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中药化学成分的一般研究方法 Research Methods for Chemistry of TCM,赵钟祥,,2,第一节、中药成分及生物合成简介 第二节、提取分离方法 第三节、化学结构研究方法,中药化学成分的一般研究方法,3,第一节、中药成分及生物合成简介,一、成分类型简介,糖类,苷类,醌类,苯丙素类,黄酮类,萜类和挥发油,三萜类,生物碱,甾体类,鞣质类,中药化学成分,4,1. 糖类 (sugars),中药中普遍存在,为多羟基醛或多羟基酮及其缩聚物,可分为单糖、低聚糖、多聚糖;,5,2. 苷类 (glycosides),糖或糖的衍生物与非糖通过糖的端基碳原子连接而成的化合物。,6,苷类 (glycosides),7,3. 醌类化合物 (quinoids),一类分子中具有醌式结构的化合物。分子中多有酚羟基,有一定的酸性。,8,醌类化合物,9,4. 苯丙素类(phenylpropanoids),是一类分子中以苯丙基为基本骨架的化合物。其中香豆素和木脂素为典型化合物。,10,苯丙素类,11,5. 黄酮类( flavonoids ),泛指两个苯环通过三个C原子互相连接而成的一系列化合物。 C6-C3-C6,12,黄酮类,C6-C3-C6,C6-C3-C6,13,6. 萜类和挥发油,凡由甲戊二羟酸衍生、具有基本母核的分子式符合(C5H8)n通式的衍生物为萜类化合物,(1) 萜类( terpenoids ),14,萜 类,15,挥发油又称精油,是一类可随水蒸气蒸馏而蒸馏、与水不相混溶的油状液体物质。,(2) 挥发油( essential oils ),16,7. 三萜类(triterpenoids),是一类基本骨架由30个碳原子组成的萜类化合物。,17,三萜类,18,8. 甾体类( steroides ),是一类具有环戊烷骈多氢菲的甾体母核的化合物。,19,甾体类,20,9. 生物碱( alkaloids),是一类存在于生物体类含氮的有机物,具有碱的性质,能与酸成盐。,21,生物碱,22,10. 鞣质( tannins),又称单宁或鞣酸,是一类复杂的多元酚类化合物的总称,可与蛋白质结合形成致密、柔韧、不易腐败又难于透水的化合物。,23,鞣 质,老鹳草素 (geraniin),24,11. 其它成分,有机酸 氨基酸和蛋白质 有机含硫化合物 矿物质,25,biosynthesis pathway,二、主要的生物合成途径,中药化学成分属天然有机化合物,类型众多、结构复杂、数目庞大,结构间存在着一定联系,26,有一定的规律可寻,许多化合物在分子结构中都含有某些基本组成单位。,苯丙素类 具有C6-C3单位,萜类 具有重复C5单位,生物碱 具有氨基酸单位,脂肪酸、酚类、醌及聚酮类具有C2单位,27,代谢产物的分类,按生物合成途径可分为一次代谢产物和二次代谢产物,一次代谢产物叶绿素、糖类、蛋白质、脂类和核酸等,二次代谢产物生物碱、黄酮、萜类皂苷等。,28,二次代谢产物,二次代谢产物往往反应了植物科、属、种的特征,且大多数具有特殊显著的生理活性。,生物合成途径是指二次代谢产物的生物合成途径。,29,研究生物合成的意义,指导中药化学成分结构分类,帮助推测中药化学成分结构,对仿生合成和植物化学分类学提供理论指导。,30,主要生物合成途径,(一)乙酸丙二酸途径,(二)甲戊二羟酸途径,(三)莽草酸途径,(四)氨基酸途径,(五)复合途径,31,(一)乙酸-丙二酸途径 acetate-malonate pathway, (AA-MA),1. 脂肪酸,2. 酚类,3. 醌类,32,1. 脂肪酸,33,2. 酚类,34,3. 醌类,35,(二)甲戊二羟酸途径 mevalonic acid pathway, (MVA),萜类、三萜类、甾体类的生物合成途径,36,甲戊二羟酸途径,37,甲戊二羟酸途径,38,(三)莽草酸途径 skikimic acid pathway,具有C6-C3(苯丙素类)及C6-C1基本结构的化合物,又叫桂皮酸途径(cinnamic acid pathway),39,莽草酸途径,葡萄糖代谢,莽草酸,桂皮酸途径,苯丙氨酸或酪氨酸,咖啡酸,对羟基桂皮酸,对羟基桂皮酸苷,40,木脂素,香豆素类,倍半木脂素,木质素,烯丙基,丙稀基,新木脂素,邻羟基桂皮酸苷,苯丙烯类,阿魏酸,咖啡酸,对羟基桂皮酸,对羟基桂皮酸苷,松柏醇,伞形花内酯,41,(四)氨基酸途径 amino acid pathway,鸟氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸都是合成生物碱的重要前体。