叶绿ww体色素理化性质.ppt

叶绿体色素的提取、分离和理化性质,实验目的,实验目的： 1、学习叶绿体色素的提取方法。 2、了解叶绿素和类胡萝卜素的一些主要理化性质。,绿色植物的光合作用是在叶绿体中进行的，其中吸收光能的是叶绿体色素。了解叶绿体色素的组成、性质对于理解光合作用的本质很有帮助。,植物色素包括： 脂溶性的叶绿体色素： 存在于叶绿体，与光合作用有关，如叶绿素、类胡萝卜素等 水溶性的细胞液色素： 存在于液泡中，与花朵的颜色有关，如花青素属黄酮类物质。,实验材料：,菠菜叶片,本实验共有7项任务，按下列顺序做： 1、叶绿体色素提取 2、光对叶绿素的破坏作用 3、叶绿体色素的纸层析分离 4、叶绿素的荧光现象 5、皂化作用 6、吸收光谱观察 7、H+和Cu+对Mg+的取代作用,2，4-7为理化性质内容。,1、叶绿素提取原理与操作步骤,各种植物叶绿体中所含的色素有数十种。,叶绿素类、 类胡萝卜素类 和藻胆素（藻类）。,分三大类,存在于类囊体膜上,叶绿体中含有绿色素（包括叶绿素a和叶绿素b，属于酯类化合物）和黄色素（包括胡萝卜素（烃类）叶黄素（衍生的醇类）两大类。它们与类囊体膜上的蛋白质相结合，而成为色素蛋白复合体。 基本性质：不溶于水，而溶于有机溶剂。 故可用乙醇或丙酮（含一定比例水分？）等有机溶剂提取。,提取步骤：,（1）取菠菜叶片洗净、擦干、剪碎、混匀，称2.5g，放入研钵中。 （2）加入少量石英砂及碳酸钙粉（目的？），加23滴管95%乙醇，研磨至糊状;（3）再加15ml 95%乙醇，提取约3 min，过滤于三角瓶中; （4）残渣用5-10ml 95%乙醇冲洗，一同过滤于三角瓶中。 （备用）,2.光对叶绿素的破坏作用,叶绿素（a，b）的化学性质很不稳定，容易受强光的破坏，特别是当叶绿素与蛋白质分离以后（有机溶剂提取液），破坏更快，而类胡萝卜素则较稳定。 （提取出叶绿素后先做这一步）,用15N研究燕麦叶片中色素的合成和分解发现，在植物体内，72小时全部更新一遍。,水研磨匀浆（光破坏对照）： 取2g剪碎的新鲜叶片，放入少量石英砂（不加碳酸钙粉），用水研磨。 先加2ml蒸馏水，研至糊状，再加蒸馏水20ml，搅均，不过滤。,光对叶绿素的破坏操作步骤： 有太阳光时按照指导书的测定方法操作 稀释时不用严格定量？ 稀释1-2倍，为什么要稀释？,太阳光下 ：水、乙醇,暗处（实验台）：水、乙醇,两组（四管）,水研磨匀浆 暗 光,乙醇提取液 暗 光,注意：乙醇提取液的浓度太大，必须进行稀释才能做光破坏实验，稀释倍数视提取液的浓度确定，浓度不要过大，否则在短时间之内效果不明显。,水研磨匀浆液,光下10分钟,阴天和晚上上课的同学取滤纸一张，将两种液体分别涂抹在滤纸上，带回去，放在光下处理。,折叠,剪开,乙醇提取液,暗处,光下破坏的时间不要过长，否则看不到效果。 阴天可以适当延长，时刻观察效果。,因吸附剂（本试验为滤纸）对不同物质的吸附力不同，当用适当的溶剂推动时，混合物中各成分在两相（流动相和固定相）间具有不同的分配系数，所以它们的移动速度不同，经过一定时间层析后，便将混合色素分离。,3. 叶绿素各成分的分离： （纸层析）,色层分析原理：,再脱吸附,两项间分配系数,吸附,脱吸附,再吸附,分配系数决定于固定相、流动相和被分离物质的性质。本实验中主要决定于被分离物质的极性。,固定相：滤纸（极性）,本实验,流动相（推动剂）：非极性,被分离物质：各种色素，极性不同。,（石油醚：丙酮：苯 =10：2：1） 现配现用,叶绿体色素的结构决定极性。 极性决定在滤纸上的迁移速率。