细菌标本的收集、转运和处理.ppt

细菌标本的收集、转运和处理,第四军医大学西京医院检验科,概述 目的 按照正确的说明采集和稳妥地运转标本以保证结果的正确。 质量差的标本：误诊、错误的抗生素治疗 实验室责任 1.提供标本采集和运转手册(正确的说明) 2.与临床医生交流：正确地选择微生物试验，解释结果 3.检验医师：查房、会诊、选择试验、解释结果,标本采集 细菌学培养的标本应在疾病发作之后，抗生素开始治疗之前尽可能快地进行收集。需要采第二份标本是因为第一份标本质量差或运转条件不适当，但对诊断一种急性传染病来讲，其它情况很少要求第二份标本。例外的情况包括多次收集血标本培养和诊断苛养菌或最初没有怀疑的不常见的病原菌。,标本的选择和收集的一般原则 1选择合适的解剖部位收集标本。 2避免固有菌群污染。正常菌群的细菌生长和报告会使 医生和保健机构错误地认为它们引起感染的发生。另 外，正常菌群的过度生长会掩盖真正的病原。 3抽吸及抽吸后用无菌盐水冲洗和组织活检是怀疑厌氧 菌感染时正确的标本采集方法(表2)。用拭子采集标本 最少考虑，因为拭子取样标本量相对较少且容易被邻 近的正常菌群污染。培养厌氧菌的标本应储存于室 温，不能放冰箱，因为氧较容易扩散到冷的标本中去。,一、标本的选择和收集,4收集足够量的标本，使所要求的所有试验都能满意 地完成。标本量不足可产生假阴性结果。 5每份标本都要标明患者姓名、识别号码、标本来 源、采集日期和时间、采集者的姓名。 6盛标本的容器要有助于病原菌的存活，无泄漏，在 运送和处理期间安全。,表1 用于细菌培养的常见临床标本的选择,表2 厌氧培养各种临床标本的适应性,aIUD intrauterine device 子宫内装置,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,AFB：抗酸杆菌；BAP：血琼脂平板；BHI：心脑浸液；CHOC：巧克力琼脂；CSF：脑脊液；CVP：中心静脉压；EtOH：乙醇；I.V：静脉内；PVA：聚乙烯乙醇固定液；RT：室温,表3 细菌标本收集、运输和储藏指南,二、标本的转运,用于细菌培养的标本应立即转运至实验室。过度延长或将标本暴露于极端温度会危及结果，必须避免。转运一般原则如下： 1标本必须及时送至实验室。如果运送时间大于2h， 需用特殊运送培养基或要求冷藏温度(表3)。 2细菌培养标本储存不要超过24h，即使合适的运送培 基或冷藏温度。,3用于细菌学培养的临床标本转运最合适的时间取决于获得的 材料的体积。小体积的液体(1ml)或组织(1cm3)应在15 30min内提交，以避免蒸发、干燥或暴露于周围条件下。大体 积和在运送培基内的标本可储存长至24h。 4对周围条件特别敏感的细菌包括志贺菌、淋病奈瑟菌、脑膜 炎奈瑟菌、流感嗜血杆菌、肺炎链球菌和厌氧菌。通过培养 进行志贺菌的可靠检测要求及时进行。流感嗜血杆菌对低温 敏感。决不能冷冻脑脊液、生殖器、眼或中耳标本。 5从一个实验室到另一个实验室转运临床标本和传染性物质， 不管距离远近，都要严格注意标本包装和标记说明。运送期 间，被运送的物质必需适当地标记、包装和保护。 特殊标本运送指南见表3。,三、不常见细菌标本,某些引起传染病的细菌很少碰到，要求特殊运送条件或运送培养基。在许多情况下，这些标本需要送到参考实验室，则需要相对长的时间。表4列出了这些标本和这些细菌的转运条件。,表4 不常见菌的标本处理,AO吖啶橙;SPS：多聚茴者脑黄酸钠,四、标本的处理(检测),细菌标本的检测包括：染色，培养，免疫学方法检测抗原和分子生物学技术检测核酸序列。