17β-雌二醇和运动对去卵巢大鼠后肢骨组织PPARγ蛋白表达的影响.pdf

论 著 17 - 雌二醇和运动对去卵巢大鼠后肢骨组织 ppar蛋白表达的影响 陈永杰 ， ，沈 红，卜淑敏 （ 北京农学院动物科学技术系，北京 ； 首都体育学院科研处，北京 ） 中国图书分类号：- ； ； ； ； ； 文献标识码： 文章编号： （） 摘要：目的 观察 - 雌二醇（）和运动对去卵巢大鼠后 肢骨组织过氧化物酶体增殖物激活受体 （ ）蛋白表 达和骨髓脂肪细胞的影响。 方法 成年性未经产 收稿日期： ，修回日期： 基金项目：国家自然科学基金资助项目（ ）；北京市教委 科技发展规划资助项目（ ） 作者简介：陈永杰（ ），男，硕士生，研究方向：兽医药理学， - ： ； 卜淑敏（ ），女，博士，教授，研究方向：运动医学，通 讯作者，： - ；- ： 大鼠 只，经双侧卵巢切除手术或假手术 后， 按体 重随机分为假手术、去卵巢、去卵巢运动和雌激素 个组。 运动组每周进行 次 、速度 、坡度 的 跑台训练。 雌激素组每周颈部皮下注射 次，剂量为 。 实验结束后， 染色观察股骨和胫骨形态学变 化， 检测骨组织 蛋白的表达量。 结果 去卵巢组股骨远端和胫骨近端的骨髓腔脂肪空泡数目以及 股骨 蛋白表达高于假手术组、去卵巢运动组和雌激 素组。 结论 与运动能改善去卵巢大鼠的骨组织学结 构，其机制可能部分是与抑制去卵巢大鼠骨组织 蛋 白的表达和抑制骨髓脂肪分化有关。 关键词： - 雌二醇；运动； ；去卵巢大鼠；骨质疏松； 骨髓干细胞 ， med j qilu，20（）： 李卫晖，李凌江 精神应激与冠心病的发病机制 中国心理 卫生杂志，18（）： ， - chin mental health j，18（）： 李卫晖，李凌江 辩证地探讨精神应激与冠心病的关系 医 学与哲学，26（）： ， med philos，26（）： ： - brain behav immun，16： ， ， ， - med hypotheses，72（）： 李玉洁，杨 庆，朱晓新 抗炎 中药治疗动脉粥样硬化的有 效途径 世界科学技术 中医药现代化，9（）： ， ， ： - world sci technol- mod tra- dit chin med，9（）： 李玉洁，杨 庆，朱晓新 基于炎症反应的 提取物防治 作用研究 提取物对 模型家兔血管病理形态、脂质 代谢的影响 中国中药杂志第九届编委会论文集，8： ， ， - - - symp theditorial board meet china j chin ma- ter med，8： activating blood circulation and disintoxication a new exploration in atherosclarosis intervention by chinese medicine - ， ， - ， ， - （institute of chinese materia medica，china academy of tcm science，beijing ） abstract （）， （） ， - - - - ， - “ ， ” - “- ， - ”， “- ” “ ”， - ， - - - ， key words： ； ； ； ； ； 中国药理学通报 chinese pharmacological bulletin ；26（）： 女性进入绝经期后，由于卵巢功能逐渐衰竭，体 内雌激素（， ）水平下降，骨生成和骨吸收 代谢失衡，易导致骨质疏松症的发生 。 