的具丛 卷毛状的菌落, 菌落的色泽和质地多样性, 颜色由浅黄到黄到灰色, 质地卷毛状到粉状, 分离出单菌落后 作血清学鉴定。球孢子菌的分生孢子初期生长在菌丝的侧枝上, 呈厚壁的琵琶桶状, 约( ) () 。两个孢子之间有空的间隔的薄壁细胞。阴性培养观察八周。 犅 脑心浸汁培养基(犅 犎 犐 ) 培养 接种了样本的脑心浸汁培养基( ) 斜面和平板, 置于恒温培养箱 培养, 观察是否有 呈酵母相特征菌落生长。约四周可见直径的圆形、 隆起、 光滑、 湿润、 乳酪样酵母菌落, 分 离出单菌落后作血清学鉴定。镜下球孢子菌的形态特征与直接涂片镜检相同。阴性培养观察八周。 犅 血清学鉴定 用接种环挑取单菌落, 置于装有 的氯化钠溶液的试管( ) 制成菌悬液。用 蜡笔在一张玻片上划出三个间隔和一个对照间隔。在每个间隔内各滴加一滴菌悬液, 并分别滴加一滴 相当的抗 血清、 抗血清、 抗血清。在对照间隔内加一滴氯化钠溶液。轻微倾斜玻片, 使 各成分相混合, 再前后倾动玻片 。阳性凝集反应可以立即观察到。 犅 结果判定 分离培养出双相型真菌, 且符合 和 的菌落特征及镜下形态特征为阳性。分离培养阳 性, 且至少与抗 、 抗、 抗血清中的一种凝集的, 报告“ 检出球孢子菌” ; 分离培养阳性, 且与抗 、 抗、 抗血清均未凝集, 报告“ 检出双相型真菌( 非球孢子菌) ” ; 分离培养八周无菌落生长为阴 性, 报告“ 培养八周末见菌落生长” 。 犛 犖犜 附 录 犆 ( 规范性附录) 犈 犔 犐 犛 犃法检测抗球孢子菌犐 犵 犕或犐 犵 犌 犆 材料准备 犆 仪器设备 犆 酶标仪( 带 波长) 。 犆 洗板机。 犆 普通冰箱() 。 犆 计。 犆 可调移液器( , ) 。 犆 试剂 犆 包被稀释液( 碳酸钠碳酸氢钠缓冲液, ) : 碳酸钠 碳酸氢钠 叠氮钠 双蒸水 , 调 。 犆 封闭液(小牛血清 溶液) : 小牛血清 ( ) 。 犆 冼涤液( , ) : 氯化钠 磷酸二氢钾 十二水磷酸氢二钠 氯化钾 硫柳汞 吐温 双蒸水 , 调 。 犆 样本稀释液( , ) : 氯化钠 磷酸二氢钾 十二水磷酸氢二钠 氯化钾 硫柳汞 双蒸水 , 调 。 犆 显色液( 过氧化氢尿素溶液) : 犆 底物液(、 、 四甲基联苯胺, ) : 犛 犖犜 无水乙醇 双蒸水至 犆 底物液缓冲液( 柠檬酸 磷酸氢二钠缓冲液, ) : 磷酸氢二钠 柠檬酸 过氧化氢尿素 三蒸水 , 调 犆 将底物液和底物液按混合即成显色液( 过氧化氢尿素应用液) 。 犆 终止液( 硫酸溶液) : 双蒸水 , 浓硫酸 ( 缓慢滴加并不断搅拌) , 加双蒸水至 。 犆 羊抗人 或羊抗人 , 由有资质的机构提供。 犆 标记的球孢子菌( ) 单克隆抗体, 由有资质的机构提供。 犆 标准抗原, 由有资质的机构提供。 犆 标准阳性血清, 由有资质的机构提供。 犆 标准阴性血清, 由有资质的机构提供。 犆 犈 犔 犾 犛 犃检测犐 犵 犕或犐 犵 犌 犆 羊抗人 或羊抗人 用包被稀释液稀释至要求浓度( ) , 在 孔酶标板上加入 孔,包被过夜。包被好的酶标板于保存, 内稳定有效。 犆 倾去酶标板中溶液, 用洗涤液洗板, 孔 孔, 洗次次。 犆 加入封闭液, 封闭。 犆 重复步骤 。 犆 待检血清、 标准阳性血清和 标准阴性血清用样本稀释液稀释至 , 待检脑脊液稀释 至后, 孔, 孵育。 犆 重复步骤 。 