推荐方法见表5.,(一)常见细菌标本革兰染色和接种培养基的建议 见表5,表5 细菌学标本革兰染色和接种培养基的建议,表5 细菌学标本革兰染色和接种培养基的建议,B：血液琼脂平板；C：巧克力琼脂平板；Mac：麦康凯琼脂；Th：巯基乙酸培养基；Ca：弯曲菌琼脂；HE：Hektoen氏培养基；EB：增菌肉汤；SSA：A型链球菌选择性琼脂平板；TM：Thayer-Martin;BCYE：平衡活性炭酵母抽提物；TCBS：硫代硫酸-柠檬酸-胆盐蔗糖琼脂；CIN：cefsulodin-irgasan-novobiocin;BBA：布鲁氏菌血琼脂；LKV：含卡那霉素和万古霉素的可溶羊血；BBE：拟杆菌胆汁七叶苷(bacteroides bile esculin)；CAN：厌氧性多粘菌素E-萘啶酸；CCFA：环丝氨酸-头孢噻吩-果糖琼脂；CAPD：慢性非卧床腹膜透析体液 如果标本采集正确，根据需要进行厌氧培养。,表5 细菌学标本革兰染色和接种培养基的建议,革兰染色无论何时都推荐： 快速染色结果对病人防治是需要的； 细胞组成分析用于决定标本是否适当； 结果有助于解释培养结果。 厌氧菌培养应仅仅包括规定好的合适的标本来源(表2)和无氧容器运转并没有被皮肤粘膜正常菌群污染的标本。,(二)标本处理一般原则,1安全 2及时送往实验室，要求见表3 3标本标记和试验医嘱要求 (1)记录标本到达实验室的时间 (2)记录标本接种的时间 (3)接受标本时仔细检查标本和申请；,标本标签上必须有病人的姓名和标本来源，申请单上必须有：病人姓名、年龄、性别、鉴定身份的号码(如社会保险号或唯一的挂号号码、账单)、病房、医生办公室地址；下医嘱的医生姓名、标本来源、标本采集日期和时间；检查项目。 如果上述资料不完整，实验室人员必须打电话问清楚，如果一个标本没有标记或没有提供姓名，则必须重新送一份标本。只有另一份标本不能得到，如外科手术取的标本，才允许重新标记标本。实验室操作人员必须清楚地记录这些例外，每一步必须验证和文字证明以及应负责任的人员。当有例外发生时，必须在报告单下注明，以便医生解释结果时避免潜在的错误。,(三)标本拒绝接收 (1)标本采集、转运容器和条件不当可使标本变 为不可接受的，需重新采集。要求见表3。 (2)由于标本质量不符合要求，拒绝接收(见表6)。,表6 保证细菌常规培养质量要求的标本筛选,LE：白细胞；SEC：鳞状上皮细胞,(3)尽量使标本的量满足所有试验要求。如果标本体积(量)被方 法或感染的身体部位等限制，小体积的液体标本可加 1 2ml灭菌盐水或营养肉汤，加到刚好足够满足所有试验所要 求的液标本量是很重要的。 (4)应对标本时行肉眼检查 首先对临床标本进行细胞组成的肉眼检查，感染导致产 生脓(多形核白细胞)、血、坏死组织和粘液(粘膜标本)。 一般说来，肉眼检查应鉴别黄色到褐色的脓，红色到铁 锈色的血，清亮到粘稠的粘液，和棕色到淡黑色表示坏 死的组织。制备涂片和接种培养基应取自这些区域。,涂片的理想显微检查，用10物镜，应检查出许多多形核细 胞，而检查到少数或检查不到表示皮肤或皮肤粘膜正常菌群污 染的鳞状上皮细胞。坏死组织染色涂片上也可表现许多弹性纤 维。虽然弹性纤维出现在未感染的外科伤口和来自水肿组织的 标本，但它们也可在已坏死的组织。 下呼吸道标本往往显示肺泡巨噬细胞和Curschmanns螺旋物 (粘蛋白状的原纤维，见于支气管哮喘患者痰内)，表明标本来 源于气道的远端。Curschmanns螺旋物是细支气管的管型， 见于由哮喘或吸烟引起的慢性肺病患者。,有丰富的鳞状上皮细胞，表明正常菌群污染的标本， 应拒收。 被病人贴身的医护人员拒绝的标本，解释拒绝的理 由，并要求更换成可接受质量的标本，应及时通知并 采集替换标本，特别是在已经开始抗微生物治疗的情 况。 标本拒绝的标准在变为规定之前应由相应实验室和医 护人员代表复审。,五、培养解释,根据每种分离菌的量、相关性培养物革兰染色涂片结果和来自不同部位标本的常见污染菌和病原菌的识别来区别正常污染菌群和可能病原菌。 