HPLC法测定土茯苓中3种活性成分的含量

HPLC 法测定土茯苓中 3 种活性成分的含量 肖凤霞 1， 邓少东1， 邓超明1， 林耿丰2， 邓韬1， 张旭倩1 ( 1 广州中医药大学 中药学院， 广东 广州 510006; 2 广东省中医院， 广东 广州 510000) 摘要: 目的 建立 HPLC 法同时测定土茯苓中花旗松素、 落新妇苷及白藜芦醇的含量。方法 采用 Kromasil C18( 250 mm 4 6 mm， 5 m) 柱， 以甲醇-0 5%( 体积分数) H3PO4( 体积比 34 66) 为流动相， 流 速 1 mLmin 1， 柱温30 ， 检测波长289、 291、 306 nm。结果 花旗松素、 落新妇苷及白藜芦醇质量浓度 分别在 3 320 3 425、 31 875 0 4 080、 3 789 1 485 gmL 1范围内与其峰面积呈良好的线性关系， 平均回收率分别为 94 45%、 97 15%、 97 27%。结论 该方法简便、 准确、 重复性好， 可用于土茯苓的质 量控制与评价。 关键词: 高效液相色谱法; 土茯苓; 花旗松素; 落新妇苷; 白藜芦醇 中图分类号: R927 2文献标志码: Adoi: 10 3969/j issn 1006- 8783 2011 06 013 文章编号: 1006- 8783( 2011) 06-0604-05 Simultaneous determination of 3 components in Rhizoma Smilacis Glabrae by HPLC XIAO Feng- xia1， DENG Shao- dong1， DENG Chao- ming1， LIN Geng- feng2， DENG Tao1， ZHANG Xu- qian1 ( 1 School of Chinese Herbal Medicine， Guangzhou University of Traditional Chinese Medicine， Guangzhou 510006， China;2 The Guangdong Provincial Hospital of Chinese Traditional Medicine， Guangzhou 510000， China) Abstract: Objective To develop an HPLC method for the determination of taxifolin， astilbin and resveratrol in Rhizoma Smilacis Glabrae Methods The analysis was carried out on a Kromasil C18( 250 mm 4 6 mm， 5 m) column;The mobile phase was composed of methanol- aqueous- phosphoric acid ( 34 66 0 5)and the flow rate was 1 mLmin 1;The column temperature was 30 ;The detection wavelength was at 289， 291and 306 nm Results The linear range of taxifolin， astilbin and resveratrol were 3 320 3 425 gmL 1， 31 875 0 4 080 gmL 1， 3 789 1 485 gmL1， respectively The average recoveries were 94 45%， 97 15%， 97. 27%， respectively Conclusion This method is simple and accurate with good repeatability， and can be used for quality evaluation of Rhizoma Smilacis Glabrae Key words: HPLC;Rhizoma Smilacis Glabrae;taxifolin;astilbin;resveratrol 收稿日期: 2011-09-13 基金项目: 广东省医学科研基金( A2009235) 作者简介: 肖凤霞( 1973 ) ， 女， 博士， 副研究员， 从事中药资源开发利用与中药新药研究， 电话: 020- 39358250， Email: 596898148 qq com。 