SN∕T 3507-2013 进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别 PCR法和实时荧光PCR法.pdf

书书书 ? 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 ? ? ? ? ? ? ? ? 进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别 ? ? ?法和实时荧光? ? ?法 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?发布? ? ? ? ? ? ? ? ? ?实施 中华人民共和国 国家质量监督检验检疫总局 发 布 书书书 前?言 ?本标准按照 ? ? ? ? ? ?给出的规则起草? 请注意本文件的某些内容可能涉及专利?本文件的发布机构不承担识别这些专利的责任? 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出? 本标准起草单位? 中华人民共和国福建出入境检验检疫局? 本标准主要起草人? 邵碧英? 林志武? 陈文炳? 缪婷玉? 彭娟? 柯家骥? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 进出口纺织品中山羊绒和绵羊毛的鉴别 ? ? ?法和实时荧光? ? ?法 ?范围 本标准规定了纺织品中山羊绒? 绵羊毛鉴别的? ? ?和实时荧光? ? ?方法? 本标准适用于纺织品中山羊绒? 绵羊毛? ? ?法和实时荧光? ? ?法的定性鉴别? ?规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的?凡是注日期的引用文件? 仅注日期的版本适用于本文 件?凡是不注日期的引用文件? 其最新版本? 包括所有的修改单? 适用于本文件? ? ? ? ? ?分析实验室用水规格和试验方法 ? ? ? ? ? ? ?转基因产品检测?实验室技术要求 ?术语和定义 下列术语和定义适用于本文件? ? ? 聚合酶链式反应? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 一种模拟天然? ?复制的体外扩增法? 在? ?聚合酶催化下? 以母链? ?为模板? 以特定引物 为延伸起点? 以?种单核苷酸? ? ? 为底物? 通过变性?退火?延伸的循环反应? 使极少量的? ?的 特定片段? 在短短几小时内扩增上百万倍? ? ? 实时荧光? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 在? ? ?反应体系中加入荧光基团? 利用荧光信号积累实时监测整个? ? ?进程? 最后通过曲线对未 知模板进行定量或定性分析的方法? ?缩略语 下列缩略语适用于本文件? ? ? ? 碱基对? ? ? ? ? ? ? ? ? ?值? 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 脱氧核糖核酸? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 二硫疏糖醇? ? ? ? 脱氧核苷酸三磷酸? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?原理 用试剂盒法提取样品 ? ?针对山羊? 绵羊的线粒体 ? ? 序列设计引物和探针? 通过单一? ? ? 实时荧光? ? ?技术? 对? ?中的山羊成分? 绵羊成分分别进行特异性扩增? 根据实验结果? 判定该样 品中是否含有山羊绒? 绵羊毛? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?试剂 ? ?实验用水应符合? ? ? ? ? ?中一级水的规格? ? ?组织和毛发提取试剂盒? 与 ? ? ? ?系统结合使用? ? 参见附录 ? 中 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?聚合酶? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 其他稳定剂和增强剂? ?保存? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 见? ? ? ? ?或? ? ?乙醇? ? ?琼脂糖? ? ?溴化乙锭? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?溶液? ? ? ? ? ? ? ? ? ?缓冲液? ?仪器与设备 ? ? 冰箱? ? ? ? ?天平? 感量? ? ? ? ? ?分析研磨机? ? ? 剪刀? ? ?微孔干浴器或水浴锅? ? ?瞬时离心机? ? ?涡旋仪? ? ? ?磁分离架? ? ?微量可调移液器及枪头? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?离心管? ? ? ? ? ?薄壁管? ? ? ?实时荧光? ? ?