无花果叶中总黄酮的提取及其抗氧化活性测定

2010, Vol. 31, No. 16食品科学工艺技术78 无花果叶中总黄酮的提取及其抗氧化活性测定 杨润亚，明永飞，王 慧 (鲁东大学生命科学学院，山东 烟台 264025) 摘 要：采用正交试验设计研究超声波辅助提取无花果叶中总黄酮的工艺条件，并对无花果叶中总黄酮的抗氧化活 性进行测定。结果表明：无花果叶中总黄酮的最佳超声提取工艺为体积分数 40% 乙醇溶液、料液比 1:60(g/mL)、 超声功率400W、超声温度60条件下提取50min，其提取量为25.04mg/g，影响无花果叶中总黄酮提取效果的主 次因素为：超声温度超声时间料液比乙醇体积分数。无花果叶黄酮提取物具有清除羟自由基、超氧阴离子 自由基的作用，其清除效果在一定范围内随着总黄酮质量浓度的增加而增强。 关键词：无花果叶；超声提取；总黄酮；抗氧化活性 Extraction and Free Radical Scavenging Activity of Total Flavonoids from the Leaves of Ficus carica Linn. YANG Run-ya，MING Yong-fei，WANG Hui (College of Life Science, Ludong University, Yantai 264025, China) Abstract ：The orthogonal experimental design method was employed to study the ultrasonic-assisted extraction process of total flavonoids from the leaves of Ficus carica Linn. and their scavenging activities against hydroxyl and superoxide anion free radicals were evaluated. The optimum conditions for extracting total flavonoids from the leaves of Ficus carica Linn. were found to be: ethanol concentration 40%, material-to-liquid ratio 1:60 (g/mL), extraction temperature 60 and length of ultrasonic treatment of 50 min. Under these optimum conditions, the extraction efficiency of total flavonoids reached as high as 25.04 mg/g. Extraction temperature had the most important effect on the extraction of total flavnoids from the leaves of Ficus carica Linn., followed by length of ultrasonic treatment, material-to- liquid ratio and ethanol concentration. The total flavonoids extract from the leaves of Ficus carica Linn. had marked scavenging effects on both hydroxyl and superoxide anion free radicals in a concentration-dependent fashion. Key words：the leaves of Ficus carica L.；ultrasonic-assisted extraction；total flavonoids；antioxidant activity 中图分类号：R284.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)16-0078-05 收稿日期：2009-12-11 作者简介：杨润亚(1974 )，女，副教授，博士，研究方向为生物活性物质及其开发。