网络出版时间: 2011-12-14 14: 20网络出版地址: http: / /www cnki net/kcms/detail/44 1413 R 20111214 1420 003 html 土茯苓是百合科植物光叶菝葜 Smilax glabra Roxb 的干燥根茎， 具有除湿、 解毒、 通利关节的功 效 1 。土茯苓中主要含有黄酮类、 皂苷类、 糖类、 甾 醇类、 芪类及有机酸类等化学成分。其中黄酮类成 分落新妇苷和花旗松素、 芪类成分白藜芦醇， 均具有 重要的生理活性。近年来临床研究和药理试验结果 表明， 落新妇苷、 花旗松素及白藜芦醇具有抗炎、 镇 痛、 利尿、 抗菌、 抗肿瘤及抗心肌缺血等多方面的药 理活性， 具有良好的开发利用前景 2 6 。有关土茯 苓中落新妇苷的含量测定研究已有诸多报道7 11 ， 但关于花旗松素和白藜芦醇含量测定研究的报道却 较为少见; 而中药材是一个复杂的物质体系， 不能仅 广东药学院学报 Journal of Guangdong Pharmaceutical UniversityDec 2011， 27( 6) 用单一的指标来控制其质量。土茯苓具有较多混用 品， 它与菝葜、 肖菝葜等在配药和应用时常 混 用 12 13 ， 且不易鉴别。因此， 本文建立同时测定土 茯苓中花旗松素、 落新妇苷及白藜芦醇含量的高效 液相色谱法， 并测定 8 批不同来源土茯苓及 3 批菝 葜中 3 种成分的质量分数， 为土茯苓的质量控制与 评价提供科学依据。 1仪器、 试药与样品 1 1仪器 Waters 600E 型高效液相色谱仪( Waters 600E 型四元泵、 2996 型二极管阵列检测器、 7725i 手动进 样器、 Millennium32 工作站) ; GZX- DH 型电热恒温 干燥箱( 上海市跃进医疗器械) ; Dionex Tcc- 100 型 柱温箱( 美国戴安公司) ; BP211D 电子天平 ( 德国 Sartorious) ; KQ- 500 型超声波清洗器( 昆山市超声仪 器有限公司) 。 1 2试药 花旗松素、 落新妇苷、 白藜芦醇对照品( 北京恒 元启天化工技术研究院， 纯度均为 98%， 批号分别 为 480- 18- 2、 9838- 67- 3、 501- 36-0) ， 甲醇、 乙腈为色 谱纯， H3PO4为优级纯， 水为怡宝矿泉水， 其余试剂 均为分析纯。 11 批样品在2010 年4 月至2011 年3 月间采购 或采收于不同的药房、 市场、 饮片生产企业、 医院及 中药材生产基地( 见表 1) 。经广州中医药大学林励 研究员鉴定， 1 8 号样品均为百合科植物光叶菝葜 Smilax glabra Roxb 的干燥根茎， 9 11 号样品均为 百合科植物菝葜 Smilax china L 的干燥根茎。 表 1样品来源信息表 Table 1Resource of samples 编号来源产地 1购于广东致信中药饮片有限公司( 批号 091201)广东 2购于广州市岭南中药饮片有限公司( 批号 091201)广东 3购于康美药业股份有限公司( 批号 100204031)广西 4购于广东省罗定市中医院( 批号 20101004)广东 5购于香港利康中西药房( 批号 20100415)广东 6购于广西梧州市百姓大药房( 批号 20101125)广西 7购于广西上思县药材公司第三门市部( 批号 20110320)广西 8购于越南中药材市场( 批号 20100830)越南 9采收于广东省化州市化橘红 GAP 生产基地( 批号 20110108)广东 10购于湖南省衡阳市民生堂( 批号 20100619)湖南 11购于越南河内药房( 批号 20100830)越南 2方法与结果 2 1混合对照品储备液的制备 精密称取经105 干燥至恒重的花旗松素、 落新 妇苷、 白藜芦醇对照品适量， 加 60% ( 体积分数， 下 同) 乙醇适量， 溶解、 摇匀， 配制成花旗松素、 落新妇 苷、 白藜芦醇质量浓度分别为 425、 4 080、 485 g mL 1的混合对照品储备液。 