金银花提取物中绿原酸的稳定性研究

金银花提取物中绿原酸的稳定性研究 陈 钢1, 侯世祥1, 胡 平1, 何 宁2, 朱雅宁3, 曹 伦3 ( 1. 四川大学 华西药学院 中药制剂研究室, 四川 成都 610041 ; 2. 四川大学 华西药学院 物理化学教研室 , 四川 成都 610041; 3. 雅安三九药业有限公司 , 四川 雅安 625000) 摘要 目的: 研究金银花提取物中绿原酸在不同条件下的稳定性。方法: 采用经典恒温法考察金银花提取 物中绿原酸在不同 pH 值磷酸盐缓冲液、甲醇、乙醇及不同碱液 Ca( OH)2, NaOH 中的稳定性。 结果:金银花提取物 中绿原酸在酸性环境较碱性环境中更稳定, 在上述有机溶剂中稳定, 在 Ca( OH)2中较稳定。 结论:金银花提取物 中绿原酸在不同条件下稳定性不同, 该结果可为绿原酸的提取、分析及其相关制剂的生产提供参考。 关键词 绿原酸; 稳定性; 金银花提取物; 经典恒温法; 反相高效液相色谱法 中图分类号 R 284. 1 文献标识码 A 文章编号 1001 -5302( 2003) 03-0223-04 绿原酸是金银花中的有效成分 ,具有显著的药 理活性 ,对消化系统 、血液系统和生殖系统均有疗 效 1 ,因此常作为含金银花的中药成方制剂稳定性 研究的指标成分 , 如银黄冲剂 、 银黄注射液、清开灵 注射液都通过测定绿原酸的含量变化进行稳定性研 究 2-4 。国外 ,有人采用烘烤和 射线辐射的方法 对咖啡提取物中绿原酸的含量进行考察, 发现烘烤 将导致绿原酸含量降低而 射线辐射则对其含量没 有影响 5。本研究以金银花提取物为样本, 设计并 考察了提取物中绿原酸在不同 pH 值水溶液中的稳 定性, 结果可为绿原酸的制备及相关制剂的生产提 供参考 。文献认为绿原酸在碱性条件下易降解 , 降 解产物为咖啡酸和有关物质 6, 7, 因此需要对绿原 酸在碱液中的稳定性进行考察 , 也为绿原酸的提取 提供借鉴 。本研究还设计并考察了绿原酸在有机溶 剂中的稳定性, 为绿原酸在体内外分析中萃取( 配 制) 溶剂的筛选提供依据 。目前,关于中药提取物中 绿原酸的稳定性研究还未见报道。 1 实验材料 1. 1 仪器 Agilent 1100 LC ; Sartorius 1712 型 1/ 10 万电子分析天平; pHS-3C 型 精密 pH 计( 上海雷 磁仪器厂) 。 收稿日期 2002 -08 -20 通讯作者 侯世祥 Tel: ( 028) 85502809 E -mail: housix 263. net 1. 2 样品 金银花提取物( 自制) ; 绿原酸对照品 ( 中国药品生物制品检定所) 。 1. 3 试剂 乙腈为色谱纯 ; 甲醇、乙醇均为分析 纯 ; 磷酸盐缓冲液 。 2 金银花提取物中绿原酸HPLC 测定方法的建立 2. 1 色谱条件 分析柱 ZORBAXSB-C18( 4. 6 mm 150 mm ,5 m) ; 流动相 乙腈- 0 . 4 % 磷酸溶液( 20 80) ; 流速 1 mLmin-1; 柱温 30 ; 检测波长 327 nm 。 2. 2 绿原酸标准曲线的制备 精密称取绿原酸对 照品适量 , 用50 %甲醇溶解 , 分 别制成1mL 含 10. 8, 26. 9, 53. 8, 107. 5,215. 0 g 的溶液, 依法测 定 。以进样量 B 对峰面积 A 作图 ,其线性回归方程 为 A =4763 . 1B +19. 2, r =0. 999 8( n =5) 。进样 量在 0. 108 2 . 15 g 内 ,线性良好 。 2. 3 精密度试验 取同一浓度绿原酸对照品溶 液连续 6 次进样测定峰面积 ,求得 RSD = 1. 07%。 2. 4 加样回收试验 精密称取已测定含量的同 批样品( 20020313) 5 份 , 分别精密加入绿原酸对照 品 ,50%甲醇溶解 , 按上述色谱条件测定, 计算回收 率 ,结果表明本法具有良好的回收率 ,其平均回收率 为 102. 3%, RSD= 1 . 21%。 2. 5 重现性试验 取同批样品( 20020313) 5 份, 精密称定 ,50 % 甲醇溶解, 按上述色谱条件测定 ,计 算得绿原酸的平均含量为21 . 5 %, RSD =1 . 19 % ( n = 5) ,结果表明本法重现性较好。 