标本来自容易污染的部位(如痰、尿和表面伤口)，可能的病原菌的数量应超出固有菌群，经革兰染色直接能看到。 标本来自可能无菌部位(如CSF、关节液、其它体液和组织)，可能病原菌可以任何数量出现，染色涂片看到或看不到。 保留培养平板1周是有用办法，它可以留给医生根据临床指征要求进一步鉴定或药敏试验的机会。,六、微生物学的应急价值,虽然培养需要数天或数周才出现阳性，但涂片染色结果、抗原或抗酸测定结果和来自无菌部位标本的培养结果可能会有所需的重要信息。 需要立即通知医护人员的例子：血培养、CSF革兰染色或培养阳性结果、伤口标本中A组链球菌的检测结果、革兰染色表明的气性坏疽或其它系统毒素血症、疟疾阳性涂片等。 白天交班时通知(不必晚上或半夜通知)的例子：抗酸染色阳性、新的或非常规的药敏试验、有高度意义或不常见的菌如军团菌、李斯特菌、或布氏菌的检测结果。 应急报告的内容需实验室与临床医护人员商量 。,七、血液和血管内导管标本,(一)菌血症和脓毒血症 菌血症：血中存在细菌 继发性菌血症：从原发灶扩散入血 原发性菌血症：找不到原发灶 脓毒血症：带有症状和体征的菌血症，如发热、寒颤和 心跳加快 脓毒性休克：脓毒症引起的低血压，严重的脓毒症特征 为脓毒性休克伴有器官系统衰竭，死亡率 高达20%40% (二)造成菌血症的细菌 种类繁多，主要有链球菌/肠球菌、葡萄球菌或肠杆菌等。,污染菌主要有凝固酶阴性的葡球菌、棒状杆菌、芽胞杆菌属和丙酸杆菌。 鉴别病原菌和污染菌非常重要。一般讲，上述污染菌中一次培养阳性代表污染，多次不同时间采集的标本生长出同一种菌很可能是致病菌。 污染可通过静脉穿刺皮肤防腐而控制，23%是满意的。污染率应研究和通过教育纠正。,(三)采集时间、方法和量 1. 采集时间 尽量在使用抗生素前采集，如已用抗菌药物；则在下次用药前采集。对间隙性寒战或发热者应在寒战或体温高峰到来之前0.5-1h采集，或寒战或发热后1h采集。 2.采集方法和量 所以，检测菌血症要求多个血培养，每个培养的血量要大。对成人的规则，24h内需23次分开的血培养，每次至少接种20ml血。对儿科，除血量外，其它推荐要求相似。见表3和7。,表3 血标本的采集、运输和储藏,表7 儿科细菌血培养推荐血液体积,血液体积计算按新生儿约85ml/kg，其它病人73ml/kg，从1个80kg成人采集2个20ml血标本(总量40ml)大约是病人总血量的0.7%。,(四)接种方法 最好的方法是静脉采集的血直接接种到血培养瓶，比先放入试管再送到实验室转种到培养瓶好。直接接种培养瓶可使细菌马上开始生长，减少细菌暴露于抗凝剂的量，也减少健康医护人员被针刺意外事故的机会。所有血培养系统中使用的抗凝剂是多聚茴香脑黄酸钠(SPS)，已知它对脑膜炎球菌，淋球菌、厌氧消化链球菌、念珠状链杆菌和阴道加德纳菌有抑制作用。直接接种到血培养瓶可减少暴露于转运试管中SPS的量。,(五)直接镜检 静脉血标本(或血液浅黄色上层)涂片革兰染色镜检偶儿可查到下列病人血液中细菌：脑膜炎、肺链球菌感染、或由其它细菌引起的严重脓毒症。 虽有不少报导直接应用，但血中细菌浓度很高，大约10000个/ml血。这一条不能做为常规应用。,(六)其它几个相关问题 1细菌不生长 某些菌如军团菌、分枝杆菌、脑膜炎球菌，某些株和淋病奈瑟菌在常规商品培养基上不生长，可考虑换其它方法，如溶解离心法。有的菌要需要长时间培养，有的需要加入抗生素或抑制物的吸附剂。 2染色报告 血培养瓶培养阳性最初靠肉汤涂片染色镜检评价。染色报告要包括革兰染色反应和细菌形态描述。如果能作出初步性鉴定，可加在报告上。如“革兰阳性球菌，建议考虑葡萄球菌”，如果革兰染色不能识别，吖啶橙染色可能更敏感。 阳性血培养瓶的标本以涂片革兰染色看到的菌为基础进行传代培养。