2 2供试品溶液的制备 取已干燥至恒重的土茯苓粉末( 过4 号筛) 约2 g， 精密称定， 置 50 mL 具塞锥形瓶中， 加入 60% 乙醇 30 mL， 称定重量， 超声( 40 kHz， 500 W) 提取 35 min， 取出， 放凉， 称重， 用 60% 乙醇补足减失的重 量， 0 22 m 有机系微孔滤膜滤过， 即得。 2 3色谱条件 色谱柱: Kromasil C18( 250 mm 4 6 mm， 5 m) ; 流动相: 甲醇-0 5% ( 体积分数) H3PO4( 体积比 34 66) ; 流速: 1 mLmin 1; 柱温: 30 ; 检测波长: 289、 291、 306 nm。 2 4方法学考察 24 1测定波长的选择取混合对照品储备液及 供试品( 1 号) 溶液各 10 L， 分别进样， 按“2 3” 项 下色谱条件测定， 在 200 800 nm 范围内扫描， 得到 花旗松素、 落新妇苷、 白藜芦醇及供试品溶液的紫外 吸收图谱， 花旗松素、 落新妇苷、 白藜芦醇的最大吸 收波长分别为 289、 291、 306 nm， 故选择上述波长为 测定波长。 2 4 2专属性试验分别精密吸取空白溶剂 506第 6 期肖凤霞， 等 HPLC 法测定土茯苓中 3 种活性成分的含量 ( 60%乙醇) 、 混合对照品储备液、 供试品( 1 号) 溶 液各 10 L， 分别进样， 按 “ 2 3” 项下色谱条件测定。 结果供试品溶液中花旗松素、 落新妇苷、 白藜芦醇 色谱峰与相邻峰的分离度分别为 1 343、 1 659、 2. 052， 理论塔板数以花旗松素、 落新妇苷、 白藜芦 醇计算， 分别不应低于 3 200、 2 500、 5 100， 3 种成 分保留时间分别为 10 233、 16 582、 23 400 min。 结果见图 1。 2 4 3标准曲线的制备分别精密吸取“2 1” 项 下混合对照品储备液适量， 各加入 60% 乙醇溶解并 稀释， 制得花旗松素、 落新妇苷、 白藜芦醇质量浓度 分别为425、 4 080、 485， 212 5、 2 040、 242 5， 106 25、 1 020、 121 25， 53 125、 510、 60 625， 26 562 5、 255、 30 312 5， 13 281 3、 127 5、 15 156 3， 6 640 6、 63. 75、 7 578 1， 3 320 3、 31 875、 3 789 1 gmL 1 的系列混合对照品溶液， 按“2 3” 项下色谱条件各 进样 10 L， 测定峰面积。以各对照品质量浓度( ) 为横坐标， 峰面积( A) 为纵坐标绘制标准曲线， 结果 见表 2。 2 4 4精密度试验精密吸取同一混合对照品 ( 花旗松素、 落新妇苷、 白藜芦醇的质量浓度分别为 106 25、 1 020、 121 25 gmL 1) 溶液 10 L， 按 “ 2 3” 项下色谱条件重复测定 6 次， 记录峰面积积 分值， 得花旗松素、 落新妇苷、 白藜芦醇峰面积积分 值的 RSD 值分别为 1 88%、 1 78%、 1 89%， 表明仪 器精密度良好。 0.00 0.20 0.40 Abundance/AU 0.00 0.20 0.60 0.40 0.00 0.15 0.45 0.30 t/min 0302010 0302010 0302010 A B C 1 2 3 1 2 3 1 花旗松素; 2 落新妇苷; 3 白藜芦醇。 图 1空白溶剂( A) 、 混合对照品溶液( B) 、 供试品溶液( C) HPLC 色谱图 Figure 1HPLC chromatograms of blank( A) ， reference substances( B) and sample ( C) 表 2 3 种成分的标准曲线方程 Table 2Linear regression equation for 3 compounds( n =8) 成分标准曲线方程r线性范围/( gmL 1) 花旗松素A =2 6805 107 9 2161 1040 999 73 320 3 425 落新妇苷A =1 9372 107 3 9502 1050 999 931 875 0 4 080 白藜芦醇A =5 9203 107 4 8772 1050 999 53 789 1 485 24 5重复性试验精密称取同一批号( 1 号) 土茯 苓药材约2 g， 共6 份， 精密称定， 按 “ 22” 项下方法进 行处理并依法测定各组分的质量分数。