223 第 28 卷第 3 期 2003 年 3 月 中 国 中 药 杂 志 China Journal of Chinese Materia Medica Vol. 28, No . 3 Mar. , 2003 3 金银花提取物中绿原酸稳定性研究 3. 1 金银花提取物中绿原酸水溶液在不同 pH 值 、 不同温度下稳定性实验 取金银花提取物适量 , 分 成 8份 ,精密称定,分别加入不同 pH 值的磷酸盐缓 冲液 150 mL ,溶解后 ,用微孔滤膜过滤, 取续滤液灌 装于 2 mL 安瓿中 ,熔封 。取不同 pH 值溶液按标准 曲线项下测定方法测定峰面积 ,即得初始浓度 ,同时 将装有不同 pH 值溶液的安瓿分别置于 50, 60, 70, 80 的恒温水浴( 温差 1 ) 中加热, 于不同时间 点取出样品 ,迅速以冰水浴冷却 , 取样,HPLC 测定 含量。按一级动力学方程以绿原酸残留百分比的自 然对数值对时间进行线性回归, 求得同一温度, 同一 pH 值的反应常数 k ,结果见表 1。 表 1 绿原酸水溶液水解一级动力学方程的反应常数 k T / pH 2. 03. 04. 05. 06. 07. 07. 48. 0 500. 001 0020. 000 6630. 002 6490. 002 5150. 008 2310. 018 9400. 048 1120. 061 133 600. 001 9180. 001 3640. 003 4470. 003 6870. 011 2110. 029 9800. 06 82640. 089 253 700. 003 0730. 002 3540. 004 8100. 007 1000. 019 1700. 069 6000. 105 5020. 114 277 800. 004 5680. 003 9460. 005 9390. 010 7060. 027 0550. 115 7080. 172 5370. 178 705 由表 1 可得到金银花中绿原酸水溶液的 pH - 速率图,结果如图 1。 图 1 绿原酸水溶液的 pH-速率图 A. -50 B. -60 C. -70 D. -80 根据 Arrhenius 公式 ,求得同一 pH 值下直线方 程及室温下的有效期 t0 . 9,结果见表 2。 3. 2 金银花提取物中绿原酸在有机溶剂甲醇和乙 醇中的稳定性 取适量银花提取物分别溶于甲醇 、 乙醇, 灌封于 2 mL 安瓿中, 置于( 60 1) 恒温水 浴中, 于不同时间点取样 ,HPLC 测定绿原酸含量 。 各时间点残存绿原酸百分比见表 3。 3. 3 金银花提取物中绿原酸在Ca( OH)2和NaOH 溶液中的稳定性 取金银花提取液适量, 分别加入 Ca( OH)2,NaOH 调 pH 值至 12 0. 2 ,于室温下放 置不同时间后, 加硫酸调 pH 值至 2. 50. 2, HPLC 测定绿原酸含量 ,在不同碱液中各时间点绿原酸残 存百分比见表 4 和表 5。 4 讨论 4. 1 金银花提取物中除绿原酸外还有其他成分在 测定波长有吸收, 故不适合用紫外分光光度法做稳 定性研究。本实验所用色谱条件能很好地将绿原酸 与其他成分分离, 并且绿原酸峰形较好,可以用于提 取物中绿原酸的含量测定。 4. 2 绿原酸为咖啡酸奎尼酸酯 ,因而既能被酸也 能被碱催化水解。如图 1所示, 在 pH 值为 2. 0 3. 0 ,反应常数 k 值趋小 ,可推断其反应机制为酸催 化的水解反应; 在 pH 值为 3. 0 8. 0 ,反应常数 k 值 趋大 ,可推断其反应机制为碱催化的水解反应。其 水溶液在 pH3. 0 时最稳定 ,故在不考虑其他因素作 用时在制备绿原酸和相关制剂的生产中 pH 值应控 制在 3 左右 。 4. 3 表 2 的有效期是根据绿原酸在本实验中的存 在状态( 在金银花提取物中) 下预测的 。由于绿原酸 不是纯品,其稳定性还受提取物中其他成分的影响, 因此预测的有效期仅供参考 。但也从一定程度上说 明绿原酸的有效期不长 , 在含金银花的制剂生产中 应加以注意 。 4. 4 金银花提取物中绿原酸在有机溶剂中比较稳 定 ,说明在体内分析中萃取溶剂可选择甲醇或乙醇; 绿原酸在乙醇比在甲醇中更稳定, 提示金银花提取 物供试液宜用乙醇配制 , 绿原酸对照品也最好用乙 醇配制( 药典中使用 50%甲醇作溶剂) , 更利于保 存 。 224 第 28 卷第 3 期 2003 年 3 月 中 国 中 药 杂 志 China Journal of Chinese Materia Medica Vol. 28, No . 