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文档简介

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 sN/T3767.24-2014 出口食品中转基因成分环介导 +iEfTTg (LAMP) TOU| friE ffi 24 frFr) 7FfH LLRICE62 ffi A Loop-mediated isothermal amplification detection method for geneticalty m o d i f i e dJ;Iil,; I JIH:; exp o r t - 14-013发 布 14-0B-01实 施 中华人民共和国 国 家 质 量 监 督 检 验 检 疫 总 局 发布 sN/T 3767.24-2014 亠 曰 亠 刖 SN/T3767 出口食品中转基 因成分环介导等温扩增(LAMP)检 测方法 共分为30部分 : 第1部分 :通 用要求和定义 ; 第2部分 :筛 选方法 ; 第3部分 :玉 米Bt11品系 ; 第4部分 :玉 米Bt176品系 ; 第 5 部 分: 玉 米 G A 2 1 品 系; 第 6 部分 : 玉 米M I R 1 6 2 品 系 ; 第 7 部分 : 玉 米M I R 6 0 4 品 系 ; 第 8 部分 : 玉 米M O N 8 1 0 品 系 ; 第 9 部分 : 玉 米M O N 8 6 3 品 系 ; 第 1 0 部分 : 玉 米M O N 8 8 0 1 7 品 系 ; 第 1 1 部分 : 玉 米M O N 8 9 0 3 4 品 系 ; 第 1 2 部分 : 玉 米T 2 5 品系 ; 第13部分 :玉 米3272品系 ; 第 1 4 部分 : 玉米5 9 1 2 2 品 系 ; 第 1 5 部分: 大豆A 2 7 0 4 1 2 品 系 ; 第 1 6 部分 : 大豆A 5 5 4 7 1 2 7 品 系 ; 第 1 7 部分 : 大豆D P 3 5 6 0 4 3 品 系 ; 第 1 8 部 分: 大 豆 G T S 4 0 - 3 - 2 品系 ; 第 1 9 部分 : 大 豆 M O N 8 9 7 8 8 品 系 ; 第部分 :水 稻Bt-63品系 ; 第21部分 :水 稻KF6品系 ; 第22部分 :水 稻KF8品系 ; 第23部分 :水 稻KMD品系 ; 第 24部分 :水 稻LLR E62品 系 ; 第2 5 部分 : 水 稻M 1 2 品系 ; 第 2 6 部分 : 水稻T 1 G 1 9 品 系 ; 第27部分 :水 稻T2A1品系 ; 第 2 8 部分: 小麦B 7 3 6 1 品系 ; 第29部分 :甜 菜H71品系 ; 第30部分 :油 菜RT73品系。 本部分为SN/T3767的第部分 。 本标准按照GB/T1,109给出的规则起草 。 请注意本文件的某些内容可能涉及专利 。本文仵的发布机构不承担识别这些专利的责任 。 本部分 由国家认证认可监督管理委员会提出并归 口。 本部分起草单位 :中 华人 民共和国天津出人境检验检疫局 、 中国检验检疫科学研究 院、 中华人 民共 和国珠海出人境检验检疫局 、 中华人 民共和国广东出人境检验检疫局 、 广州迪澳生物科技有限公司。 本部分主要起草人 :贺 艳 、 刘伟 、 赵卫东 、 黄新 、 郑文杰 、 张裕君 、 陈颖 、 冯家望 、 李志勇 、 刘津 、 凌莉 、 石磊 。 sN/T3767.24-2014 出口食品中转基因成分环介导 等温扩增 (LAMP)检测方法 第 2 4 部分 : 水 稻L L R I C E 6 2 品 系 1 范围 SN/T3767的 本部分规定 了稻谷和大米 中转基因水稻LLRICE62品系特异性的环介导等温扩增 (LAMP)初筛检测方法 。 本部分适用于进出口的稻谷异性的定性检测 。 本方法的定性检测低限为0.5 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必日期 的引用文件 ,仅 注 日期 的版本适用于本文 件 。凡是不注 日期的引用文件 ,其 GB/T6682 分 析实验室用水 GB/T19495,2 转 基 因 产 品 GB/T19495.3 转 基 因 产 品 GB/T19495.7 转 基 因 产 品 检 测 SN/T2584 水 稻及其产品中 SN/T3767.22014 出 口 食AMP)检测方法 第2部分 :筛 选方法 3 防 污染措施 环介导等温扩增检测过程的 4 抽样与制样 按照 G B / T 1 9 4 9 5 . 