4-氨基吡啶对皮层神经元细胞内游离钙的影响.pdf

论著 4 - 氨基吡啶对皮层神经元细胞内游离钙的影响 苏涛， 陈盛强， 邓维意， 姜涛， 丛文东， 廖卫平* （广州医学院第二附属医院神经科学研究所广州510260） 【提要】 目的研究 4 - 氨基吡啶 （4 - ap） 对体外培养的皮层神经元细胞内游离钙浓度 （ ca2 + i） 的影响， 了解 4 - ap 的药理学作用机制. 方法荧光探针 fluo- 3 - am 标记体外培养的皮层神经细胞内游离钙后， 用共聚焦显微镜观 察记录 4 - ap 及 l 型谷氨酸对小鼠原代培养的皮层神经元 ca2 + i 的影响. 结果4 - ap 与谷氨酸均能提高 ca2 + i， 两者峰值与持续时间存在差异， 共同作用于细胞时的上升曲线与单用谷氨酸时相仿. 结论4 - ap 的药理作用机 制可能与提高神经细胞 ca2 + i 有关， 其中机制与兴奋性氨基酸的 ca2 + i 升高作用可能不同. 【关键词】 4 - 氨基吡啶；细胞内游离钙离子浓度； 谷氨酸； 共聚焦技术； 皮层神经细胞 中图分类号 r - 33 文献标识码 a文章编号 1008 - 634x （2005） 02 - 0094 - 03 4 - aminopyridine - induced increases in intracellular free ca2 +in cultured mouse cortical neurons su tao，chen sheng-qiang， deng wei-yi，et al.（institute of neuroscience， the 2nd affiliated hospital of guangzhou medical college， guangzhou 510260， china） 【abstract】 objectiveto analyze the effect of 4 - aminopyridine （4 - ap）on free intracellular calcium concentration （ ca 2 + i） in cultured mouse cortical neurons and explore the possible pharmacological mechanism. methodsapplying intracellular calcium probe fluo- 3 - am to indicate the changes of ca2 + i；using confocal microscopy to observe the calcium signal and the effect of 4 - ap and l- glutamate on it. results4 - ap and glutamate could increaseca2 + i significantly，whereas the calcium response curve to both reagents was characterized for each other. the ca2 + i curve in response to simultaneous action of 4 - ap and gluta- mate was similar to the effect of only glutamate. conclusionthe pharmacological effects of 4 - ap may be related with the complex change of calcium homeostasis，the underlying mechanism of which are possibly different from that of glutamate- induced change. 【key words】 4 - aminopyridine， ca2 + i，glutamate，confocal microscopy，cortical neurons culture 4 - 氨基吡啶 （4 - ap） 是电压门控型钾通道的阻 断剂， 通常作为药理研究的工具药， 用来抑制和分离 钾电流. 