结果花旗松 素、 落新妇苷、 白藜芦醇质量分数的 RSD 值分别为 2. 07%、 2 16%、 3 01%， 表明本方法重复性良好。 24 6稳定性试验精密吸取同一供试品( 1 号) 溶 液10 L， 按“ 2 3” 项下色谱条件， 分别于 0、 2、 4、 8、 16、 24 h 进样测定， 记录峰面积。结果花旗松素、 落新 妇苷、 白藜芦醇峰面积的 RSD 值分别为 1 88%、 2. 68%、 257%， 表明供试品溶液在 24 h 内稳定。 2 4 7加样回收率试验取同一批号( 1 号) 已知 各待测成分质量分数( 花旗松素、 落新妇苷、 白藜芦 醇质量分数分别为 0 359 1、 23 730 1、 0 392 1 mg g 1) 的土茯苓约1 g， 共6 份， 精密称定， 置50 mL 具 塞锥形瓶中， 分别精密加入花旗松素、 落新妇苷、 白 藜芦醇质量分数分别为 0 363、 1 501 5、 0 139 5 mg mL 1的混合对照品溶液 1 mL。按“2 2” 项下方 法制备供试品溶液， 依法测定并计算各组分回收率。 结果见表 3。 2 5样品含量测定 分别取不同编号( 同表 1) 的土茯苓粉末( 过 4 号筛) 约 2 g， 精密称定， 按“ 2 2” 项下方法制备供试 品溶液， 按“2 3” 项下色谱条件分别进样 10 L， 平 行 3 份。记录峰面积， 计算药材中花旗松素、 落新妇 苷、 白藜芦醇的质量分数， 结果见表 4。 606广东药学院学报第 27 卷 表 3加样回收率试验结果 Table 3Recovery results( n =6) 成分样品量 m/g样品中的量 m/mg加入量 m/mg测得量 m/mg回收率/% 平均回收率/%RSD/% 花旗松素1 000 70 359 30 3630 717 998 78 1 000 90 359 40 3630 703 794 84 1 000 80 359 40 3630 708 096 04 94 453 34 1 000 80 359 40 3630 705 995 45 1 000 80 359 40 3630 687 090 27 1 000 80 359 40 3630 690 891 31 落新妇苷1 000 723 746 71 501 525 256 3100 54 1 000 923 751 51 501 525 212 197 28 1 000 823 749 11 501 525 163 594 20 97 152 34 1 000 823 749 11 501 525 217 097 76 1 000 823 749 11 501 525 176 295 04 1 000 823 749 11 501 525 222 398 11 白藜芦醇1 000 70 392 40 139 50 761 996 99 1 000 90 392 40 139 50 768 698 74 1 000 80 392 40 139 50 766 498 16 97 272 43 1 000 80 392 40 139 50 771 299 42 1 000 80 392 40 139 50 745 992 78 1 000 80 392 40 139 50 764 097 52 表 4各样品中 3 种成分含量测定结果 Table 4Contents of 3 compounds in samples ( 珋x s， n =3)w/( mgg 1) 编号花旗松素落新妇苷白藜芦醇 10 219 2 0 000 335 689 6 0 213 40 531 9 0 003 6 20 699 6 0 004 533 703 6 0 485 91 196 0 0 012 8 30 164 2 0 000 222 759 4 0 540 00 632 3 0 008 6 40 619 8 0 005 428 665 5 0 385 30 362 2 0 005 4 50 165 