去卵巢大 鼠是目前国内外通用的模拟绝经后骨质疏松症发生 的理想动物模型 ， 。 虽然 和运动均能改善去 卵巢大鼠骨量的丢失且已明确 的改善机制与抑 制破骨细胞激活有关 ，但 和运动与骨髓干细 胞向成脂和成骨细胞分化待探讨，特别是运动的影 响。 过氧化物酶体增殖物激活受体 （ ， ）属核激素受体 超家族， 共有 种亚型 （ 、 、 ） 。 近年来发现 ，在骨髓干细胞向成脂 和成骨细胞分化过程中起着关键作用，而 是 否参与 和运动防治绝经后骨质疏松的发生目前 还未见报道。 鉴此，本实验采用我们实验室前期建 立的 和中等强度跑台运动改善去卵巢大鼠骨量 丢失的模型 ，进一步观察了 和中等强度跑台 运动对去卵巢大鼠后肢骨组织形态学和 蛋 白表达的影响，旨在为探讨运动和 防治绝经后骨 质疏松发生的分子机制提供实验依据。 1 材料与方法 1 1 主要试剂及仪器 - （， - ，）；抗体（- ）；山羊抗兔 碱磷酶标记抗体（ ，中杉金桥生物技术有 限公司分装）；- - （- ，中杉金桥 生物技术有限公司分装）；碱磷酶底物 显色浓缩液（中杉金桥生物技术有限公司）； 蛋白裂解液（，碧云天）；- 蛋白上 样缓冲液（，碧云天）；- 小动物跑台 （杭州段氏制造厂生产）； - 离心机（北京离 心机厂）； 切片机（，德国）；显微镜（- ）；电泳仪（- 型，北京六一仪器厂）。 1 2 实验动物及其分组 健康 性未经产 大鼠 只， 体重（ ） ， 购自北京维通利 华实验动物有限公司并在北京大学医学部实验动物 中心饲养动物合格证号 （京）- 。 适应饲养 后，随机分为假手术组（， 只） 和手术组（ 只）。 大鼠禁食 ，按体重腹腔注射 体积分数为 的水合氯醛（ ）麻醉，手 术组从背部切除双侧卵巢，假手术组不切除卵巢，而 将卵巢旁与卵巢等大的脂肪组织切除。 后按 体重将手术组大鼠又随机分为去卵巢组（）、去 卵巢运动组（）和雌激素组（），每组 只。 1 3 运动训练和给药方案 手术后恢复 ，雌 激素组大鼠每周按体重颈部皮下注射 - 雌二醇 次，注射剂量为 ，持续给药 。 去 卵巢运动组大鼠开始在小动物跑台上适应训练 ，然后每周进行 次，跑速 ，时间 ，坡度 的正式训练，持续训练 。 1 4 取材 最后一次运动训练或给药 后，称 量体重，以水合氯醛麻醉，游离双后肢股骨和胫骨， 去尽周围结缔组织，将左侧后肢湿纱布包裹后 冻存；将右侧一半后肢投入质量分数为 多聚甲醛溶液中固定，另一半液氮冻存，以提取总蛋 白。 1 5 骨组织石蜡切片和 he 染色 经 多聚甲 醛固定后的股骨远端和胫骨近端组织块，用质量分 数为 的乙二胺四乙酸（）于 条件下脱 钙，每 天更换一次脱钙液。 经针刺法检验脱钙完 全后（组织很容易被刺透而且不感到阻力），常规石 蜡包埋。 每组随机取 只大鼠的股骨远端和胫骨近 端进行连续切片（ ），切片经常规 染色后， 在光学显微镜（ ）下观察拍片。 随机 取每只大鼠股骨远端和胫骨近端 染色照片 张，每张片子随机选取 个高倍镜（ ）视野，统 计视野内脂肪空泡数目。 1 6 western blot 取 股骨远端骨组织在 液氮中研磨成粉末，加入 组织裂解液， 离心 ，取上清，留一部分检测 蛋白质浓度，其余蛋白样品与 - 蛋白上样 缓冲液（ ），按照 混匀，沸水煮 ， 分装 后 保存。 取蛋白样品 上样， 以 电 压， 在 的 - 聚丙烯酰胺凝胶中分离约 后， 以 电压转移 。 