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文档简介

书书书 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛 犖犜 大豆疫霉病菌实时荧光犘 犆 犚检测方法 犇 犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀狅 犳犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 狊 狅 犼 犪 犲狑 犻 狋 犺狉 犲 犪 犾 狋 犻 犿 犲犘 犆 犚 发布 实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 前 言 请注意本文件的某些内容可能涉及专利, 本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位: 中华人民共和国深圳出入境检验检疫局、 南京农业大学、 中华人民共和国辽宁出 入境检验检疫局、 中国检验检疫科学研究院、 中华人民共和国上海出入境检验检疫局、 中华人民共和国 黑龙江出入境检验检疫局、 中国农业大学。 本标准主要起草人: 章桂明、 王源超、 吴际云、 彭金火、 严进、 程颖慧、 王颖、 易建平、 崔澍、 杨伟东、 杨立群、 聂文革、 缪建锟。 本标准为首次发布的出入境检验检疫行业标准。 犛 犖犜 大豆疫霉病菌实时荧光犘 犆 犚检测方法 范围 本标准规定了大豆疫霉病菌( 犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 狊 狅 犼 犪 犲 ) 的实时荧光 检测 鉴定方法。 本标准适用于大豆夹杂的土壤传带大豆疫霉病菌的检测。 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件, 其随后所有 的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准, 然而, 鼓励根据本标准达成协议的各方研究 是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件, 其最新版本适用于本标准。 分析实验室用水规格和试验方法 大豆疫霉病菌检疫鉴定方法 原理 分类学地位 学名:犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 狊 狅 犼 犪 犲 病害名称: 大豆疫霉病菌; 常用英文名: 犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 分类 地 位: 藻 菌 界 , 卵 菌 门 , 腐 霉 目 , 腐 霉 科 , 疫 霉 属犘 犺 狔 狋 狅 狆 犺 狋 犺 狅 狉 犪 实时荧光犘 犆 犚 利用荧光信号伴随着 产物的增加而增强的原理, 在 扩增过程中, 连续不断地检测反应体 系中荧光信号的变化, 根据荧光信号基线的平均值和平均标准差, 得出大于平均值的荧光值即阈值, 收 集荧光信号增强到预定阈值时的 循环次数, 即 值。根据 值判断样品是否带有大豆疫霉 病菌。 取样方法 大豆夹杂土壤的取样按照 进行。 仪器和试剂 主要仪器 烘箱。 高压灭菌锅。 摇床。 水浴锅。 纯水仪。 高速冷冻离心机。 实时荧光 仪。 微量移液器( , , , ) 。 真空抽干仪。 犛 犖犜 主要试剂 除另有规定外, 所有试剂均为分析纯或生化试剂, 实验用水应符合 中一级水的规格。 提取液: ( 质量浓度) , ( ) , ( ) , 氯化钠。 饱和酚。 三氯甲烷。 异戊醇。 异丙醇。 无水乙醇。 。 反应试剂: 、 氯化镁、 ( 、 、 、 ) 、 、 犜 犪 狇 。 醋酸钠。 检测与鉴定 土壤中卵孢子核酸制备 将试样研磨, 过 目筛。置于样品瓶中, 密封, 并标明标记。 清洗实验器皿, 于 、 湿热灭菌或 干热灭菌。 称取磨成粉末状的土样, 倒入锥形瓶中, 加 无菌水, 再加 吐温, 混匀, 摇动 。 将处理过的土样液倒入 目的筛网过筛, 用清水不断冲洗; 将下层冲洗液倒入 目的筛网 抽气过筛, 用清水不断冲洗; 再次将下层冲洗液倒入 目的筛网抽气过筛, 最后将筛网上卵孢子收集 物倒入研钵, 烘干。 将烘干的卵孢子收集物加液氮进行充分研磨, 然后加 预热的 抽提液, 部分抽提液 用于洗涤研钵。 将离心管放入水浴锅前先振荡 , 然后放入 水浴锅水浴 , 每隔 振 荡一次。 加三氯甲烷 , 用移液器混匀 , 冰浴 ; , 犵离心 , 取上清液加等 体积异丙醇, 轻轻摇匀, 然后 静置 。 , 犵离心 , 小心去除上清液, 留沉淀; 加 的酒精( 预冷) , 洗涤三次, 放入电 热鼓风烘箱或微量浓缩器进行干燥, 电热鼓风干燥箱温度设为 , 微量浓缩器温度设为 ; 加入 适量的去离子水, 。 实时荧光犘 犆 犚检测 犛 犢 犅 犚犌 犚 犈 犈 犖法 引物序列 引物序列: 引物序列: 扩增体系及条件 扩增反应 的 各 成 分 为: , 氯 化 镁 , , 引物 和 各 , , 犜 犪 狇酶 , 模板 , 补充去离子水至 。将反应体系混匀后置于实时荧光 仪中进行反应。 反应用双蒸水作空白对照, 阳性对照采用含有大豆疫霉病菌的 作为模板, 阴性对照以不含有 大豆疫霉病菌 作为模板, 每个样品重复次。 犛 犖犜 w w w . b z f x w . c o m 反应程序为: 预热 , 然后进入循环反应: 变性 , 退火 , 延伸 , 共循环 次, 循环后 延伸 。 犕犌 犅探针法 引物及探针序列 正向引物 : 反向引物 : 探针 : 扩增条件 反应体系总体积为, 各成分分别为: 实时荧光反应混合液 ( 含 , 氯化镁, , 犜 犪 狇 酶) , 的对引物各 , 探针 , 去离子水 , 提取液 。 将反应体系混匀后置于实时荧光 仪中进行反应。 反应用双蒸水作空白对照, 阳性对照采用含有大豆疫霉病菌的 作为模板, 阴性对照以不含有 大豆疫霉病菌 作为模板, 每个样品重复次。 设置扩增反应条件为: 预热 ; 变性 ; 然后进入 个循环, , 。 结果判定 实时荧光 所获结果中待测样品检测 值小于或等于 , 判定该样品检出大豆疫病病菌。 实时荧光 所获结果中待测样品检测 值大于或等于 , 判定该样品未检出大豆疫病病菌。 实时荧光 所获结果中待测样品检测 值在 之间, 应重做实时荧光 扩增。结果 按照 、 判定: 值仍然在 之间, 且分离曲线明显的, 判定该样品检出大豆疫病病菌。 样品保存 发现大豆疫霉病菌, 该土壤样品应保存年, 以备复验, 如涉及到贸易纠纷则应保存到纠纷解决完 毕。保存期满后, 需经灭菌处理。 犛 犖犜 w w w . b z f x w . c o m 书书书 犜 犖犛 中华人民共和

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