农林学类论文-大豆菌核病生防菌克Ｈ３菌株发酵条件研究.doc

农林学类论文-大豆菌核病生防菌克菌株发酵条件研究摘要：通过对大豆菌核病生防菌克H3菌株发酵条件的研究表明，适宜克H3菌株生长的培养基是自制培养基，最适温度35，适宜pH值7.08.5，最佳发酵时间48h，克H3生长曲线表明，618h为该菌延迟期，1830h为对数生长期，3054h为稳定期，54h后进入衰退期。关键词：大豆菌核病；克H3；发酵条件1材料与方法11供试培养基PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。高氏1号培养基：可溶性淀粉20g，KNO31g，K2HPO40.5g，MgSO37H2O0.5g，Fe-SO40.01g，水1000mL。肉汁蛋白胨培养基：牛肉膏5g，NaCl5g，蛋白胨10g，水1000mL。玉米粉培养基：玉米粉300g，水1000mL。YPG培养基：酵母浸膏8g，酵母膏2g，KH2PO40.5g，K2HPO42g，水1000mL。灭菌后加入无菌10葡萄糖50mL和1MMgSO47H2O1mL，pH值7.2。BPY培养基：牛肉膏5g，酵母膏5g，葡萄糖5g，蛋白胨10g，NaCl5g，水1000mL。pH值7.2。自制培养基：豆粉10g，葡萄糖10g，酵母膏5g，水1000mL。12主要仪器设备HYA恒温摇床(中国科学院武汉仪器厂)，O-lympus显微镜(日本奥林巴斯株式会社)，PHS-3C型酸度计(金坛市泰纳仪器厂)，电热恒温培养箱(南京电器三厂)，手提式高压灭菌锅(哈尔滨东联电子公司)，超净工作台(上海精密仪器仪表厂)。13试验方法131克H3菌株发酵液的制备将活化的克H3菌株用接菌环划线接种于肉汁蛋白胨培养基斜面上，30恒温培养2d后，每试管用5mL无菌水配成克H3悬浮液，将5mL的克H3悬浮液置于装有100mLPDA培养液的250mL三角瓶中，在35、180r/min摇床中培养48h制成发酵液。132抑菌活性的测定方法采用滤纸片法。在PDA培养基一侧放人直径8ram的已灭菌的圆形滤纸碟片，用移液枪接种克H3悬浮液5L，另一侧放人核盘菌(6mm)，菌间相距3cm。每处理3次重复，5d观察拮抗效果，测量抑菌带宽度。133最佳培养基的选择供试培养基为PDA培养基、高氏1号培养基、肉汁蛋白胨培养基、玉米粉培养基、YPG培养基、BPY培养基和自制培养基，将5mL的克H3发酵液分别置于装有100mL上述培养基的250mL三角瓶中，在35、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。134培养温度的测定处理温度为2040，梯度为5，将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中，在180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。每处理3次重复。135起始pH值的测定用PHS-3C型酸度计将自制培养基中的pH值调节为5.510，间隔为0.5。将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中，在35、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性，每处理3次重复。136培养时间的确定将5mL的克H3发酵液置于装有100mL自制培养基的250mL三角瓶中，在35、180r/min摇床中震荡培养。每间隔12h取发酵液测定抑菌活性，至72h结束，共取样6次。137培养基装液量的确定在250mL三角瓶中分别装入25、50、75、100、125、150mL的自制培养基，接种5的克H3发酵液，在35、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵液测定抑菌活性。138接种量的确定分别按1、2、5、7、10、20、30mL接种量接人100mL自制培养基中，在35、180r/min摇床中震荡培养48h后，取发酵产物测定抑菌活性。139摇床转速的确定250mL三角瓶中装入自制培养基100mL，接种5mL克H3发酵液后，分别在160、180、200、220r/min摇床中35震荡培养48h后，取发酵液产物测定抑菌活性。1310克H3菌株生长曲线在250mL三角瓶中装入100mL自制培养基，加入克H3发酵液5mL，在最适温度、最适pH值下180r/min恒温振荡培养后，以6h为时间间隔取样，即6、12、18、24、30、36、42、48、54、60、66、72h分别取样，稀释平板法测定每毫升菌落个数。2结果与分析21不同培养基对克H3抑菌活性的影响玉米粉培养基、PDA培养基培养的克H3菌株抑菌活性较差，抑菌带宽10mm，高氏l号培养基、肉汁蛋白胨培养基、YPG培养基、BPY培养基和自制培养基培养的克H3菌株对核盘菌的抑菌活性较强，其中自制培养基的抑菌活性最强，抑菌带宽11.7mm。22不同温度对克H3抑菌活性的影响结果表明，2040克H。菌株对核盘菌均有抑菌活性。2025克H3菌株抑菌活性较弱，抑菌带宽(10mm；3035克H3菌株抑菌活性较强，其中35抑菌活性最强，抑菌带宽11.9mm；当温度超过35，随着温度的升高克H3抑菌活性逐渐下降。23不同pH值对克H3抑菌活性的影响结果表明，pH值5.510克H3菌株对核盘菌均有抑菌活性，pH值5.56.5克H3抑菌活性较弱，抑菌带宽10mm；pH值7.08.5克H3抑菌活性强，其中pH值8.0时抑菌活性最强，抑菌带宽12.1mmpH值8.5时，克H3抑菌活性下降，但变化幅度不大。适合克H3发酵的pH值范围7.08.5。24不同培养时间对克H3抑菌活性的影响结果表明，克H3菌株发酵培养12h时，发酵产物抑菌活性非常弱，抑菌带宽5mm；12h后抑菌活性逐渐增强，至48h抑菌活性最强，抑菌带宽11.9mm，培养时间超过48h后，随着时间的延长克H3抑菌活性逐渐下降。克H3发酵时间范围为3648h，最佳发酵时间48h。25不同装液量对克H3抑苗活性的影响结果表明，培养基装液量25100mL时，克H3菌株发酵液的抑菌活性变化不大，当装液量100mL时，随着装液量的增加克H3抑菌活性逐渐下降。26不同接种量对克H3抑菌活性的影响结果表明，接种量15mL时，随着接种量的增加克H3抑菌活性逐渐增强，接种量510mL时，抑菌活性变化不大，接种量10mL时，随着接种量的加大克H3抑菌活性逐渐下降。27摇床速度对克H3抑菌活性的影响结果表明，不同摇床速度对克H3抑菌活性有影响，转速160、180r/min时抑菌活性较强，其中180r/min时抑菌活性最强；转速超过180/min时，随着转速的增加克H3抑菌活性逐渐下降。因此，克H3菌株发酵的最佳摇床速度为180r/min。28克H3菌株生长曲线图1表明，618h克H3菌落个数较少，增加缓慢，为克H3延迟期；1830h克H3菌落个数急剧增加，为对数生长期；3054h克H3菌落个数变化不大，为克H3稳定期，时间超过54h，随着培养时间的延长克H3菌落个数逐渐减少，为克H3衰退期。3讨论与分析通过对克H3菌株发酵条件的研究表明，适宜克H3菌株生长的培养基是自制培养基；适宜温度3035，最适温度35；适宜pH值7.08.5；适宜发酵时间3648h，最佳发酵时间48h；适宜装液量25100mL，推荐100mL装液量；适宜接种量510mL，推荐接种量5mL；适宜摇床速度160180r/min，最佳摇床速度180r/min；克H3生长曲线表明，618h为该菌延迟期，1830h为对数生长期，3054h为稳定期，54h后进入衰退期。微生物活性受培养基的制约，装液量反映发酵液菌体需氧状况，随着装液量的增加