在质量分数为 脱脂 奶粉室温封闭 ， 将 膜与一抗（- - ，- ； - - ，- - ） 过夜，次日 洗 ，分别加马抗小鼠 碱磷酶标记和山羊抗兔 碱磷酶标记二抗 室温孵育 ， 洗 ，在 显 色液中显色至条带出现， 放入水中终止显色，拍照， 扫描各条带灰度值。 1 7 统计学处理 采用 畅 统计软件处理数 据，实验结果以珋x s 表示，组间差异显著性采用方 差分析的 （ ）。 2 结果 2 1 17 - 雌二醇和运动对去卵巢大鼠股骨远端和 胫骨近端组织形态学的影响 由股骨远端（ ） 和胫骨近端（ ） 染色照片可知，假手术组股 骨远端和胫骨近端骨小梁排列完整且紧密，骨髓中 有少量的脂肪空泡；去卵巢组骨小梁断裂严重，骨髓 中国药理学通报 chinese pharmacological bulletin ；26（） z 2p0axe x v 3 0 0 寸0 0 一鼍d目pcho毛_鼍皇。暮一o=q4童兰嗥白暑i 中充满脂肪空泡，脂肪空泡数目高于假手术组（p 畅 ）；与去卵巢组相比，去卵巢运动组和雌激素组 的骨小梁数目增多，但仍有断裂，脂肪空泡数目减少 （p 畅 ），但与假手术组相比仍有差异（p 畅 ）。 fig 1 exercise and e2induced changes in the morphology of distal femur detected by he staining ： ： - （ ） 倡倡p 畅 vs ；p 畅 vs 2 2 17 - 雌二醇和运动对去卵巢大鼠股骨远端 ppar 蛋白表达的影响 由 可知，去卵巢组 股骨远端 蛋白表达量高于假手术组（p 畅 ），而去卵巢运动组和雌激素组 表达量 低于去卵巢组（p 畅 ）。 此外，去卵巢运动组 蛋白表达量低于雌激素组（p 畅 ）。 fig 2 exercise and e2induced changes in the morphology of proximal tibia detected by he staining ： ： - （ ） 倡倡p 畅 vs ；p 畅 vs 3 讨论 骨吸收与骨形成的代谢失衡，被认为是引起骨 质疏松的主要原因，通过纠正骨代谢失衡能达到防 治骨质疏松的目的。 除子宫 和乳腺 以外，骨也 是 发挥调节作用的重要靶器官之一，因为在成骨 中国药理学通报 chinese pharmacological bulletin ；26（） b l v b a 2 p 钔玎0 a xe x v8 p 甘0 人x o e 了 8 皿 旷 r 唧 fbv冒二oo一三f。一日。一b_罟。玎 ， 驴 fig 3 exercise and e2induced changes of pparprotein expression in distal femur samples ： - ： 倡倡p 畅 vs ；p 畅 vs 细胞和破骨细胞中均有雌激素受体（）的存在， 能通过 调节成骨细胞和破骨细胞活性来发挥其 骨保护作用 ，这也就是补充外源 能防治绝经 后骨质疏松的主要原因。 近年来的研究发现 ，绝经后骨质疏松发生过 程中伴随有骨结构的明显变化。 等 报道， 绝经后骨质疏松发展过程中，患者的部分骨髓组织 逐渐被脂肪组织所替代，骨小梁断裂，数目减少，脂 肪细胞增多、体积增大，表现为典型的骨质疏松显微 结构退化，这与我们本实验在去卵巢大鼠组织形态 学中观察到的结果一致。 即大鼠去卵巢后骨小梁断 裂，数目减少，骨髓腔中的脂肪空泡增多。 而去卵巢 大鼠经 处理后，骨小梁数目增加，脂肪空泡数目 减少。 