光学反应管? ? ? ?超净工作台? ? ? ? ? ?仪? ? ? ?实时荧光定量? ? ?仪? ? ? ?电泳装置? ? ? ?凝胶成像仪? ?取样 纱线? 从不同的管纱? 筒纱或绞纱上随机取样? 共取约?的纱样? 织物? 从不同位置剪取? 共取约?的织物? ?给出这一信息是为了方便本标准的使用者? 并不表示对该产品的认可?如果其他等效产品具有相同的效果? 则 可使用这些等效产品? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?制样 用剪刀将样品剪碎? 经分析研磨机打散? 混匀? 再用剪刀尽量剪碎至纤维长度? 再次 用分析研磨机混匀? ? ? ? ?的提取 ? ? ?称取约? ?试样? 放入? ?离心管中? 每个样平行提取?管? 加? ? ? ? ? ? ? ? 和 ? ?蛋白酶?储存液? 混匀? ?温浴过夜? ? ? ?加? ? ?裂解液? 上下颠倒混匀? 瞬时离心? 将上清液移至新的? ?离心管中? ? ? ?加?完全悬浮的? ? ? ?树脂? 高速涡旋振荡? 室温放置? ? ? ? ? ? ?将离心管高速涡旋振荡? ? 将离心管置于磁分离架上? ? ? ?待磁珠完全吸附至管壁后? 小心吸去溶液? 加入? ? ? ?裂解缓冲液? 高速涡旋振荡? 将离心管 置于磁分离架上? ? ? ?吸去裂解液? 加入? ? ?洗涤液? 高速涡旋振荡? ? 将离心管置于磁分离架上? 加? ? ?洗 液重复洗涤?次? 尽可能吸尽最后一次的洗涤液? ? ? ?打开盖子? 风干? ? ? ? ? ?加入? ?洗脱液? 高速涡旋振荡? ? ? ?温浴? ? ? ? ? ?取出离心管? 高速涡旋振荡? ? 置于磁分离架上? 小心吸取溶液? 即? ?溶液? 于新的? ? 离心管中? ?保存备用? ? ? ? ?的鉴别 ? ? ?质量控制 进行? ? ? 实时荧光? ? ?鉴别时设置阳性对照? 阴性对照和空白对照?阳性对照? 扩增山羊成分 时用山羊绒 ? ? 扩增绵羊成分时用绵羊毛 ? ?阴性对照? 扩增山羊成分时用非山羊绒 ? ? 扩增 绵羊成分时用非绵羊毛? ?空白对照? 实验用水? ? ? ? ? ?法 ? ? ? ?引物 所用引物信息见表? 用 ? ?溶液? ? ? 稀释至? ? ? ? ? ?保存备用? 表? ? ?扩增所用引物 扩增成分引物名称引物序列 退火温度 ? 产物大小 ? ? 内参基因 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 山羊 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 表? ? 续? 扩增成分引物名称引物序列 退火温度 ? 产物大小 ? ? 绵羊 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?反应体系 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?引物各? ? ? ?模板? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?反应条件 ? ? ? ? ? ? 退火温度? 表? ? ? ? ? ?个循环? ? ? ? 注?不同仪器可根据仪器要求将反应参数作适当调整? ? ? ? ? ? ?产物的检测 将适量? ? ?稀释成? ? ? ?溶液? 配制? ?琼脂糖凝胶?取? ? ? ?产物? 点样进行电 泳? 并加? ? ? ? ? ? ? ?点样以判断? ? ?产物的片段大小?电压大小根据电泳槽长度来确定? 一般控制 在? ? ? ? 长度? 电泳时间根据溴酚蓝的移动位置来确定?电泳结束后? 将凝胶置溴化乙锭 溶液? ? ? 中浸泡? ? ? ?用凝胶成像系统观察? 拍照? 记录与分析电泳结果? ? ? ? ? ? ?结果及判断 阳性对照出现预期大小的扩增条带? 阴性对照和空白对照均未出现条带? 待测样品未出现预期大小 的扩增条带? 判断结果为阴性?待测样品出现预期大小的扩增条带? 判断结果为可疑阳性? 需进一步 确证? ? ? ? ?结果确证实验 可疑阳性结果的? 可委托有资质的生物技术公司对扩增产物进行测序? 所获得的序列与附录 ?中 的相应序列进行比对? 同源率达? ? ? 可确证为阳性结果? 或采用实时荧光? ? ?法进行确证? ? ? ?实时荧光? ? ?法 ? ? ? ?引物及探针 所用的引物? 探针见表? 用 ? ?溶液? ? ? 稀释至? ? ? ? ? ?保存备用? 表? 实时荧光? ? ?所用引物? 探针 扩增成分引物名称引物序列 退火温度 ? 产物大小 ? ? 内参基因 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 表? ? 续? 扩增成分引物名称引物序列 退火温度 ? 产物大小 ? ? 山羊 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 绵羊 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?