犆 加入用样本稀释液稀释好的 标准抗原, 孔,过夜。 犆 重复步骤 。 犆 加入用样本稀释液稀释好的 标记的 单克隆抗体, 孔, 孵育。 犆 重复步骤 。 犆 每孔加入显色液 , 显色 。 犆 每孔加入终止液 终止反应。 犆 在 内用酶标仪在 波长测量每孔的 值。 犆 结果判定 犆 阳性血清 值与阴性血清 值的比值大于或等于 , 试验成功, 试验结果成立的条件下 方能判定样品的结果, 否则, 试验结果不成功, 查找原因, 并重做试验。 犆 待检样品的 值与阴性血清 值的比值 , 判定为 或 捕捉 阳性。 犆 待检样品的 值与阴性血清 值的比值 , 判定为 或 捕捉 阴性。 犆 待检样品的 值与阴性血清 值的比值在 , 判定为 或 捕捉 弱阳性。 犆 说明 可采用等效的 或 捕捉 试剂盒进行检测, 其操作和结果判定根据试剂盒的说明书 进行。 犛 犖犜 附 录 犇 ( 规范性附录) 实时荧光定量犘 犆 犚检测球孢子菌核酸 犇 材料准备 犇 仪器设备 犇 离心机。 犇 研磨器或研钵。 犇 恒温混合器。 犇 实时荧光定量 检测仪。 犇 可调移液器( , ) 。 犇 引物和探针 犇 基因扩增引物 上游引物: 下游引物: 犇 探针 ( 标记 ) ( 标记 ) 犇 试剂 犇 提取试剂( ) 。 试剂盒组分 磁珠 裂解液 磁珠结合液 洗液一 洗液二 洗液三 洗脱液 犇 缓冲液 ( ) 犇 蛋白酶配制浓度 。 犇 ( ) 。 ) 是由德国( ) 公司提供的产品的商品名。给出这一信息是为了方便本标 准的使用者, 并不表示对这一产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果, 则可使用这些等效的产品。 犛 犖犜 犇 球孢子菌( ) 阳性对照样本与 阴性对照样本, 由有资质的机构提供。 犇 实时荧光定量 核心混合液 缓冲液 上游引物下游引物各 探针混合液 氯化镁 犜 犪 狇 聚合酶 加至 犇 样品预处理 犇 组织样品或可疑固体样品预处理 将组织样品或可疑固体样品用研磨器或研钵磨碎后, 取 组织样品或可疑固体样品于 离心管中, 加入 缓冲液, 蛋白酶, , 将离心管放在混合器振荡 后置于 中 。将消化后的样品以 犵离心 , 吸取上清液并转移至其他离心管 中备用。 犇 血清、 血液、 胸腔积液等液体样品预处理 取 血清、 血液或胸腔积液等液体样品于 离心管中, 加入 蛋白酶, 充分混 匀后置于 中 , 再置于 中 , 犵离心 后将上清液转移至其他离心管中 备用。 犇 模板犇 犖 犃提纯 犇 取 预处理后的样品、 阳性对照样品或 阴性样品到 离心管中, 加入 裂解液( ) , 旋涡振荡 。 犇 加入 磁珠( ) 和 磁珠结合液( ) 。室温下, 用移液器反复吹打或用旋 涡混合器充分混匀, 使磁珠始终保持悬浮状态 。 犇 将离心管放置于磁力架上, 待磁珠完全吸附于离心管底部后弃去上清液。 犇 从磁力架上取下离心管, 往离心管中加入 洗涤液一( ) , 剧烈振荡, 待磁珠在洗涤 液中完全分散均匀后将离心管放置于磁力架上, 待磁珠完全吸附于离心管底部后弃去上清液。 犇 从磁力架上取下离心管, 往离心管中加入 洗涤液二( ) , 剧烈振荡, 待磁珠在洗涤 液中完全分散均匀后将离心管放置于磁力架上, 待磁珠完全吸附于离心管底部后弃

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