提示 能改善去卵巢大鼠的骨组织学结构 且有可能与抑制去卵巢大鼠骨髓细胞向脂肪细胞的 分化有关。 运动能够提高骨量已被证实 ，有报道认为运 动或机械负荷的力学刺激使成骨细胞增殖和分化增 加，引起骨生成增加 。 本实验中，去卵巢大鼠经 运动处理后，骨小梁数目增加，脂肪空泡数目减少。 提示运动也能改善去卵巢大鼠的骨组织形态学结 构， 其机制可能也与去卵巢大鼠骨髓细胞向脂肪细 胞的分化被抑制有关。 研究表明，与年龄相关的骨量丢失主要是由于 骨髓基质干细胞 （ ， ）逐渐向脂肪细胞系分化，结果导致成骨 细胞数量不足。 青年人和动物的中轴和四肢骨骼里 面的成骨细胞占主要比例，而到了老年基本被脂肪 细胞替代 。 是脂肪分化的关键因子， 参与 向脂肪细胞的分化，是脂肪细胞分化的 早期标志， 剂量不足时引起脂肪分化受阻和 成骨发生增强，表明 表达增加可能是 向脂肪细胞形成增加和向成骨细胞形成减少的动 力 。 与运动能否通过作用于 蛋 白的表达而抑制成脂发生值得研究。 近来已有研究证实 能够调控 向成骨 细胞分化，当缺少 时，骨髓 高表达 ， 补充 后能减少 的表达和脂肪形成 。 说明 与 的表达存在有直接关系。 本实验 的 结果显示，大鼠去卵巢后，蛋 白表达量升高，经 处理后，蛋白表达量明 显低于去卵巢组。 提示，能改善去卵巢大鼠骨组 织的结构，其机制可能部分与抑制去卵巢大鼠骨组 织 蛋白的表达有关。 体外研究表明 ， ，培养在高脂培养基里的 间充质干细胞能高表达 和脂联 素的 和蛋白，脂质不断在细胞里蓄积。 每天 用机械牵张力连续作用于细胞 后，和脂 联素的 和蛋白表达下降和，同时能 促进成骨细胞的增殖，说明机械张力诱导的成骨发 生与 下调有关。 本实验的 结果 显示，运动处理能降低去卵巢大鼠股骨 蛋白 的表达量，且运动组 蛋白表达量与 组相 比差异有显著性（p 畅 ）。 提示运动不仅能抑制 去卵巢大鼠骨组织 蛋白表达，而且其作用较 更明显。 这首次在体内证实了，运动和 对去 卵巢大鼠骨组织 蛋白表达具有调控作用。 与运动能改善去卵巢大鼠骨组织的结构，其 机制可能与去卵巢大鼠骨组织 蛋白的表达 和骨髓脂肪分化被抑制有关。 参考文献 ， ， ， - wien med wochenschr，159（ ）： bone miner，15（）： 李延平，刘 义，吴科锋，等 骨元肽结肠溶胶囊对去卵巢大鼠 骨质疏松症的防治作用 中国药理学通报，24（）： 中国药理学通报 chinese pharmacological bulletin ；26（） ， ， ， - chin pharmacol bull，24 （）： 李亚义，张 凡，卜淑敏中等强度运动与雌激素对去势雌性 大鼠骨代谢的影响 中国热带医学，9（）： ， ， - china trop med，9（）： ， - ， - - （） - fund clin pharmacol，21（）： ， - ， ， ： ， ， crit rev eukaryot gene expr， 19（）： 杨丽娜，段 颖，张英福，等 雌激素及植物雌激素对去卵巢大 鼠子宫组织 表达和形态的影响 中国药理学通报， ，25 （）： ， ， ， chin pharmacol bull，25 （）： 张 华，李红芳，杨丽娜，等 雌激素及植物雌激素对去卵巢大 鼠乳腺组织形态和 亚型表达的影响 中国药理学通 报，24（）： ， ， ， - chin pharmacol bull，24 （）： ， ， ， - mol cell endocrinol，291（ ）： ， arthriti