在临床上， 它还经常应用于神经科治疗， 特 别是神经 - 肌肉接头的一系列疾病， 如多发性硬化 病、 重症肌无力、 运动神经元疾病. 近年来， 更是扩展 到治疗脊索损伤、 alzheimer s 病等 1. 而这些应用都 与 4 - ap 阻断电压门控型钾通道， 导致神经细胞去极 化并增强神经递质的释放有关 2. 最近许多报道3 4 - ap 可直接或间接地影响细胞内钙的稳态. 钙离子 作为重要的第二信使， 参与了许多生理或病理的过 程. 研究 4 - ap 对细胞内游离钙浓度的影响将有助 于了解电压依赖型钾通道与细胞内钙信号调节的相 互作用及 4 - ap 的药理学机制. 1材料与方法 1.1试剂和药品 dmem 培养基， 胎牛血清购自美国 gibco 公司； fluo - 3 - am 购自美国 molecular probes 公司， 用 dmso 配制成 1mmol/l 原液， - 20冻存备用. 4 - ap、 l - 谷氨酸、 碘化丙啶 （pi） 、 多聚赖氨酸、 阿糖胞苷等购自 美国 sigma 公司. 1.2皮层神经元培养 取新生小鼠， 分离大脑皮层， 剪碎、 吹打，0.25% 胰蛋白酶消化， 用含 20%胎牛血清的 dmem 培养基终 止消化并洗涤，制备成 1 107/l 密度的细胞悬液， 接 种于铺有多聚赖氨酸的35mm 培养皿 （pelco 公司， 玻 璃底培养皿） ， 置于 5%co2培养箱内培养， 培养第 3d 换液并加入阿糖胞苷 10- 5mol/l 以抑制非神经细胞 增殖. 1.3探针标记 培养 6d， 用培养液洗去细胞表面杂质， 加入 2g/ ml fluo - 3， 37避光孵育 30min . 用无钙 d - hanks 液漂洗 3 次， 保留 1ml d - hanks 液， 加入 1g/ml pi . 1.4细胞内游离 ca2 +浓度 （ ca2 + i） 测定 将标记好的单层培养细胞置于共聚焦倒置显微 49journal of modern clinical medical bioengineering2005， vol.11， no.2 *作者简介： 苏涛， 男， 助教， 硕士， 从事神经科学研究工作. 镜下的恒温灌流槽中， 维持 37， 选择贴壁良好细胞 观察， 确保观察过程中细胞无位移， 并且活性良好 （即 无红色荧光， pi 可将死亡细胞核染成红色） . 在 time series 程序下， 用 63 倍物镜动态观察并记录加药前后 细胞 fluo - 3 荧光值的变化， 荧光强度可指示细胞内 游离钙的浓度变化. 加药前预扫描 1min， 获得基线 后， 加入药物， 并立刻扫描， 数据采集为 15s 1 次， 1 次 共采集 10min . 随机检测 20 个视野. 2结果 2.14 - ap 及 l 型谷氨酸均可诱导 ca2 + i 短暂升 高， 但峰值与持续时间存在差异体外培养的皮层神经 元在加入 10mm 4 - ap 后， 少数细胞反应变化较小， 而 多数细胞表现出明显升高. 平均在 30s 后 ca2 + i 开 始升高， 1min 左右达峰值， 维持时间较长，ca2 + i 下 降慢， 10 15min 仍达较高水平 （图 1） . 而加入 10mm l 型谷氨酸后， 同样大部分细胞表现出迅速、 较高水 平的 ca2 + i 升高， 约在 5min 后 ca2 + i 逐步恢复， 在 10min 后渐回复到近似基线水平 （图 2） . 2.24 - ap 与 l 型谷氨酸合用对 ca2 + i 的升高无 明显叠加效应 图 1 4 - ap 作用时皮层神经元的 ca2 + i 动态变化 图 2 谷氨酸 （10mm） 作用时皮层神经元的 ca2 + i 动态变化 fig.1effect of 4 - ap （10mm）onca2 + i in cultured corticalfig.2the glutamate- induced increase ofca2 + i in cultured neuronal cells of mousecortical neuronal cells of mouse 体外培养的皮层神经元在同时加入 10mm 