E-mail： 黄酮是自然界中广泛存在的化合物。现在已知的黄 酮化合物有 4000 多种，在植物体中常以游离态或与糖结 合成苷的形式存在1。近年来对黄酮类化合物的药理作 用有较多研究，发现其具有抗心脑血管病、抗氧化、 抗病毒、抗肿瘤、抗衰老、抗过敏、免疫调节等作 用2-3，在食品、医药、保健品等方面应用十分广泛。 无花果(Ficus carica L.)系桑科落叶小乔木，是一 种有悠久栽培历史的药食同源果品树种，也是一种开发 应用较广的经济植物，其果实富含营养，叶、根可入 药。 全国中草药汇编记载无花果叶： “淡、涩、 平。散瘀消肿，止泻，治肠炎，外用治痈肿” 。已 有文献综述了无花果叶的药理作用、化学成分及临床应 用，总结出其具有抗病毒、抗菌、降血糖、降血脂、 抗肿瘤、降血压、治疗白癜风等药理作用4 ，其所含 化学成分有呋喃香豆素、补骨脂素、黄酮、果胶、香 柠檬内酯、树脂、糖类和 VC 等5-8，是一种具有开发 应用前景的资源。 已有研究报道无花果叶中总黄酮的含量高于银杏 叶9，有关银杏叶中的总黄酮的提取及应用研究已有 较多报道10-12，但对无花果叶中总黄酮提取条件优化的 研究未见报道，对其抗氧化活性也未见涉及。为进一步 研究无花果叶总黄酮的功效，充分利用无花果叶资源， 本实验以总黄酮提取量为考察指标，采用单因素试验和 正交试验的方法对超声波辅助提取无花果叶总黄酮的工艺 条件进行研究，确定其最佳提取工艺，并对无花果叶黄 酮提取物的抗氧化性进行测定。 1材料与方法 1.1材料与试剂 79 工艺技术食品科学2010, Vol. 31, No. 16 无花果叶于2008 年12 月采自鲁东大学校园内，置 于烘箱中 60烘干，粉碎后备用。 无水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH、硫酸亚 铁、水杨酸、双氧水、邻苯三酚、Tris 、盐酸(以上 试剂均为分析纯)；芦丁标准品 Sigma 公司。 1.2仪器与设备 UV-7502PC型紫外-可见分光光度计 上海欣茂仪器 有限公司；DHG-9143BS-III 型数显电热恒温鼓风干燥箱 上海新苗医疗器械制造有限公司；FA1604 型电子天平 上海天平仪器厂；KQ-500B 型超声波清洗器 昆山市超 声仪器有限公司；SHB-IV 双 A 型循环水式多用真空泵 郑州长城科工贸有限公司；XA-1 型高速万能粉碎机。 1.3方法 1.3.1标准曲线的绘制 称取芦丁标准品7.500mg 置于25mL 容量瓶中，加 60% 乙醇溶液使之溶解并定容至刻度，摇匀，即得芦 丁标准溶液(0.300mg/mL)。分别准确吸取芦丁标准溶液 0.0、0.3、0.6、0.9、1.2、1.5mL，置于 10mL 容量瓶 中，加0.05g/mL亚硝酸钠溶液0.2mL，摇匀后放置6min， 加 0.1g/mL 硝酸铝溶液 0.2mL，摇匀后放置 6min，加 1.0mol/L 氢氧化钠溶液 2.0mL，再用60% 乙醇溶液定容 至刻度，摇匀，放置 15min。在 510nm 波长处分别测 定各反应体系的吸光度13。所得数据经回归处理，得 到各反应体系中总黄酮含量与吸光度的回归方程为 y 0.8069x 0.0001，其中y 为被测样品中总黄酮的质量， x 为吸光度，决定系数 r2=0.9988。 1.3.2无花果叶中总黄酮的提取及含量测定 称取处理好的无花果叶1.000g 于锥形瓶中，在不同 条件下进行超声波辅助提取，提取液经抽滤后用相同体 积分数的乙醇溶液定容至一定体积，准确吸取一定体积 的提取液，加 0.05g/mL 亚硝酸钠溶液 0.2mL，摇匀后放 置 6min，加 0.1g/mL 硝酸铝溶液 0.2mL，摇匀后放置 6min，加 1.0mol/L 氢氧化钠溶液2.0mL，再加乙醇定容 至 10mL，摇匀，放置 15min，510nm 波长处测定其吸 光度，根据回归方程由吸光度求出各处理一定体积的提 取液中黄酮的含量，并按照(1)计算出各处理的总黄酮提 取量。在单因素试验的基础上，选取 4 因素 3 水平进 行 L9(34)正交试验，确定最佳提取工艺。 求出的总黄酮含量 定容体积 总黄酮提取量/(mg/g)= (1) 测定体积 无花果质量 1.3.3无花果叶中总黄酮对羟自由基的清除率测定 参照文献14的方法。