7 的 规定执行。 5 核 酸提取纯化 按照 G B / T 1 9 4 9 5 . 3 的 规定执行。 6 LAMP检 测方法 6.1 原理 6.1.1 一般原理 根据转基因水稻LLRICE62品系外源基因和水稻边界序列设计特异性内引物 、 外引物和成环引物 1 本文件 。 抽样和制样 sN/T3767.24-2014 各一对 ,特 异性 目标序列和引物碱基序列参见附录 A。引物特异性识别 目标序列上的六个独立区域 ,利 用Bs莎酶启动循环链置换反应 ,在 水稻 品系 ILRICE62特异 目标序列启动互补链合成 ,在 同一链上互 补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物 ;从dNTP析出的焦磷酸根离子与反 应溶液中的Mg2+结合 ,产 生副产物(焦 磷酸镁)形 成乳 白色沉淀 ,加 人显色液 ,即 可通过颜色变化观察 判定结果 。 6,1.2 显色液显色原理 在LAMP反应体系中加人预先混合的钙黄绿素和锰离子 ,未 发生反应时锰离子与钙黄绿素结合 , 钙黄绿素的荧光被淬灭 ,呈 现橙色。当扩增反应发生时 ,扩 增过程中产生的焦磷酸根离子可与锰离子结 合 ,形 成不可逆的沉淀物 ,将 锰离子从钙黄绿素上释放下来 ,从 而使钙黄绿素恢复荧光 ,同 时体系中的镁 离子与钙黄绿素结合 ,进 一步加强钙黄绿素的荧光 ,可 在365nm紫 外光激发下散发 出约510nm的荧 光 ,颜 色也 由橙色转为绿色。 6,2 仪器和设备 6.2.1 超纯水发生器 。 6,2.2 水浴锅或加热模板 :63.00.5和80.0 0.5。 6 . 2 , 3 离 心管: 0 . 1 m L 、1 , 5 m L 。 6 . 2 . 4 移液器: 量 程 0 . 5 u L 1 0 u L ; 量 程 1 0 u L 1 0 0 u L ; 量 程 1 0 0 u L 1 0 0 0 u L 。 6.2,5 计时器 。 6.3 试剂和材料 除另有规定外 ,所 有试剂均为分析纯或生化试剂 。 6,3,1 实验用水 :应 符合GB/T6682中 一级水的规格 。 6 . 3 . 2 d N T P s 溶 液: 每 种核苷酸浓度 1 0 m m o l / L 。 6,3.3 B踮DNA聚合酶 :酶 浓度8U/uL,建议采用NEB的 Bs莎酶 ,或 者具有同等效力的酶 。 6 . 3 , 4 1 0 T h e r m o l P o l 缓冲液: 含 0 m m o l / L T o s H C l ( p H 值 为 8 , 8 ) 、1 0 0 m m o l / I 硫 酸铵、 1 0 0 m m o l / L 氯 化钾、 m m o l / L 硫 酸镁 、1 % T t o n 1 0 0 。 6 . 3 . 5 硫 酸镁溶液 : 5 0 m m o l / L 。 6 , 3 . 6 甜菜碱: 5 m o l / L 。 6 . 3 . 7 显 色液 : 钙 黄绿素荧 光染料, 0 . 3 1 2 m o l / L 。 6.3.8 引物 :根 据转基因水稻LLRICE62品系外源基 因和水稻边界序列设计一套特异性引物 ,包 括外 引物1(F3),外引物2(B3),内引物 1(P)、 内引物2(BIP)和环引物1(FLP)、环引物2(BIP)。 外引物扩增片段长度为226bp,序列信息见附录A。 内 弓u吻1(FIP,5,-3):AGCTGGCGTAATAGCGAAGAGAAACCAGGTGGACTAAAAGT 内 引 4勿2(BIP,5 -3 ):GCGAAAGGGGGATGTGCTGTGACTGGGAAAACCCTG 环引匆勿 1(FLP,5 -3 ):CAAGGCGATTAAGTTGGGTAAC 环 引 牛 勿2(BLP,5 -3 ):GCCCGCACCGATTATTTATG 夕卜 引 砷 勿1(F3,5 3 ):TGTAACACGCACACTCAC 夕卜 引 物 2(B3,5 -3 ):CTGGCCGTCGTTTTACAA 6.4 实验步骤 6,4.1 阴性对照、 阳性对照和空白对照的设置 6,4,1.1 阴性对照 : 2 sN/T3767.24-2014 采用不含有待测基因序列的植物基因组DNA为模板 。 6.4,1,2 阳 性对照 : 采用含有待测基因序列的植物DNA作为模板 。 6.4.1.3 设 两个空 白对照 : 提取 DNA时设置的提取空 白对照(以 水代替样品); LAMP反 应的空 白对照(以 DNA溶解液代替DNA模 板)。 