反应体系 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?引物? 探针各? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?模板? ? ? ? ? ? ? 注? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 适用于? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?实时荧光? ? ?系统? 其他型号的荧光? ? ?仪请参 照说明书操作? ? ? ? ? ? ?反应条件 ? ? ? ? 退火温度? 表? ? ? ?个循环? 注?不同仪器可根据仪器要求和? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 使用说明书将反应参数作适当调整? ? ? ? ?结果分析 反应结束后? 应设置无效基线范围?基线范围选择在? ?个循环? 如果有强阳性样本? 应根据实 际情况调整基线范围?阈值设置原则以基线刚好超过正常阴性对照扩增曲线的最高点? 且 ? ?值? ? 为准?设置阈值后? 分析样品的检测结果? ? ? ? ?结果判断 待测样品山羊成分? 绵羊成分检测 ? ?值大于或等于? ? 内参照基因检测 ? ?值在? ? ?之间者? 阴性对照? 阳性对照和空白对照结果正常者? 则可判定该样品未检出山羊成分? 绵羊成分? 待测样品山羊成分? 绵羊成分检测 ? ?值小于或等于? ? 内参照基因检测 ? ?值在? ? ?之间者? 阴性对照? 阳性对照和空白对照结果正常者? 则可判定该样品检出山羊成分? 绵羊成分? 待测样品山羊成分? 绵羊成分检测? ?值在? ? ?之间? 应重做实时荧光 ? ? ?扩增?再次扩增后 的结果? ?值仍小于? ?者? 且阴性对照? 阳性对照和空白对照结果正常? 则可判定该样品检出山羊成分? 绵羊成分? 再次扩增后结果? ?值大于? ? 且阴性对照? 阳性对照和空白对照结果正常? 可判定该样品未 检出山羊成分? 绵羊成分? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?结果表述 ? ? ? ?未检出山羊绒? 绵羊毛? ? ? ? ?检出山羊绒? 绵羊毛? ? ?防止污染的措施 检测过程中防止交叉污染的措施参照 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 附?录? ? 资料性附录? 试剂盒及试剂 ? ? ?组织和毛发提取试剂盒? 与 ? ? ? ? ?系统结合使用? ? 推荐使用? ? ? ? ? ? ?公司产品? ? ? ?组成? ? ? ?次? 温育缓冲液? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 蛋白酶? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 二硫疏糖醇? ? ? ? ? ?洗涤缓冲液? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 裂解缓冲液? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 洗脱液? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 树脂? ? ? ? ? ? ? ? ? ?试剂配制 ? ? ? ?蛋白酶?储存液 向冻干的蛋白酶?瓶中加入? ?温育缓冲液? 轻摇使之完全溶解?此蛋白酶?储存液的终浓 度为? ? ?将蛋白酶?储存液分装成小包装? 可在? ?保存至?年? 反复冻融不要超过?次? 使用前将蛋白酶 ?放置在冰上融化及保存? ? ? ? ? ? ? ? ? 将? ? ?溶于无核酸酶的水中至终体积为? ? ? 则 ? ? ?的终浓度为? ? ? ? 分装成小包 装使用并保存在? ? ? ? ? ?洗涤缓冲液 向?洗涤缓冲液中加入? ? ? ? ?的乙醇和? ?异丙醇? 混匀? 室温保存? ? ? ? ?裂解液 确定所需的裂解液的总量? 每? ? ?裂解缓冲液中加入? ? ? ? ? ? 颠倒几次混匀? 室温 保存一个月? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 试剂盒组成 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?支 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?支 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?支 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 在? ? ?水中加入? ? ? ?二水乙二胺四乙酸二钠? ? ? ? ? ? ? ? ? 剧烈搅拌? 用 ? ? ? 调 节溶液的? ? 值至?