3 0 000 535 469 6 0 768 50 213 7 0 001 8 60 160 2 0 000 78 098 2 0 200 01 551 0 0 075 4 70 086 9 0 000 118 214 7 0 394 70 234 7 0 000 3 80 440 7 0 001 228 619 4 0 694 10 231 3 0 000 8 94 416 9 0 154 70 379 0 0 001 5 101 966 9 0 084 20 157 3 0 000 1 113 277 3 0 154 00 217 5 0 000 3 注 : “ ” 表示未测出。 3讨论 3 1提取溶剂的选择 参照文献 7 9 中报道的超声提取法， 分别考 察了体积分数 20%、 40%、 60%、 80% 甲醇， 甲醇， 体 积分数 20%、 40%、 60%、 80%乙醇， 乙醇等溶剂对花 旗松素、 落新妇苷、 白藜芦醇提取效率的影响。结果 表明3 种成分在60%乙醇溶液中提取效率均最高。 3 2流动相的选择 参照文献 7 10 中报道的流动相条件进行试 验， 发现花旗松素的分离效果均不理想。因此， 对不 同比例的乙腈- 0 5% ( 体积分数) H3PO4、 乙腈- 水、 甲醇- 0 5%( 体积分数) H3PO4、 甲醇- 水作为流动相 时的分离效果进行比较， 考察最佳流动相。其中采 用不同比例的乙腈- 水、 甲醇- 水洗脱时， 落新妇苷拖 尾现象严重; 采用不同比例的乙腈- 0 5% ( 体积分 数) H3PO4洗脱时， 白藜芦醇分离效果良好， 但干扰 峰较多， 花旗松素与落新妇苷难以达到基线分离; 而 采用甲醇- 0 5%( 体积分数) H3PO4( 体积比 34 66) 洗脱时， 花旗松素、 落新妇苷及白藜芦醇均能得到有 706第 6 期肖凤霞， 等 HPLC 法测定土茯苓中 3 种活性成分的含量 效分离。 3 3柱温的选择 将柱温分别控制在 30、 35、 40、 45 进行试验， 发现随温度的升高各成分色谱峰的分离度与分析时 间均无明显变化。为提高色谱柱的使用寿命， 选择 30 柱温进行测定。 3 4土茯苓与菝葜中 3 种成分含量测定结果分析 含量测定结果表明: 在 8 批土茯苓样品中， 花旗 松素、 落新妇苷、 白藜芦醇的质量分数均有明显差 异。其中落新妇苷的质量分数均超过2010 年版 中 国药典 所规定的限度( 均高于 0 45%) 1 ， 广东出 产的土茯苓中落新妇苷质量分数均高于广西出产的 土茯苓， 说明土茯苓中落新妇苷的质量分数与其产地 有一定关系。白藜芦醇的质量分数比文献 7 所报道 的相应值要高， 且不同来源土茯苓中白藜芦醇质量分 数差异较大; 在 3 批菝葜样品中， 均未检测到花旗松 素， 且落新妇苷的质量分数远低于土茯苓中相应值 ( 均低于045%) 。由此推测， 花旗松素及落新妇苷 的质量分数可作为区分土茯苓与菝葜的部分依据。 参考文献: 1中华人民共和国药典委员会 中华人民共和国药典: 2010 年版一部 M 北京: 中国医药科技出版社， 2010: 17 18 2沙飞， 禹志领， 王一涛， 等 土茯苓品质与药理研究进展 J 中药材， 2006， 29( 5) : 516 519 3李强 土茯苓现代研究概述J 中国药业， 2008， 17 ( 14) : 76 77 4张白嘉， 刘亚欧， 刘榴， 等 土茯苓及落新妇苷抗炎、 镇 痛、 利尿作用研究J 中药药理与临床， 2004， 20( 1) : 11 12 5师智勇， 孙宗全， 王国华， 等 花旗松素对大鼠心肌缺血 再灌注损伤的保护作用J 华中医学杂志， 2008， 32 ( 4) : 287 289 6阮金兰， 邹健， 蔡亚玲， 等 菝葜的抗炎活性成分研究 J 医药导报， 2005， 24( 8) : 670 672 7李磊， 张宏桂， 乔延， 等 HPLC 法测定土茯苓药材中落 新妇苷和白藜芦醇的含量J 药物分析杂志， 2007， 27 ( 5) : 655 8周军， 曲佳， 寿国香， 等 HPLC 法测定土茯苓中落新妇 苷及黄杞苷 J 中国药品标准， 2009， 10( 5) : 374 9方圆， 王雪彦， 晁若冰， 等 土茯苓药材中落新妇苷和总 黄酮的含量测定方法研究J 药物分析杂志， 2010，