,大多数生物碱由此途径合成。,42,氨基酸途径,43,氨基酸途径,44,(五)复合途径 complex pathway,如查耳酮、二氢黄酮类化合物由莽草酸途径和乙酸丙二酸途径合成。,分子中各个部位由不同的生物合成途径产生。,45,复合途径,46,第二节、提取分离方法,一、提取方法,溶剂提取法,水蒸汽蒸馏法,超临界流体萃取法,其它方法,提取方法,煎煮法,浸渍法,渗漉法,回流提取法,连续回流提取法,47,(一)溶剂提取法,应用最普遍的提取方法,根据被提取成分的溶解性能,选用合适的溶剂和方法来提取。,48,提取原理示意图,溶剂,细胞,有效成分,49,按极性分类可分为三类,1、溶剂分类, 亲水性:如甲醇、乙醇、丙酮, 亲脂性:石油醚、饱和烷烃, 水,50,常见溶剂极性顺序,石油醚 四氯化碳 苯 氯仿 乙醚 乙酸乙酯 正丁醇 丙酮 乙醇 甲醇 水,51,2.溶剂的选择,有效成分溶解性大,无效成分溶解性小,与植物成分不起化学反应; 安全无毒 沸点低,易回收,成本低;,理想溶剂:,52, 能团极性: RCOOH Ar-OH H2O R-OH R-NH2 RCONH2 RCHO RCOOR R-OR R-X R-H 官能团相同,极性官能团数目多,极性大。 介电常数越大,极性越强。,化合物极性强弱比较,53,3. 提取方法, 浸渍法: 药材+溶剂 浸泡 提取物,a. 冷提法:, 渗漉法:药材粉碎后,加入渗漉桶中,54,渗漉法装置示意图,55,提取方法, 煎煮法:水加热煮沸提取,b. 热提法, 回流提取法:有机溶剂提取, 连续回流提取法,56,连续回流提取法,1. 冷凝管 2. 溶剂蒸气上升管 3. 虹吸管 4. 装有药粉的滤纸袋 5. 溶剂 6. 水浴,索氏提取器,57,(二)水蒸气蒸馏法,用于提取能随水蒸汽蒸馏、对热稳定、难溶于水的成分。,挥发油多用此法,58,挥发油提取装置图示,59,挥发油提取装置图,60,(三)超临界流体萃取法 Supercritical fluid extraction-SFE,是一种集提取和分离一体,又基本上不用有机溶剂的新技术。,超临界流体:是处于临界温度和临界压力以上,介于气体和液体之间的流体,61,Phase diagram of CO2,62,超临界流体的性质,密度与液体相似、粘度与气体相近,扩散系数比液体大100倍。,物质的溶解与溶剂的密度、扩散系数成正比,与粘度成反比。,63,CO2 supercritical fluid extraction process,64,SFE的优缺点,接近室温下提取,防止氧化热解 几乎不用到有机溶剂,无有机溶剂残留,对环境无公害 效率高,节约能耗 工艺技术要求高, 投资比较大,65,(四)其它方法,升华法:气态 固态,樟木中樟脑的提取。,超声提取法,66,超声提取法,其基本原理是利用超声波的空化作用,破坏植物药材的细胞,使溶剂易于渗入细胞内 同时超声波的许多次级作用,如机械运动、乳化、扩散、击碎、化学效应等也能加速细胞内有效成分的扩散、释放和溶解,促进提取的快速进行。,67,超声提取法的特点,具有以下优点 适用于各种溶剂 提取速度快 方法简单 产率高 无需加热 超声提取对一些遇热不稳定成分的提取尤为适宜。,68,第一节、中药成分及生物合成简介 第二节、提取分离方法 第三节、化学结构研究方法,中药化学成分的一般研究方法,69,第二节、提取分离方法,二、分离精制方法,溶剂法,沉淀法,分馏法,膜分离法,分离方法,升华法,结晶法,色谱法,70,(一)溶剂法,1、酸碱溶剂法,对于难溶于水的有机碱类成分,与酸成盐后,可溶于水。如生物碱。,利用混合物中各组分酸碱性的不同进行分离。,71,酸碱溶剂法,对于具有羧基或酚羟基的酸性成分,难溶于酸水,与碱成盐后,可溶于水。,对于具内酯或内酰胺结构的成分,可被皂化而溶于水。,72,酸碱溶剂法操作图示,生物碱,有 机 层,酸 水 层,酸,+ ,生物碱盐,73,2. 溶剂分配法,利用各组分在两相中分配系数的不同而达到分离的方法。,两相往往是互相饱和的水相与有机相,74,溶剂分配法,混合物在两相中的分配系数越大,则分离效果越高。,分配系数:K=C上/C下 分离因子:= KA/KB( KA KB),表示分离难易,75,溶剂分配法,常用的两相有,极性大的成分:正丁醇水,极性中等成分:乙酸乙酯水,极性小等成分:氯仿水,76,(二)沉淀法,有些化学成分能与某些试剂生成沉淀,或加入某些试剂后可降低某些成分在溶液中的溶解度而自溶液中析出。