临床PCR检验标本的处理、保存及核酸提取方法.ppt

临床PCR检验标本的处理、 保存及核酸提取方法,卫生部临床检验中心 李金明,临床标本的正确采集、运送、保存 的重要性,临床检验的质量保证关键性环节 解决涉及实验室检验的医患纠纷的方法之一,核酸提取的重要性,核酸提取是临床PCR检验最为关键的部分，亦是手式操作的主要部分 核酸提取的成败关系到临床PCR检验的正确与否 临床PCR检验操作中最易出问题的环节,标本采集,标本采集时间对扩增检测结果的影响 标本采集部位的准备 标本的类型和采集量 采样质量的评价 采样及运输容器 标本采集中的防污染,标本运送,样本一经采集，则应尽可能快的送至检测实验室。 样本中如加入了适当的稳定剂,如用于RNA测定加入GITC的血清(浆)样本和用于DNA测定的EDTA抗凝血等,则可在室温下运送或邮寄。 实验室应根据待测靶核酸的特性，对各种临床样本的运送条件作出相应的规定。,临床标本的处理和保存,血清（浆） 全血 外周血单个核细胞 痰 棉拭子 脓液 体液 乳汁 组织,血清（浆）,DNA测定，可按照一般的血清标本处理程序，对测定影响不大。 RNA测定，标本的获取和保存方式对测定结果，可能有决定性影响。最好是使用EDTA抗凝(严禁使用肝素，因其对PCR扩增有抑制，且很难在核酸提取过程中完全去除)全血标本，抗凝后6小时内分离血浆，如使用血清标本，则需尽快(2小时内)分离血清，标本的短期（12周）保存可在-20下，较长期保存应在-70下。,全血,以全血作为待测标本时,必须注意抗凝剂的选择,一般使用EDTA-Na2或枸椽酸钠,不可使用肝素。 全血样本如用于DNA提取检测,可4下短期保存,如用于RNA检测，则应在取血后，尽快提取RNA 。,外周血单个核细胞,外周血单个核细胞可从抗凝全血制备，主要有两条途径，一是使用淋巴细胞分离液分离制备；二是使用红细胞裂解液,裂解全血中的红细胞,经生理盐水数次洗涤,即可得到单个核细胞。 外周血单个核细胞如暂不提取核酸,可保存于-70下.,痰,痰属于分泌物,临床上常用作为结核杆菌DNA测定标本。 痰标本中含有大量粘蛋白和杂质,故在核酸提取时,需对样本进行初步处理，即用1 mol/L NaOH或变性剂液化。 如用于非结核杆菌如肺炎支原体的PCR检测，痰标本只能室温悬浮于生理盐水中，充分振荡混匀，促使大块粘状物下沉，取上清离心，所得到的沉淀物即可用于核酸提取。 液化标本如不立即用于核酸提取,可保存于-70下。,痰标本处理的基本模式,通用模式 简单模式,痰标本处理通用模式,试剂：（1）通用标本处理（Universal sample processing, USP）溶液：由4-6 mol/L盐酸胍（GuHCl），50 mmol/L Tris-HCl, pH7.5, 25 mmol/L EDTA, 0.5%Sarkosyl和0.10.2 mol/L -巯基乙醇。（2）0.05%Tween 80。（3）10%Chelex-100( 含0.03% Triton X-100和0.3% Tween 20),痰标本处理简单模式,试剂：（1）裂解液:含终浓度0.1 mol/L NaOH、50g蛋白酶K和0.05% Triton X-100,痰标本处理中要注意的问题,痰标本在没有加入内标以控制假阴性的情况下，不能采用异硫氰酸胍盐（GuSCN）方法提取。采用这种方法提取，有可能会在提取过程中，出现一种可修饰DNA的酶，在最后一步提取中，与核酸一起洗提出来，从而抑制其后的扩增。 在PCR主反应混合液中，加入-酪蛋白（alpha-casein）、白蛋白等，有防止此类抑制物产生的效果。,棉拭子,在使用PCR方法检测性病病原体时,临床标本一般为棉拭子,可将棉拭子置于适量生理盐水中,充分震荡洗涤后,室温静置510分钟,待大块状物下沉后,取上清立即离心,其后的沉淀即可用于DNA提取。 如不立即用于核酸提取,则需保存于-70下.,脓液,脓液的处理依情况而定,如用于分枝杆菌(如结核杆菌)核酸测定的标本,粘稠的脓液可采用痰标本的处理模式，先进行液化，再离心取沉淀提取DNA；水样的脓液则直接离心,沉淀用生理盐水洗23次后,即可用于DNA提取。 对于用于非分枝杆菌测定的脓液标本,如过于粘稠,则加入适量生理盐水,充分振荡后,静置,取上清立即离心,沉淀用于DNA提取;如为水样,则按上述直接离心取沉淀即可。 沉淀标本的保存条件同样为-70。