取 5 支具塞试管依次向其中 各加入 2.0mmol/L FeSO4 2.0mL、1.0mmol/L H2O2 2.0mL， 振荡，摇匀。再加入 6.0mmol/L 水杨酸 3.0mL，摇匀， 于37水浴加热 15min。加热完毕于510nm 波长处分别 测定吸光度A0。之后分别向5 支试管中加入待试样品(无 花果叶的乙醇提取物，黄酮含量为 0.3702mg/mL)0.2、 0.4、0.6、0.8、1.0mL，接着再分别添加超纯水 0.8、 0.6、0.4、0.2、0.0mL，摇匀，继续水浴加热 15min， 待加热完毕后再次分别测其吸光度 Ax。对照实验：用 2.0mL 蒸馏水取代 H2O2溶液，严格重复上述过程，测 吸光度 Ax0，则样品对羟自由基的清除率计算见式(2)。 A0(AxAx0) 羟自由基清除率/% = 100 (2) A0 1.3.4无花果叶中总黄酮对超氧阴离子自由基(O2 )的 抗氧化作用 对 O2清除率的测定 参照文献15-16的方法。取6 支试管，分别编号为 0、1、2、3、4、5，各加入4.5mL pH8.2 的50mmol/L Tris-HC1 缓冲液，再分别加入质量浓度为0.378mg/mL的 黄酮提取液 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，然后 依次加蒸馏水 1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、0.0mL，混 匀后在25恒温水浴中保温20min，取出后立即加入在 25预热过的3mmol/L邻苯三酚溶液0.3mL(以10mmol/L HCl溶液配制)启动反应。5min 后加4 滴10mol/L 盐酸终 止反应。同时另取 6 支试管，分别编号为 0 、1、2、 3、4、5，按上述步骤依次加入 Tris-HCl 缓冲液、总 黄酮提取液和蒸馏水，然后分别加10mmol/L盐酸0.3mL， 5min 后加4 滴10mol/L盐酸终止反应。在325nm 处用管 0 调零，测管 0 的吸光度，为 A对照；用管 1 调零，测 管 1 的吸光度，为 A加药 1，再依次用管 2、3、4、5 调 零测管2、3、4、5 的吸光度，得A加药2、A加药3、A加药4、 A加药 5。按照式(3)计算各质量浓度总黄酮提取液对 O2 的清除率。 A对照A加药 O2清除率/% = 100 (3) A对照 对 O2生成速度的抑制率测定 按照上述(总黄酮提取液对O2清除率的测定)的反 应体系，反应启动后，每30s 测一相应的 A 值，至 5min 止。将所得的A 值与时间进行回归分析，其斜率为O2 的生成速度 V 。 按式(4)计算各质量浓度总黄酮提取液对 O2生成 速度的抑制率。 V对照V加药 O2生成速度的抑制率/% = (4) V对照 2010, Vol. 31, No. 16食品科学工艺技术80 2结果与分析 2.1单因素试验 2.1.1乙醇体积分数对无花果叶黄酮提取效果的影响 在超声温度 40、超声时间 40min、超声功率 400W、料液比 1:20(g/mL)的条件下，分别选取体积分 数为 10%、20%、30%、40%、50%、60%、70% 的 乙醇溶液对材料进行超声提取，抽滤后将滤液定容至 25mL，取 0.2mL 测定其总黄酮含量，并计算各处理的 总黄酮提取量，结果如图 1 所示。 图1 乙醇体积分数对无花果叶中总黄酮提取量的影响 Fig.1 Effect of ethanol concentration on the extraction yield of total flavonoids 20 18 16 14 12 10 总黄酮提取量/(mg/g) 乙醇体积分数/% 01020304050607080 由图 1 可知，在乙醇体积分数达到 30% 之前，随 着乙醇体积分数的增加，总黄酮提取量增大，当乙醇体 积分数增加到 30% 以后，随着乙醇体积分数的增加，总 黄酮提取量却在减小，所以乙醇体积分数以 30% 为宜。 2.1.2超声时间对无花果叶总黄酮提取效果的影响 在超声温度 40、超声功率 400W、乙醇体积分 数 30%、料液比 1:20 条件下，分别选取超声时间 10、 20、30、40、50、60、70min 进行超声提取试验，抽 滤后将滤液定容至25mL，取0.2mL 测定其总黄酮含量， 并计算各处理的总黄酮提取量，结果如图 2 所示。 