,这种沉淀反应必须是可逆的,77,1.专属试剂沉淀法,雷氏铵盐能与季铵碱生成沉淀,某些试剂能选择性地沉淀某类成分,称专属性沉淀法。,胆甾醇能与甾体皂苷沉淀,明胶能与鞣质生成沉淀,可用于分离和出去鞣质。,78,2. 分级沉淀法,在混合组分的溶液中加入与该溶液能互溶的溶剂,改变混合组分溶液中某些成分的溶解度,使其从溶液中析出。,改变加入溶剂的极性或数量而使沉淀逐步析出称为分级沉淀。,79,分级沉淀法,含有糖类或蛋白质的水溶液中,分次加入乙醇,使含醇量逐步增高,可逐级沉淀出分子量段由大到小的蛋白质、多糖、多肽等等。,含有皂苷的乙醇溶液中分次加入乙醚或乙醚丙酮,可使有极性差异的皂苷分级沉淀出来。,80,3.盐析法,在混合物水溶液中加入易溶于水的无机盐至一定浓度或饱和状态,使某些成分在水中的溶解度降低而析出来,或用有机溶剂萃取出来。 最常用的是氯化钠,81,盐析法,例如从黄连中分离小檗碱,又如麻黄碱、苦参碱等水溶性较大,分离时也常采用盐析的方法。,盐析是分离蛋白质时常采用的方法之一。,82,(三)分馏法,利用混合物中各成分沸点的不同而进行分离的方法。,适用于液体混合物的分离。,可分为常压蒸馏、减压蒸馏、分子蒸馏等。,83,简单分馏装置,1. 温度计 2. 分馏柱 3. 烧瓶,84,(四)膜分离法,利用人工合成的高分子膜,以外加压力或化学位差为推动力,对混合物溶液中各成分进行分离、分级、提纯或富集。,反渗透、超滤、微滤、电渗析为四大已开发应用的膜分离技术。,85,膜分离法,反渗透、超滤、微滤相当于过滤技术。 溶剂、小分子能透过膜,而大分子被截留。,86,(五)升华法,固体物质加热直接变成气体,遇冷又凝结为固体的现象为升华。,如樟木中的樟脑,是世界上最早应用升华法制取的有效成分。,茶叶中的咖啡碱加热到178就能升华而不被分解。,87,升华法,升华法虽简单易行 但药材炭化后,往往产生挥发性的焦油状物,粘附在升华物上,不易精制除去 并且升华不完全,产率低,有时还伴有分解现象,因此较少采用。,88,(六)结晶法,化合物由非晶形成有晶形的过程称为结晶。,结晶法是纯化物质最后阶段常采用的方法,其目的是进一步分离纯化。,89,结晶法,结晶法的关键是选择适宜的溶剂。,对结晶溶剂的要求:,对待结晶的成分溶解度随温度不同有显著差异。,与被结晶的成分不应产生化学反应。,沸点适中。,90,结晶法,甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、乙酸、吡啶等。,常用的结晶溶剂,单一溶剂不能达到结晶时,可用两种或两种以上溶剂组成的混合溶剂进行结晶。,91,(七)色谱法,色谱法是中药化学成分分离中最常用的方法。,最大的优点在于,通过选用不同分离原理、不同操作方式、不同色谱材料或将各种色谱组合应用,达到对化学成分的分离和精制。,92,色谱Flash动画,93,柱色谱视频,94,色谱法分类,吸附色谱 分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱,根据分离原理可分为:,95,色谱法分类,薄层色谱法 (thin layer chromatography,TLC) 柱色谱法 (column chromatography) 纸色谱法 (paper chromatography,PC) 高效液相色谱法 (HPLC) 气相色谱法 (GC),根据分离方法可分为:,96,1. 吸附色谱法,吸附色谱是利用吸附剂对被分离化合物分子的吸附能力的差异,而实现分离的一类色谱。,常用的吸附剂有硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺等。,97,吸附力的分类,物理吸附:无选择性,吸附与解吸可逆,如硅胶、氧化铝、活性炭吸附。 化学吸附: 有选择性,吸附牢固。 半化学吸附:介于上述二者之间, 如聚酰胺。,98,吸附力的特点,吸附剂活性,吸附力三要素,溶质极性,溶剂极性,物理吸附:相似者易于吸附,99,吸附剂的特点,硅胶、氧化铝为极性吸附剂 溶质极性大,吸附力强 溶剂极性大,洗脱力强,活性炭为非极性吸附剂,与此相反,100,硅胶吸附色谱,应用最为广泛的吸附色谱,大多数成分都可用它来分离。,硅胶是极性吸附剂,适合分离极性相对较小的成分,用有机溶剂系统洗脱。