,体液,临床体液标本包括胸水,腹水,脑脊液,尿液等,可按水样标本的方式离心取沉淀后,提取核酸。沉淀样本的保存同上。,乳汁,乳汁有时也可作为标本，如乳汁中HBV DNA、HCV RNA、结核分枝杆菌和布鲁氏菌等的PCR检测。,乳汁中布鲁菌DNA的提取,试剂准备 NET缓冲液: 50mmol/L NaCl, 125mmol/L EDTA, 50mmol/L Tris-HCl pH7.6; 24%十二烷基硫酸钠（SDS）; 蛋白酶K; RNase。,乳汁中分枝杆菌DNA的提取,试剂准备 裂解液：50 mmol/L Tris-HCl，10 mmol/L EDTA, 2% Triton X-100, 4 mol/L 异硫氰酸胍盐（GITC）, 0.3 mol/L 醋酸钠。 玻璃珠：（直径：425-600um）,组织,组织有新鲜组织块和石蜡切片。新鲜组织块的处理步聚首先用生理盐水洗两次,然后将其捣碎或切碎，加入生理盐水后剧烈震荡混匀,离心，弃上清，再用蛋白酶K消化后提取核酸。新鲜组织最好是保存于50%乙醇中,具体作法是，先用生理盐水将组织洗一次,切成宽度小于1cm的小片,加入适量的生理盐水,然后,边摇边加入无水乙醇至终浓度为50%.这样固定的组织标本室温下可保存数日,4可保存6年。 石蜡切片用于核酸提取,需先用辛烷或二甲苯脱蜡,再用蛋白酶K消化后即可进行DNA提取。,临床标本的滤纸上保存,临床标本置于经过处理的滤纸片上，如靶核酸为DNA，可室温保存数月至数年，如靶核酸为RNA，则可稳定数周。 保存在滤纸上的标本，保存时间长，还可因为标本中的PCR抑制物如血红蛋白、酶、免疫球蛋白等吸附于滤纸上，而不对后面的扩增检测造成影响。 不管是全血、血清（浆）。还是尿液、粪便、分泌物等均可此种方法。,临床标本中PCR反应抑制物,内源性的 :免疫球蛋白、蛋白酶、血红素及其代谢产物、白细胞内的乳铁蛋白、肌红蛋白、脂类、粘蛋白、尿素、离子、胆盐、多糖等。 外源性的 :如肝素抗凝剂、纤维素和硝酸纤维素、过度UV照射后的矿物油、手套滑石粉、标本容器或采样器材上含有的抑制物。,肝素的作用机理,肝素对MLV逆转录酶和TAQ DNA聚合酶均很强的抑制作用，如果临床标本为肝素抗凝，则在核酸纯化过程中，标本中的肝素可结合于DNA和RNA上，尽管肝素和核酸本身都带正电荷。 对标本进行煮沸、凝胶过滤、酸碱处理后凝胶过滤、反复乙醇沉淀等均不能去除肝素的这种干扰作用。 每g核酸标本中加入0.1U的肝素,即可100%的抑制酶活性。 在标本中加入肝素酶I 或13 U/g核酸(于5 mM Tris pH7.5, 1 mM CaCl2, 40 U RNasin 25 2小时) 可去除肝素的抑制作用。,血红蛋白、乳铁蛋白（lactoferrin）,血红蛋白和乳铁蛋白分别是红细胞和白细胞内的主要PCR抑制物,它们均含有铁。 抑制机制可能是：（1）与这些蛋白释放铁离子至PCR混合物中有关。研究铁的抑制效应时，发现其干扰DNA合成，而且胆红素、胆盐和氯化高铁血红素（Hemin）等血红蛋白衍生物，也是PCR抑制物。（2）亚铁血红素(Heme)可通过返馈抑制调节DNA聚合酶活性及协调红细胞内血红蛋白成分的合成。也观察到，氯化高铁血红素通过直接作用于DNA聚合酶，与成为一个与靶DNA竞争的抑制剂和核苷酸的非竞争性抑制剂 。（3）由于靶核酸DNA被血液中大量的凝血有机物质包裹所致，使得靶DNA不能接触DNA聚合酶。,血红蛋白,1%(V/V)血液可完全抑制Taq酶活性，与Mg2+浓度无关。Tth聚合酶在含4%（V/V）血液的PCR反应混合液中可以进行扩增，加入1U单链DNA结合蛋白T4基因32蛋白(gp32)，Tth聚合酶在含8%（V/V）血液情况下，仍可扩增。因此，使用Tth聚合酶和gp32蛋白，可实现从临床标本不提取纯化核酸直接扩增靶DNA。 不同的热稳定的DNA聚合酶对临床标本中的抑制物的敏感性不一样 。,IgG,IgG的抑制作用是由于其与单链DNA的相互作用，使得靶DNA不能与DNA聚合酶相互作用 使用煮沸作为标本处理方法或使用PCR前的热启动,将增强IgG对PCR反应的抑制,去除或减轻抑制的一些方法,NaOH处理可中和临床标本中的Taq DNA聚合酶抑制剂，但这种方法不适用于DNA含量低的标本，因为NaOH处理可使DNA大量丢失。