图2 超声时间对无花果叶中总黄酮提取量的影响 Fig.2 Effect of length of ultrasonic treatment on the extraction yield of total flavonoids 20 15 10 总黄酮提取量/(mg/g) 超声时间/min 1020304050607080 由图 2 可知，在提取时间50min 之前总黄酮提取量 随着时间的延长而提高，但50min 后总黄酮提取量却降 低，所以提取时间以 50min 为宜。 2.1.3超声功率对无花果叶总黄酮提取效果的影响 在超声温度 40、超声时间 40min、乙醇体积分 数 30%、料液比 1:20 的条件下，分别选取超声功率为 250、300、350、400、450、500W 进行超声提取试 验，抽滤后将滤液定容至25mL，取0.2mL测定其总黄酮 含量，并计算各处理的总黄酮提取量，结果如图3 所示。 图3 超声功率对无花果叶中总黄酮提取量的影响 Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction yield of total flavonoids 20 18 16 14 12 10 总黄酮提取量/(mg/g) 超声功率/W 250300350400450500550 由图 3 可知，随着超声功率的提高，总黄酮提取 量有所增加，在超声功率450W 时达到最大，之后反而 降低，因此选择 450W 功率为最佳功率。 2.1.4超声温度对无花果叶总黄酮提取效果的影响 在超声功率 400W、超声时间 40min、乙醇体积分 数30%、料液比1:20 条件下，分别选取超声温度为30、 40、50、60、70、80进行超声提取试验，抽滤后 将滤液定容至 25mL，取 0.2mL 测定其总黄酮含量，并 计算各处理的总黄酮提取量，结果如图 4 所示。 图4 超声温度对无花果叶中总黄酮提取量的影响 Fig. 4 Effect of extraction temperature on the extraction yield of total flavonoids 22 20 18 16 14 12 10 总黄酮提取量/(mg/g) 超声温度/ 30405060708090 由图 4 可知，随着超声温度的提高，总黄酮提取 量有所增加，在超声温度 60时达到最大，60后随 着温度的提高总黄酮提取量反而降低，所以60为最佳 提取温度。 2.1.5料液比对无花果叶总黄酮提取效果的影响 在超声功率 400W、超声时间 40min、乙醇体积分 数30%、超声温度40条件下，分别选取料液比为1:20、 1:30、1:40、1:50、1:60、1:70 进行超声提取试验，抽 滤后将滤液定容至75mL，取 1.0mL 测定其总黄酮含量， 81 工艺技术食品科学2010, Vol. 31, No. 16 并计算各处理的总黄酮提取量，结果如图 5 所示。 图5 料液比对无花果叶总黄酮提取量的影响 Fig.5 Effect of ratio of material to extraction reagent on extraction yield of total flavonoids 总黄酮提取量/(mg/g) 料液比(g/mL) 1:201:301:401:501:601:701:80 22 20 18 16 14 12 10 由图 5 可知，随着提取溶液的增加，总黄酮提取 量增加，当料液比达到1:50 和 1:60 时提取率达到最大， 之后总黄酮提取量减小，考虑到溶剂的成本及回收问 题，选取料液比 1:50 为最佳料液比。 2.2正交试验设计及结果 综合单因素试验的结果，利用极差法确定出乙醇体 积分数、超声时间、料液比、超声温度为影响无花果 叶总黄酮提取效果的主要因素，对上述 4 种因素以总黄 酮提取率为评判指标，选用 L9(34)正交表进行试验方案 设计，其因素水平设置见表 1，试验结果见表 2 。 