,101,硅 胶 的 结 构,102,硅 胶 的 结 构,103,硅胶吸附色谱,实际应用中有柱色谱和薄层色谱两种。,104,TLC,105,氧化铝吸附色谱,应用范围有一定的限制,主要用于碱性或中性亲脂性成分的分离。,如可用于生物碱、甾体、萜类成分的分离。,尤其不适合含有酚羟基化合物的分离。,106,聚酰胺吸附色谱,利用氢键缔合分离,属于半化学吸附。,固定相,流动相,107,2. 凝胶过滤色谱,原理主要是分子筛作用,根据凝胶的孔径和被分离化合物的分子大小而达到分离目的。,凝胶是具有多孔隙网状结构的固体物质,当混合物溶液通过凝胶柱时,比凝胶孔隙小的分子可以自由进入凝胶内部。,108,凝胶过滤色谱,109,凝胶过滤色谱,商品凝胶的种类很多,常用的是葡聚糖凝胶,羟丙基葡聚糖凝胶,葡聚糖凝胶(sephadex G)是由葡聚糖(右旋糖酐)和甘油基通过醚桥相交联而成的多孔网状结构,亲水性,只适合在水中使用。,110,Sephadex G,凝胶颗粒网孔的大小取决于所用交联剂的数量和反应条件。,加入的交联剂越多,网孔越紧密,孔径越小,吸水膨胀也越小。,Sephadex G-75,含义此干凝胶吸水量为7.5mL/g。,111,Sephadex LH-20,既有亲水性又有亲脂性 既可在水性溶剂系统中使用,又可在亲脂有机溶剂系统中使用。,羟丙基葡聚糖凝胶,是在sephadex G-25的羟基上引入羟丙基而成醚状结合态。,112,Partial structure of Sephadex LH-20,The gel is based on hydroxypropylated dextran which has been crosslinked to yield a polysaccharide network.,113,Sephadex LH-20,与sephadex G相比引入羟丙基后分子中羟基的总数不变,但碳原子所占的比例相对增加,因此使用范围扩大。,含水系统:甲醇水 有机系统:氯仿甲醇,114,Sephadex LH-20使用小结,使用含水溶剂系统时主要为分子筛作用。,具有双重色谱性能,主要原理为分子筛作用。,使用有机溶剂系统洗时,还有吸附作用,极性相对较小的化合物先被洗脱下来。,115,3. 离子交换色谱 (ion exchange chromatography),离子交换色谱主要是基于混合物中各成分解离度差异进行分离。,有离子交换树脂、离子交换纤维素和离子交换凝胶三种。,116,离子交换树脂结构,117,离子交换树脂,离子交换树脂对交换化合物的能力强弱,主要取决于化合物解离度大小,带电荷多少等因素。,化合物解离度大易交换在树脂上,相对难洗脱,因此解离度小的化合物先被洗脱下来。,118,离子交换色谱 flash动画,119,离子交换纤维素和凝胶,是在纤维素或葡聚糖等大分子的羟基上,通过化学反应引入能释放离子的基团所形成。,二乙氨基纤维素 (DEAE-cellulose) 羧甲基纤维素 (CM-cellulose) 二乙氨基葡聚糖凝胶 (DEAE-sephadex) 羧甲基纤维素 (CM-sephadex),120,离子交换纤维素和凝胶,它们既有离子交换性质,又有分子筛作用,对水溶性成分的分离十分有效,主要用于分离纯化如蛋白质、多糖、生物碱和其它水溶性成分。,121,4. 大孔树脂色谱,大孔树脂是一类没有可解离基团,具有多孔结构,不溶于水的固体高分子物质。,通过吸附(范德华力及氢键)与分子筛(多孔结构)作用,macro-reticular resine,122,大孔树脂色谱,大孔树脂的色谱行为具有反相的性质。,被分离物质的极性越大,其Rf值越大,反之Rf值越小。,对洗脱剂而言,极性大的溶剂洗脱能力弱,而极性小的溶剂洗脱能力强。,123,大孔树脂色谱,根据骨架材料是否带功能基团,大孔吸附树脂可分为非极性、中等极性与极性三类。,124,大孔树脂色谱,大孔树脂常应用于中药有效成分富集,具有选择性好、机械强度高、再生处理方便、吸附速度快。,一般水煎法收率30%,水醇法15%,大孔树脂法收率5%。,125,常用的大孔树脂,Amberlite系列(美国); Diaion系列(日本); GDX系列(天津试剂二厂); AB-8、X-5(南开大学化工厂);,126,大孔树脂分离操作过程,人参提取液,通过树脂柱,水洗树脂,70%乙醇洗脱,乙醇洗脱液,人参总皂苷粗品,127,5. 分配色谱,利用被分离成分在固定相和流动相之间的分配系数的不同而达到分离。