3 Mar. , 2003 表 2 绿原酸水溶液水解 Arrhenius 方程及 t0. 9 pHArrhenius 方程rt0 .9/h 2. 0 lnk = -5. 740 7 1/T 1 000 +10. 9190. 996 1 443. 8 3. 0 lnk = -6. 732 6 1/T 1 000 +13. 5650. 998 4877. 4 4. 0 lnk = -3. 143 2 1/T 1 000 +3. 792 90. 997 490. 4 5. 0 lnk = -5. 696 6 1/T 1 000 +11. 6040. 993 9193. 0 6. 0 lnk = -4. 676 8 1/T 1 000 +9. 638 10. 993 745. 0 7. 0 lnk = -7. 143 2 1/T 1 000 +18. 0830. 992 538. 0 7. 4 lnk = -4. 852 5 1/T 1 000 +11. 9410. 994 98. 1 8. 0 lnk = -3. 944 4 1/T 1 000 +9. 407 10. 993 04. 9 表 3 60 下甲醇、乙醇中绿原酸降解残存百分比 % 溶 剂 取样时间/h 0 d1 d2 d3 d 甲醇100 99. 695. 795. 1 乙醇10010098. 898. 6 表 4 绿原酸在 NaOH 中的降解残存百分比% 碱液 放置时间 0 min20 min45 min70 min95 min18 h NaOH10097. 596. 991. 588. 761. 2 表 5 绿原酸在 Ca( OH)2中的降解残存百分比 % 碱液 放置时间/h 01. 518 Ca( OH)2 100 100 94. 7 4. 5 一般认为绿原酸在碱性条件下可被水解 , 故 用石灰乳法制备金银花提取物时绿原酸和提取物得 率都较低 8。但是根据本实验的结果我们不难看 出 : 绿 原 酸对 不 同 碱 液的 稳 定 性 不一 样 , 在 Ca( OH)2碱液中比较稳定( 18 h 后残存 94 . 7 % ) , 在 NaOH 碱 液 中 稳 定 性 较 差 ( 1 8 h 后 仅 残 存 61. 2 % ) 。原因可能是由于绿原酸在 Ca( OH)2中 与钙离子结合,形成络合物 ,不易降解 。以上结果说 明用石灰乳法制备金银花提取物时绿原酸水解较 少 ,此制备方法有一定的可行性 。 参考文献 1 尉 芹, 马希汉. 绿原酸及其提取分离方法评述. 中成药, 2001, 23( 2) : 136. 2 宫瑞萍. 银黄冲剂质量稳定性的研究. 中成药, 1996, 18( 7) : 6. 3 吕方军, 蓝琪田, 罗国安. 薄层扫描法预测银黄注射液的稳定 性. 中草药,1988, 19( 10) : 17. 4 韩修林, 姚松林, 何 雁, 等. 清开灵注射液中黄芩甙和绿原酸 的稳定性研究. 中成药, 1996, 18( 4) : 1. 5 S N Deshpande, A A Aguilar. Effects of Roasting Temperatures and Gamma Irradiation on the Content of Chlorogenic Acid, Caf- feic Acid and Soluble Carbohydrates of Coffee. Int J Appl Radiat Isot, 1975, 26( 11) : 656. 6 沙世炎. 中草药有效成分分析法. 北京: 人民卫生出版社, 1982. 151. 7 上海医药工业研究院中药分析室, 上海中药制药一厂. 金银花 有效成分的初步研究. 医药工业, 1975,( 7) : 24. 8 林缎嫦, 宋劲诗, 吴应罴. 金银花中绿原酸提取工艺探讨. 