,去除或减轻抑制的一些方法,加入0.6% (wt/vol)牛血清白蛋白（BSA）可降低血液对Taq DNA聚合酶的抑制效应，既使在2%（vol/vol）血液存在下亦可成功扩增，而通常血液含量只能是0.2%。 BSA也可增加rTth或Taq DNA聚合酶的扩增能力，使其对粪便和肉类标本中抑制物的抵抗能力分别提高10和20倍。 单链DNA结合T4基因32蛋白（gp32）有类似BSA的增强效应。,核酸纯化,核酸分离纯化技术起源于二十世纪五十年代，在七十年代和八十年代中传统的核酸沉淀溶解分离纯化方法得到了普遍的应用和推广。 传统的核酸提取方法常涉及去垢剂裂解、蛋白酶处理、有机溶剂提取及乙醇沉淀等步骤。,一般核酸提取试剂促使靶核酸从细胞内释出的原理,靶核酸可以与宿主细胞整合，核内游离及胞浆内各种构形存在于细胞内，如测定的是病原微生物,则靶核酸存在于细菌、病毒、原虫或真菌细胞内，如果上述细胞破裂,则靶核酸亦可存在于细胞外。 一般均使用去垢剂(如Triton-100)裂解细胞，用一种蛋白裂解酶(如蛋白酶K)消化结合于核酸的蛋白质，从而将靶核酸从细胞内释放出来。,核酸的分离纯化,核酸的分离纯化就是要将蛋白、脂类等干扰核酸扩增的物质去除。 经典方法 硅吸附法 对于商品核酸提取试剂盒，临床实验室在使用前，必须对其核酸提取纯度和效率进行评价。,DNA提取的经典方法,即所谓的”酚-氯仿提取法”,RNA提取的独特性,临床标本及实验室环境中,存在大量对RNA具有强烈降解作用的RNase，而RNase较耐高温,不易失活。 如何避免RNase对标本的污染及防止RNase对提取的RNA的降解,是保证RNA成功提取的关键之所在。,RNA提取所用器皿的处理,经高压灭菌的一次性使用的塑料制品如试管,离心管等基本上无RNase,可以不经预处理直接用于制备和贮存RNA. 实验室用的普通玻璃器皿经常有RNase污染,使用前必须于180干烤8小时以上,或用0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)的水溶液浸泡用于制备RNA的烧杯,试管和其它用品。 DEPC是RNase的强烈抑制剂。灌满DEPC的器皿于37下放置2小时，然后用灭菌水淋洗数次，并于100干烤15分钟，最后高压蒸汽下15分钟。上述处理可除去器皿上痕量的DEPC,以防DEPC通过羧甲基化作用对RNA的嘌呤碱基进行修饰。,RNA提取所用溶液的准备,对于RNA提取所需溶液的配制,必须用高压灭菌的水和RNA研究专用的化学试剂配制溶液,用干烤过的药匙称取试剂,将溶液装入无RNase的玻璃器皿。可能的话,溶液均应用0.1%DEPC于37至少处理12小时,然后于100加热15分钟或高压蒸汽灭菌15分钟。 须注意的是,DEPC可与胺类迅速发生化学反应,因此不能用来处理含有Tris一类的缓冲液,因此可存几瓶新的,未开封的Tris试剂以制备无RNase的溶液。,RNA提取中RNase 污染的控制,实验操作人员的手是RNase污染最主要的潜在来源。 策略是： 在准备用于RNA纯化的实验材料和溶液时,以及在涉及RNA的整个提取操作过程中,都应戴一次性手套。 在RNA提取实验中，应勤换手套。,RNA提取的常用方法,表面活性剂加蛋白酶K，氯仿-酚抽提法。 胍盐提取结合氯仿-酚抽提法。 胍盐提取结合玻璃粉、二氧化硅等颗粒悬浮吸附法等。,异硫氰酸胍（GuSCN）结合氯仿-酚提取法,核酸提取的改良方法,旋转离心柱（SPIN COLUMN）方法 玻璃粉吸附法 二氧化硅（Se）或硅藻吸附法 微量全血核酸提取法 ：NaI 方法 其它方法：疏水性Immobilon-P膜 、全自动核酸纯化仪,旋转离心柱（SPIN COLUMN）,属于硅吸附方法的一种。在原理上现行的旋转离心柱系统通常可分为三个部分：第一部分是利用裂解液促使细胞破碎，使细胞中的核酸释放出来；第二部分是把释放的核酸特异地吸附在特定的硅载体上，当然这种载体只对核酸有较强的亲和力和吸附力而对其它的生化组分如蛋白质、多糖、脂类则不相亲和也不吸附；第三部分是把吸附在特定载体上的核酸洗脱下来，从而得到纯化的核酸。,玻璃粉吸附法,二氧化硅（Se）或硅藻吸附法,使用NaI的微量全血核酸提取法,靶核酸提取的质量,纯化的靶核酸的完整性：可使用凝胶电泳将样本的核酸提取物与一核酸标准比较测定。 核酸提取的产率：可在A260读数测定。 核酸纯度：可通过提取物A260/A280比率判定 血清或血浆中病原体核酸纯化纯度：采用一种间接的方法，即使用已知病原体含量的