,按照固定相与流动相的极性差别,分配色谱有正相与反相分配色谱法之分。,128,正相分配色谱,固定相流动相极性,常用的固定相有氰基与氨基键合相,洗脱剂用亲脂性有机溶剂系统。,129,反相分配色谱,固定相 流动相极性,常用的固定相有:,C8键合相,十八烷基硅胶(ODS, octadecane silica),流动相常用甲醇-水,乙腈-水。,反相色谱是应用最广的色谱法。,130,反相硅胶化学结构,131,反相分配色谱的特点,反相色谱是应用最广的色谱法,键合相表面官能团不会流失 流动相的极性可在很大范围内调整 可重复使用多次,重现性好,132,分配色谱的分类,(1)纸色谱法 (2)分配薄层色谱法 (3)分配柱色谱法,按操作方法可分为:,133,纸色谱法,纸色谱法属分配色谱,具有双重色谱性能,使用亲脂性有机溶剂洗脱时为正相分配色谱 使用含水溶剂系统洗脱时为反相分配色谱,134,将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等多孔载体上,作为固定相,填充于色谱柱中,用流动相洗柱。,液-液分配柱色谱:,135,6. 其它色谱分离方法,DCCC (液滴逆流色谱)和HSCCC (高速逆流色谱法),可使流动相呈液滴形式在固定相间交换,分离效果好。 多用于分离皂苷、蛋白质、糖类等。,136,DCCC 装置图示,Droplet Counter Current Chromatography,137,7. 色谱技术进展,(1)制备薄层技术,(2)加压液相柱色谱技术,138,(2)加压液相柱色谱技术,多用反相色谱柱 所用载体是颗粒直径小、机械强度高、比表面积大的球形硅胶,其上键有不同极性的有机化合物以适应不同类型的分离工作。,139,加压液相柱色谱技术,根据液相色谱所用压力大小的不同,可分为:,高效液相色谱(HPLC, 20个大气压),中压液相色谱(MPLC, 520个大气压),低压液相色谱(LPLC, 5个大气压),140, 高效液相色谱(HPLC),high performance liquid chromatography,是在经典的液相色谱基础上发展起来的一种快速分离分析新技术。 采用了高效填充剂,利用加压手段加快流动相流速的一种高效能液相色谱法。,141,高效液相色谱(HPLC),按分离原理可分为: 吸附色谱、 分配色谱、 离子交换色谱 凝胶色谱等 其中液液分配色谱应用最广泛。 根据固定相与流动相极性的差别,亦分为: 正相分配色谱 反相分配色谱,142,HPLC System for Analysis,143,HPLC System for Purification,144,1.7 m BEH UPLC 顆粒 1.8 m HSS UPLC 顆粒,与传统的HPLC相比,UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。,1mL/min流速时的耐压可达15000psi,超高效液相色谱,(Ultra Performance Liquid Chromatography,UPLC),145,146,BEH颗粒 1.7 m 乙烯架桥杂化颗粒(Ethylene Bridged Hybrid,简称BEH) HSS颗粒 1.8 m 高强度二氧化硅(HSS)颗粒。,Waters UPLC颗粒,147,HPLC,Waters,Agilent,DIONEX,Shimadzu,148,HPLC Column,149,HPLC Column-两大类,150,HPLC的优点,高效液相色谱法分离速度快、效率高、试样分析重现性好,而且试样不需气化,只需制成溶液,即可在室温下进样分析。 此法应用范围极广,对挥发性差或遇热不稳定的成分及某些高分子化合物的分离极为有利。,151,第一节、中药成分及生物合成简介 第二节、提取分离方法 第三节、化学结构研究方法,中药化学成分的一般研究方法,152,第三节、化学结构研究方法,阐明机理,153,化学结构研究程序,化合物纯度,化合物类别,化合物结构,154,1. 物理常数:mp,D 2. TLC(PC):三种展开系统均为单一斑点。 3. HPLC,GC,一、纯度鉴定,155,1. 物理常数测定,化合物物理常数的测定包括熔点、沸点、比旋度、折光率和比重测定等。,熔点:单一纯化合物结晶的溶距常小于2 C。,156,物理常数测定,沸点:液体纯物质应有恒定的沸点,沸程不超过5 C。,折光滤比重:液体纯物质应有恒定的折光滤比重。,比旋度:比旋度反应化合物结构有无手性结构,与立体结构有关。