水平A 乙醇体积分数/%B 超声时间/minC 料液比(g/mL)D 超声温度/ 120401:4050 230501:5060 340601:6070 表1 总黄酮提取工艺优化L9(34)正交试验因素水平表 Table 1 Factors and levels in the L9(34) orthogonal array design 试验A 乙醇B 超声C 料液比D 超声温 总黄酮提取 号体积分数/%时间/min(g/mL)度/量/(mg/g) 11(20)1(40)1(1:40)1(50)20.87 212(50)2(1:50)2(60)24.07 313(60)3(1:60)3 (70)22.35 42(30)12322.85 5223122.68 6231221.59 73(40)13224.26 8321323.53 9332119.78 K167.2967.9865.9063.33 K267.1270.2866.7069.92 K367.5763.7269.2968.73 R0.456.563.396.59 表2 总黄酮提取工艺优化正交试验结果表 Table 2 Layout of the L9(34) orthogonal array design and test results A3B2C3D2。在此条件下，验证实验结果表明花果叶中总 总黄酮的提取率为25.04mg/g，比文献9报道的无花果 叶总黄酮提取率(0.64%)提高了近 3 倍。由极差分析可 知：4 种因素对提取效果影响大小依次为D B C A，其中超声温度影响最大，其次是超声时间和料液 比，乙醇体积分数影响最小。 2.3无花果叶中总黄酮对羟自由基的抗氧化性 研究表明黄酮类化合物主要通过其清除自由基作 用，直接抑制癌细胞的生长、提高机体免疫力而实现 抗癌、防癌的作用，还能有效地阻止脂质过氧化引起 的细胞破坏1。由表 3 可以看出，无花果叶中总黄酮对 羟自由基有很高的清除率，在一定范围内随着总黄酮提 取物质量浓度的增大，清除率逐渐增大，最高达到 87.39%，其IC50小于9.25mg/L。与文献14中的材料翅 茎香青相比，无花果叶中的总黄酮对羟自由基具有更强 的清除作用。 黄酮质量浓度/(mg/L)9.2518.5127.7637.0346.28 清除率/%59.1369.3585.2086.0787.39 表3 无花果叶总黄酮提取物对羟自由基的清除率 Table 3 Scavenging ratio of the total flavonoids extract from the leaves of Ficus carica Linn. against hydroxyl free radicals 2.4无花果叶中总黄酮对 O2的抗氧化性 由表 4 可以看出，无花果叶中总黄酮对 O2有一 定的清除率，对 O2的生成也具有一定的抑制作用； 在一定范围内随着总黄酮质量浓度的增大，对 O2的 清除率和生成抑制作用逐渐增大，但清除率和抑制作用 都不是很大。 3结 论 利用超声波辅助技术提取无花果叶中的总黄酮，其 最佳工艺条件为乙醇体积分数 40%、超声功率 400W、 超声时间 50min、超声温度 60、料液比 1:60，在此 工艺条件下，无花果叶的总黄酮提取量为 25.04mg/g (2.504%)，比文献7和文献9报道的提取量(19. 83mg/g 和0.64%)分别提高了26.27%和291.25%。与文献7的差 异可能主要是由提取条件不同而产生的，此外与总黄酮 的测定方法不完全相同也有关系；而与文献9的差异则结果表明，无花果叶中总黄酮的最佳提取条件为 黄酮质量浓度/(mg/L)12.6025.2037.8050.4064.50 清除率/%1.217.4715.7116.9226.48 抑制率/%3.4510.3413.7917.2420.69 表4 无花果叶总黄酮提取物对O2的抗氧化性 Table 4 Scavenging ratio of the total flavonoids extract from the leaves of Ficus carica Linn. against superoxide anion free radicals 2010, Vol. 31, No. 16食品科学工艺技术82 主要是由芦丁标准曲线的回归方程不同而产生的(文献9 中芦丁含量与吸光度的回归方程为y=0.0272x 0.0003， 而本研究中则为 y=0.8069x 0.0001)，此外与提取条件 不完全相同也有关系；总之，按照本研究的提取工艺条件 从无花果叶中提取总黄酮，可以得到较高的提取量。 无花果叶中的总黄酮具有较明显的抗氧化活性， 尤其是对羟自由基具有很强的清除作用，其 IC50小于 9.25m