,由于有510%菌血症是多种细菌的，推荐方法为根据染色显示，加哥伦比亚-多粘菌素-萘啶酮酸(CNA)或别的G-菌抑制剂琼脂培基培养分离G+菌，或加入MacConkey培基或有关的选择培基上培养G-菌。 3如果在G染色涂片中看见厌氧菌的形态或仅在厌氧培养瓶中发现，则应用厌氧培基和条件。,4. 关于厌氧培养 厌氧菌在血液中占百分比小，过去几年研究有下降趋势。但并非所有医院都如此，实验室应根据自己的资料来决定是否将厌氧培养做为常规的一部分。 5. 血管导管头培养 血管导管头培养是检查菌血症是否来源于导管，要与血培养配对进行。常用方法是半定量方法，即将导管远端5cm一段在血琼脂平板上滚动4次，然后丢掉。培养长出15个菌落认为是有意义的，如果血培养获得同样的分离菌，表明导管头很可能是菌血症的来源。还有定量方法。,八、下呼吸道标本,(一)标本采集 下呼吸道标本用于检测气道疾病(气管和支气管)、肺炎、肺脓肿和脓胸的病原体。常见标本有痰、气管内吸出物(插管病人)、支气管刷出物、洗液或支气管镜收集的肺泡灌洗液和胸膜液。标本应及时送往实验室。标本采集见表3。,表3 下呼吸道标本的采集、运输和储藏,(二)标本和筛选 病原菌存在于含多形核白细胞的标本中，量比污染的呼吸道菌群大，病原菌常常存在于多形核白细胞内。筛选的方法有多种，最简单的是仅仅评估鳞状上皮细胞，见表6。 用于检测支原体肺炎、军团菌属、二相真菌和结核分枝杆菌不应进行筛选。 表6 下呼吸道标本的筛选,表6 下呼吸道标本的筛选,(三)涂片革兰染色 镜检看炎症细胞：细菌和病理指标，如粘液、坏死组织、细胞内细菌、尘细胞和curschmann螺旋。气管、支气管脓池及肺脓腔内细胞坏死或碎片。吞噬细胞内细菌浓度较细胞外附近部位的细菌浓度大，借此可将其与“躺在”多形白细胞上的细菌区别开来。尘细胞(胞浆内空泡、核偏于周边)较难看到，它和上述螺旋表明涂片的区域来自肺泡和气管远端。,(四)污染呼吸道菌群与吸入性肺炎和呼吸道菌的区别 在意识丧失、吞咽和呼吸肌麻痹或喉部插管等情况下，吞入大量咽部内容物可引起由混合呼吸道菌群造成的气道感染、脓肿或脓胸。 吸入性肺炎病人痰革兰染色对诊断有很大启示。涂片显示许多多形核白细胞和许多混合呼吸道菌群形态类型，特别是提示链球菌和厌氧菌者。,(五)下呼吸道细菌培养结果解释,表10 下呼吸道细菌培养结果解释,(六)支气管镜检查收集的标本 支气管刷标本和支气管肺泡灌洗液就应进行定量培养以估计可能获得病原菌的意义。 支气管刷标本约0.010.001ml分泌物，放入1ml无抑菌剂的无菌盐水，应即送往实验室。混旋后接种0.01ml，1000CFU/ml的可能病原菌菌落计数(对应于106CFU/ml原标本)可能与疾病相关。 肺泡灌洗液 涂片染色如果鳞状细胞1%所有细胞，则严重污染，可错误地抬高可能病原菌计数。细胞内细菌可能是病原菌。 0.01或0.001ml整倍数支气管肺泡灌洗液接种琼脂培基，100000菌/ml提示可能为病原菌。10000100000菌/ml代表“灰色”带。,九、尿标本,(一)尿标本的采集 见表3,尿标本应立即送往实验室，不应超过2h。冷藏不能超过24h。含硼酸的运送试管室温24h可起到稳定细菌数的作用。 第一次空腹尿是最好的，因大多数病例细菌已在膀胱内增殖了数小时。 清洁尿道周围区域，并未显示出现进尿培养的质量，因而不推荐。,(二)尿标本的筛选 尿培养为最普通的试验，但大多为阴性，即检测不到病原菌，故采用筛选方法。 1显微镜检查 每个油浸镜视野(100物镜)中有2个或以上相同形态类型的菌，对应于培养中100000或更多。革兰染色镜检经济、迅速，但花费劳力和要求训练有素的技术人员。 2浸渍试纸条检测白细胞酯酶和亚硝酸盐 该试验是基于中性粒细胞产生白细胞酯酶和细菌产生硝酸盐还原酶。该法快速、廉价和操作简单，但某些