,157,2. TLC(PC),仅采用一种溶剂系统或色谱条件,得到的结论常会出现偏差。,通常三种溶剂系统或色谱条件下,均得到单一斑点可初步说明为单一化合物。,158,3. HPLC,GC,判断纯度时,灵敏度、准确度高于TLC(PC),但也应采用多种色谱条件进行测试。,159,1、文献调研:同种、同属及相近属植物的成分 2、鉴别反应:确定官能团、骨架 3、色谱行为:酸碱性、溶解性等,二、化合物类型的确定,160,1、文献调研,同科同属的植物常含有相同或相似的化合物。,通过对文献中同科同属植物化学成分进行调研,就可以推测研究对象中含有成分的可能类别。,161,鉴别反应主要是利用的化合物的理化性质。,一些类型的中药化学成分具有特征性的鉴别反应。,2、鉴别反应,对化合物进行鉴别反应,就能够推测化合物的骨架类型。,162,蒽醌类成分: 碱液显色反应,检识骨架类型,黄酮类成分:盐酸镁粉反应、 四氢硼钠反应,生物碱类成分:碘化铋钾反应、 碘化汞钾反应,163,某些基团也具有一些特征性的鉴别反应。,鉴别反应,对化合物进行鉴别反应,还能够推测化合物结构中可能含有的基团。,164,酚羟基:三氯化铁反应,检识官能团,亚甲二氧基:Labat反应,不饱和内酯环:异羟肟酸铁反应,苯环酚羟基对位有无取代基:Gibbs反应,165,试验时平行对照 未知样品、空白、典型样品三者平行对照,注意,综合多种试验作出判断 一种检识反应易误判,最好两种以上试验,166,化合物提取、分离、精制过程中获得的化合物的色谱行为也有助于判断化合物的类别。,3、色谱行为,通过色谱行为的观察可获知化合物的溶解性、酸碱性、极性、显色反应方面的信息。,167,例如,有个化合物进行硅胶TLC分析时发现它易溶于乙醚,用氯仿丙酮(8:1)展开时Rf=0.6,UV 365 nm下,检识显蓝色斑点。,该化合物属于哪一类天然产物?,168,(一) 波谱方法 UV、IR、1H-NMR、13C-NMR、MS (二) 化学沟通 化学降解、衍生物制备、人工合成 (三) 立体结构 CD、ORD、2D-NMR、X-射线衍射,三、化合物结构的确定,169,(一) 波谱方法,目前,波谱分析已成为确定中药有效成分化学结构的主要手段 具有灵敏度高、选择性强、试样用量少以及快速、简便的优点,同时准确性也大大提高 波谱的应用已成为广大药学工作者必须掌握的一门技术,170,波谱方法的内在联系,E hv,v c /,光谱中所用的电磁波区域,171,1、UV spectrum,ultra voilet spectroscopy,172,UV spectrum,各种电子跃迁所需能量示意图,173,UV spectrum,一般来说,UV光谱主要用于判断结构中的共轭体系和估计共轭系统中取代基的位置、种类和数目等。,UV是测定含有共轭双键、,-不饱和羰基(醛、酮、酸、酯)结构的化合物及芳香化合物结构的一种重要手段。,174,UV spectrum,在某些场合下,还对测定化合物的精细结构具有一定意义。,如黄酮类化合物,测定其UV光谱时,加入某种诊断试剂后,可因分子中取代基的类型、数目及排列方式不同而发生光谱形状的改变。,175,UV specturm of rutin,176,UV-visible spectrometer,177,2、IR spectrum,infrared absorption spectrum,IR,有机化合物用不同波长的红外线照射,分子吸收红外线后引起化学键的振动或转动能级跃迁而形成的光谱,称为红外吸收光谱。,178,IR spectrometer,179,IR spectrum,测定范围在波数4000500cm-1。,特征基团区40001600cm-1 。,指纹区1000500cm-1 。,180,IR spectrum,1)33003000 弱吸收 烯氢、芳氢、C=N 强吸收 O-H、N-H 2)30002700 饱和C-H 3)24002100 不饱和三键 4)19001650 C=O及其衍生物 5)16801500 C=C及芳香核骨架振动、C=N等 6)15001300 饱和C-H面内弯曲振动 7)1000650 不饱和C-H面外弯曲振动,181,IR光谱显示有羟基(3452 cm-1)、羰基(1734 cm-1)和苯环(1614, 1517, 1458 cm-1),182,IR spectrum,未知化合物:主要用于功能基团的确认,芳环取代类型的确认。