中成 药, 1994, 16( 7) : 2. Studies on Stability of Chlorogenic Acid in Extract of Flos lonicerae CHEN Gang1, HOU Shi -xiang1, HU Ping1, HE Ning2, ZHU Ya -ning3, CAO Lun3 ( 1. Pharmaceutical Laboratory of Chinese Materia Medica, West China School of Pharmacy , Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan, China; 2.Teaching and Research Section of Physical Chemistry , West China School of Pharmacy , Sichuan University, Chengdu 610041, Sichuan, China; 3. Ya an Pharmaceutical Co. Ltd. , Ya an 625000, Sichuan, China ) 225 第 28 卷第 3 期 2003 年 3 月 中 国 中 药 杂 志 China Journal of Chinese Materia Medica Vol. 28, No . 3 Mar. , 2003 Absract Objective: To investigate the stability of chlorogenic acid in extract of flos lonicerae in different conditions. Method: The stability of chlorogenic acid in extract of flos lonicerae in phosptat buffe with different pH values, methanol, ethanol and different base solutions( Ca( OH)2 and NaOH)was investigated by the classical isothermal method.Result: The experiments showed the chlorogenic acid in extract of flos lonicerae was more stable in acidic water than in basic water.It wasstable in these organic solutions and base solution Ca ( OH)2 .Conclusion: In different conditions, the stability of chlorogenic acidin extract of flos lonicerae was dif- ferent.It provided a reference to the extraction and analysis of chlorogenic acid and production of chlorogenic acid preparation. Key words chlorogenic acid; stability ; extract of flos lonicerae ; classical isothermal method;RP-HPLC 责任编辑 刘 醋酸乙酯提取雷公藤浸膏后的溶剂回收工艺研究 柏学东 , 张理星 , 陈 涛 , 李冠忠 , 王学海 , 张卫国 ( 山东鲁南制药厂, 山东 临沂 276006) 摘要 目的: 提高雷公藤浸膏提取后的醋酸乙酯回收量, 降低生产成本。 方法: 向醋酸乙酯提取雷公藤浸膏后 的药渣中, 加入 3 倍量饱和食盐水常压蒸馏回收醋酸乙酯, 回收后的含水醋酸乙酯用无水硫酸钠处理。 结果: 处理 后的醋酸乙酯可重复使用, 溶剂回收率达 85% 以上, 大大降低了生产成本。 结论: 此法完全适合于大生产。 关键词 雷公藤浸膏提取; 常压蒸馏; 溶剂回收 中图分类号 R 283 文献标识码 A 文章编号 1001 -5302( 2003) 03-0226-03 雷公藤浸膏是采用醋酸乙酯的生产工艺提取 的 1-4 ,因醋酸乙酯价格较高 , 在生产成本中占较大 比重, 而回收醋酸乙酯时 5, 原工艺采用减压蒸馏, 溶剂回收率很低, 仅为药材吸附量的 38. 4 %, 本文 探讨加入饱和食盐水常压蒸馏的可行性 。 1 实验仪器、 试剂 蒸馏装置 1 套( 上海玻璃仪器厂) ,SHB 循环 水式多用真空泵( 郑州长城科工贸有限公司) , TN- 100B 型托盘扭力天平( 上海第二天平仪器厂) 。雷 公藤去皮根茎粗粉( 购自临沂市医药公司) ; 醋酸乙 酯(