6.4,2 内 源基因检测 为降低检测成本 、 避免无效操作 ,进 行LAMP检测应先进行 内源基因检测 ,检 测结果 阳性表明从样 品中提取出适宜进行LAMP检测的DNA,可以进行外源基因检测 ;否 则表明未能从样品中提取适宜进 行LAMP检测的DNA,应重新进行DNA提取和纯化 。内源基 因的检测参照SN/T3767.214的 规定进行 。 6,4.3 水 稻 LLRICE62品 系 LAMP反 应 体 系 LAMP反 应体系见表1。每个样 品各做2个平行管 。加样时应使样品DNA溶液完全加人反应液 中,不 要粘附于管壁上 。在反应体系配制完成后 ,将 1uL显 色液滴在管盖 内侧 ,盖 管盖时应小心 ,防 止 显色液混合进人反应液中。 表1 水稻LLRICE62品系LAMP反应体系 6.4.4 LAMP反 应 参数 6 3 , 0 o . 5 恒温扩增 6 0 m i n , 8 0 . 0 0 . 5 5 m i n 使 酶灭活, 反应结 束。 6.4.5 显色反应 反应结束后 ,立 即将显色液与反应液上下颠倒轻轻混匀 ,在 黑色背景下进行颜色观察 。 组 分 工作液浓度 力 口 样量/uL反应体系终浓度 T h e r m l P l 缓 冲液2.5l 环 引 物1(FLP) 10uhol/L1,0 0 , 4 u m d / L 环 引 物2(BLP) 10uml/L 0 , 4 u m o l / L 夕 卜 引物1(F3) 1 0 u m l / L0,5 0 , 2 u m l / L 夕 卜 引杉 口2(B3) 10uml/L0,5 0.2 pmol/L 内引物1(FIP)40umol/L1.6umol/L 内引物2(BIP) 40umol/L 1 , 6 u m o l / L dNTPs 10mmol/L 1,6mmol/I 甜菜碱 5mol/L 0.8mmol/L 硫酸镁 150mml/L1 6mmol/L B s 莎D N A 聚 合酶 8U/uL1 0,32U/uL DNA模板100 ng/pL 2 8ng/uL 水5.5 sN/T3767.24-2014 6,5 质 量控制 6.5.1 基 本原则 :实 验室中设置的各种对照LAMP检测结果应符合 以下情况。否则 ,任 一种对照如果 出现非下述正常结果 ,应 重做实验 。 6.5.2 空白对照 :反 应管中液体呈橙色 。 6.5.3 阴 性对照 :反 应管中液体呈橙色 。 6,5,4 阳 性对照 :反 应管中液体呈绿色 。 7 结果判断和确证 7.1 待 检样品2个平行样反应管 果为阴性 。 7,2 待 检样品2个平行样反应管 结果正常 ,可 判断该样 品检测结 验对照结果正常 ,可 判断该样 品 转基因水稻LLR E62品 系初筛阳性 ,还 应通过下证(见 附录A): 按 照 SN/T2584进 行实 时荧光PC 可用外引物 PCR扩增产物进见附录A。 8 结果表述 8.1 对LAMP检测结果为阴性水 稻L L R I C E 6 2 品系 。 品,应 按照确证实验情况进行结8.2 对 LAMP检测结果为转基因水稻LLRICE62品 性的样 果判 断和表述 。 sN/T3767.24-2014 附 录 A (资 料性附录) 转基因水稻LLRICE62品系基因序列 A,1 转 基因水稻LLRICE62品系外源基因和水稻边界序列(来 自Accession nc,JQ4068811) TGTAACACGC ACACTCACCT ACTTCCAAAG ATTTAGCGAT GTCTTACTGC TAACGGGTGC ATCG ACTA AAAGTATAAA TAATCGGTGC GGG TGCTGCAAGG CGA CGA AAGGGGGATG CC CAGTCACGAC GTTGTAAAAC GA A。2 引物碱基序 列及构成 FIP:5 -AGCTGGCGTAAT B1c AAAAGT-3 BIP:5 -GCGAAAGGGGGA FLP:5 -CAAGGCGATTAAG BLP:5 -GCCCGCACCGATTA F3:5 -TGTAACACGCACA B3:5 -CTGGCCGTCG 1 51 101 151 201 寸一0 寺卜z HHHHHHHHT s 中华人民共和国出人境检验检疫 行 业 标 准 出口食品 中转基 因成分环介导 等温扩增 (LAMP)检测方法 第2 4 部分 : 水 稻 L L R I C E 6 2 品 系 sN/T3767,242

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