,已知化合物: 和已知对照品做一张共红外图谱,如果两者的红外光谱完全一致可推测是同一物质。,183,3、Mass Spectrometry,184,质谱能够提供的信息, 相对分子质量,低分辨质谱就可以确定相对分子质量 高分辨质谱可精确到0.0001;, 分子式(样品的元素组成),用同位素丰度比法(低分辨法)或高分辨质谱仪测得的准确相对分子质量,均可以确定分子式;,185, 人机问答,给出可能的化合物,质谱能够提供的信息, 鉴定某些官能团,如甲基(m/z 15)、羰基(m/z 28)、甲氧基(m/z 31)、乙酰基(m/z 43), 分子结构信息,由分子结构与裂解方式的经验规律,根据碎片离子的m/z及相对丰度RA提供分子结构信息;,186,Mass Spectrometry,Mass Spectrometry is an analytical spectroscopic tool primarily concerned with the separation of molecular (and atomic) species according to their mass Mass Spectrometry has a number of uses for example geologists use it to date rocks, pharmaceutical companies make use of mass spectrometry to determine the structure of novel compounds. Today techniques such as the following are commonly used: GC/MS,GC/MS/MS,LC/MS,FAB, Electrospray MS,MALDI TOF MS,FTMS,ICPMS,187,Development History of MS,188,Ion sources,电子轰击源(Electro-Impact source, EI) 化学电离源(Chemical Ionization,CI) 场致电离源(Field Ionization, FI) 场解吸电离源(Field Desorption, FD) 快原子轰击(Fast atom bombardment, FAB) 基质辅助激光解析电离(matrix-assisted laser desorption-ionization, MALDI),189,Ion sources,液相色谱质谱联机的接口,粒子束(Particle Beam, PB) 热束(Thermo Beam) 大气压电离源(Atmospheric Pressure) 电喷雾电离(Electro Spary Ionization, ESI) 大气压化学电离(Atmospheric Pressure Chemical Ionization, APCI),190,分子离子 碎片离子 基峰 同位素离子 亚稳离子 重排离子,EI质谱中的离子包括,191,HREIMS m/z 502.1854 M+ (calcd for C26H30O10, 502.1839),192,HRESIMS (positive ion mode) m/z 469.1454 M + Na+ (calcd for C23H26O9Na, 469.1475),193,4、NMR spectroscopy,NMR现象的产生,194,NMR现象的产生,195,NMR现象的产生,196,NMR现象的产生,197,从核磁共振的发现到如今,共有13位科学家因对核磁共振做出重要贡献而获得诺贝尔奖: 1944年 I.Rabi 1952年 F.Block 1952年 E.M.Purcell 1955年 W.E.Lamb 1955年 P.Kusch 1964年 C.H.Townes 1966年 A.Kastler 1977年 J.H.Van Vleck 1981年 N.Bloembergen 1983年 H.Taube 1989年 N.F.Ramsey 1991年 R.R.Ernst。 2002年 Kurt Wuthrich,198,核磁波谱仪原理示意图,199,核磁波谱仪,200,Chemical shift,201,Applied Magnetic Filed,Ho,分子内部:电负性、各向异性效应、H键、范德华力等。 