,叶绿素的化学结构,细菌叶绿素a,叶绿素a,叶绿素b,酯,卟啉,植醇 叶绿醇,烃类,衍生的醇类,步骤一：,取圆形滤纸1张（11cm） 用细头吸管在中心戳一圆形小孔(圆且小) 取1张滤纸条(51.5cm)， 沿纸条长度方向涂色素， 涂抹宽度限制在0.5cm，不要超过1/2 风干后，重复涂抹数次(细.匀.直.浓) 滤纸条沿长度方向卷成纸捻(纸捻卷紧) 纸捻带有色素的一端插入圆形滤纸 的小孔中，与滤纸平齐（勿凸出）,康维皿放置在培养皿内， 中央小室中加满推动剂 带纸捻的圆形滤纸平放在康维皿上， 使纸捻下端浸入推动剂中， 盖好培养皿(防推动剂蒸发) 推动剂前沿距滤纸边缘1/3时，取出滤纸， 风干，用铅笔标出各种色素的位置和名称 剪下一部分附到实验报告中。,步骤二：,(涂抹的色素量太多易发生拖尾，量少色带看不清),实验结果： 颜色从外往内分别是橙黄色、黄色、蓝绿色和黄绿色。 分别为：？,注意事项： 1、色素多涂抹几次，风干后再涂抹第二次。 涂抹的色素要适量，量太多易发生拖尾，量少色带看不清。 2、纸捻卷紧； 3、色素涂抹的宽度不要超过纸条的二分之一； 4、中心孔小而圆；平齐，勿突出； 5、分离时一定要盖严培养皿盖，防止推动剂蒸发。 细，匀，直，浓度适宜高。,4、叶绿素的荧光现象,叶绿素的酒精溶液，透射光下为翠绿色，反射光下为棕红色，这种现象为荧光现象。,当荧光出现后，立即中断光源，用灵敏的光学仪器还可在短时间内看到红色“余晖”，这是磷光。,叶绿素酒精溶液的荧光强度较强，约达其吸收光的10左右，肉眼很容易观察； 而鲜叶的荧光强度较低，只占其吸收光的0.l1，肉眼无法观察。,退激,荧光与磷光现象产生的原理,如果提取液的浓度较低，无法观察到荧光。 （荧光强度太弱）,透射光下为绿色,反射光下为红色（荧光）,5、皂化作用（绿色素与黄色素的分离）,C32H30ON4Mg,COOCH3,COOC20H39,+ 2KOH,C32H30ON4Mg,COOK,COOK,+ CH3OH + C20H39OH,叶绿醇,甲醇,叶绿素是一种由叶绿酸和甲醇、叶绿醇形成的复杂酯（二羧酸酯），可与碱起皂化反应，生成醇和叶绿酸的盐，产生的盐能溶于水，用此法可将叶绿素与类胡萝卜素分开。,做过荧光现象观察的色素乙醇提取液试管 加入2ml 20%KOH-甲醇溶液，充分摇匀 加入5ml苯，摇匀 沿管壁加入2ml蒸馏水，混匀 若溶液不分层，可用滴管沿管壁滴加蒸馏水 边滴加边摇动，直到开始分层 (如色素浓度大可再加1ml的KOH-甲醇溶液),操作步骤,注意：如果分层后下部的溶液浑浊，可以剧烈摇动，对试管加温，溶液很快分层，絮状物消失，溶液变得清澈透明。 原因：可能是温度较低引起的。,6、吸收光谱观察,叶绿素与类胡萝卜素都具有光学活性，表现出一定的吸收光谱，可用分光镜检查或用分光光度计精确测定,在阳光与三棱镜之间插入一支盛有叶绿素的试管，光谱中的红光与蓝紫光的部位会出现很深的黑带，表明这些光线已被叶绿素强烈吸收；而绿光部位没有黑带，即未被吸收。因此，叶绿素呈现绿色。 胡萝卜素与叶黄素主要吸收蓝紫光，基本上不吸收黄光，从而呈现黄色。,操作步骤：,首先观察分光镜中 七色光谱情况 将试管中已分层的溶液， 先让下层绿色部分对准 光孔，观察光谱变化 然后上层黄色部分对准 光孔，观察光谱变化 （注意试管要对准光孔）,7、H+和Cu+对Mg+的取代作用,只做方法一,H+,Cu+,叶绿素中的Mg+被H+所取代而成褐色的去镁叶绿素。 铜取代H+形成铜代叶绿素。 铜代叶绿素很稳定，在光下不易破坏，故常用此法制作绿色多汁植物的浸渍标本。,1小试管,加乙醇色素提取液2ml,95%乙醇稀释3倍（绿色）,取出3/1放到2（CK1）,加5盐酸1滴,摇均匀（褐色）,取出2/1放到3（CK2）,加入醋酸铜粉末少许,不断摇