做谱溶剂:DMSO-d6; CDCl3; MeOD; pyridine-d5; acetone-d6,影响的因素,202,苯环的电子环流图示,203,各向异性效应,204,(1) 1H-NMR,1H-NMR谱化学位移范围 020 ppm,1H-NMR谱提供的结构信息参数: 化学位移() 耦合常数(J) 质子数,205,206,1H-NMR spectrum,A2B2系统,6.96,3.80, 2.14 2.05 2.01,甲氧基,甲基,端基质子,J =7. 2 Hz, 4.38,J = 8.8 Hz,7.44,207,1H-NMR小结,1. 质子的类型:说明化合物具有哪些种类的含氢官能团。 2. 氢分布:说明各种类型氢的数目。 3. 核间关系:氢核间的偶合关系与氢核所处的化学环境,提供化合物结构信息有:,核间关系: 可提供化合物的连结方式、位置、距离; 结构异构与立体异构(几何异构、光学异构、构象)等)。,208,(2)13C-NMR,13C-NMR谱化学位移范围:0250 ppm,13C-NMR谱提供的结构信息: 碳核的化学位移 异核耦合常数(JCH) 驰豫时间(T1) 其中利用最高的是化学位移( C)。,209,13C-NMR 的特点, 灵敏度低,分辨力高 谱图容易解析 可直接观测不带氢的官能团 常规13C谱不提供积分曲线等定量数据,210,常见的13C-NMR的类别,全氢去偶谱(COM) DEPT谱,211,全氢去偶 (Proton complete decoupling, COM) 宽带去偶 (Broad band decoupling, BBD),所有的13C 信号在图谱上均作为单峰出现,故无法确定其上连接的1H数,对判断13C信号的化学位移十分方便。,全氢去偶谱(COM),212,DEPT法系通过改变照射1H核的脉冲宽度()或设定不同的弛豫时间(delay time),使不同类型的13C信号在谱图上呈单峰并分别呈现正向峰或倒置峰,特点 灵敏度高,信号之间很少重叠,目前已成为13C-NMR谱的一种常规测定方法。,Distortionless enhancement by polarization transfer,DEPT谱,213,13C-NMR,214,26个碳原子,171.0,127.9,102.2,55.2,114.2,215,13C-NMR小结,1. 碳的类型 2. 碳分布 3. 核间关系,主要提供化合物结构信息有:,碳谱的各条谱线一般都有它的惟一性,能够迅速、正确地否定所拟定的错误结构式。 碳谱对立体异构体比较灵敏,能给出细微结构信息。,主要提供化合物的碳“骨架”信息。,216,1H-NMR和13C-NMR对比,氢谱不能测定不含氢的官能团,如羰基、氰基等; 对于含碳较多的有机物,如甾体化合物、萜类化合物等,常因烷氢的化学环境类似,而无法区别,是氢谱的弱点。,碳谱弥补了氢谱的不足,碳谱不但可给出各种含碳官能团的信息,且光谱简单易辨认,对于含碳较多的有机物,有很高的分辨率。 当有机物的分子量小于500时,几乎可分辨每一个碳核,能给出丰富的碳骨架信息。,217,1H-NMR和13C-NMR对比,普通碳谱(COM谱)的峰高,常不与碳数成比例是其缺点 而氢谱峰面积的积分高度与氢数成比例 二者可互为补充。,218,(3)2D-NMR,二维化学位移相关谱(相关谱,correlation spectroscopy, COSY)是2D-COSY谱中最重要、最常用的测试技术。,2D-COSY谱分为同核相关和异核相关谱两种。,219,常用的2D-NMR spectroscopy,(1)1H-1H COSY spectrum,(2) NOESY (ROESY) spectrum,(3) HMQC (HSQC) spectrum,(4)HMBC spectrum,220,(1)1H-1H COSY spectrum,反映同一偶合体系中质子的耦合关系 可以确定质子化学位移以及质子之间的耦合关系和连接关系。,221,1H-1H COSY spectrum,222,(2) NOESY (ROESY) spectrum,NOE是在核磁共振中选择地照射一种质子使其饱和,则与该质子在立体空间位置上接近的另一个或数个质子信号强度增高的现象。,nuclear overhauser effect, NOE,223,ROESY spectrum,H-4,H-2,H-2,S,S,H-4,H-2,224,(3)HMQC (

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