4 - ap 及 10mm l 型谷氨酸后， 细胞也出现迅速、 较高水平的 ca2 + i 升高， 但峰值与单用 l 型谷氨酸时无明显差 异， 峰值持续时间较长 （图 3） . fig.34 - ap 与谷氨酸共同作用时 ca2 + i 动态变化 fig.3changes inca2 + i with cortical neuwons exposure to both 4 - ap and glutamate 3讨论 在神经系统中，ca2 + i 的改变可触发神经递质 释放、 调节膜的兴奋性、 影响基因表达， 还可以控制长 时程和短时程的突触可塑性改变 4. 细胞内钙离子 变化是许多神经活动的基本机制. 钾通道的阻断、 兴 奋性谷氨酸受体的激活等一系列的细胞外刺激引起 的细胞去极化、 递质释放， 是否与 ca2 + i 的改变有 关， 其信号传递途径又是如何？为此， 有许多相关的 研究探索这些问题. 虽然现已揭示神经细胞的去极 化过程伴随着 ca2 + i 的瞬时变化， 但同时也发现不 同药物或刺激方式引起 ca2 + i 变化的形式不同， 激 活的通路也有所不同. 本研究分别研究 4 - ap 所引 起的钾通道阻断与 l 型谷氨酸引起的兴奋性谷氨酸 受体激活后细胞内钙离子的变化， 通过比较两种药物 所引发的钙浓度变化， 以了解不同药物的相互作用机 制. 同时在实验中用 pi 来筛选活细胞， 较以往的相 关研究更为合理. 结果发现 4 - ap 可中等程度提高 ca2 + i， 这种变化比同浓度的谷氨酸引起的 ca 2 + i 59现代临床医学生物工程学杂志2005 年第 11 卷第 2 期 升高较为缓和， 即上升时间较长及峰值较低， 但持续 时间长， 在药物作用过程中无明显下降倾向， 研究还 发现如果给予长时间 4 - ap 药物作用， 细胞将逐渐死 亡， 可见细胞核染红色，ca2 + i 迅速下降， 推测与胞 膜的破损有关. 有研究报道 5 4 - ap 可以浓度依赖 地促进神经元和胶质细胞的 ip3 及其激酶的表达， 并 且能提高磷脂酶 c （phospholipase c， plc） 活性， 推测 4 - ap 引起的 ca2 + i 升高是由 plc 和 ip3 路径的活化 而打开胞内钙库. 在胞外钙离子的存在时， 4 - ap 可 激活蛋白激酶 c （pkc） 的底物 b - 50 的磷酸化而提高 ca2 + i， 并依赖 na +通道的活性. 但在人类神经母细 胞瘤 chp - 100 细胞系的研究 6发现 4 - ap 提高 ca2 + i 不依赖于 na +通道的活性， 而与 n 型钙通道 的激活有关. 可见， 4 - ap 提高 ca2 + i 的机制在不 同的细胞、 不同的细胞外环境其 ca2 +激活的途径不同 . 有人 5 认为 4 - ap 的钙动员作用不仅与钾通道的 阻断有关， 可能存在直接激动蛋白激酶系统引起细胞 内钙池开放的机制. 本研究发现 4 - ap 提高 ca2 + i 不及谷氨酸明显， 两者共同作用于细胞时，ca2 + i 变 化近似于单用谷氨酸所引起的变化. 谷氨酸诱导的 ca2 + i 升高在神经元中主要经由 nmda 受体的激 活 7 ， 在胶质细胞中 nmda 受体和非 nmda 受体都有 重要作用， 并且是通过多种途径实现的 8. 由此推测 4- ap 诱发的ca2 + i 升高与谷氨酸诱发的 ca2 + i 升高在激活通路上有区别， 而且在不同细胞及环境下 激活途径不同但可能较为单一. 4 - ap 能有效地提高突触、 神经肌肉接头的信号 传导， 从而被临床上用于对抗抗生素或肌松药引起的 长期瘫痪麻痹和其它许多神经疾病 9. 但有许多类 似的应用并不能完全用钾通道阻断作用来解释. 4 - ap 能动员胞内钙库及开放胞膜钙通道使 ca2 + i 升 高， 虽然激活的通路可能有差异， 但是最后的结果都 是导致 ca2 + i 升高， 后者是神经细胞递质释放、 去极 化放电的启动者 4. 这可能是 4 - ap 临床应用的重 要机制之一.ca2 + i 升高的模式可能直接影响触发 的信号， 导致放电频率、 大小的不同， 以及递质或其它 活性物质释放有所差异. 这可能是 4 - ap 在治疗上 述神经疾病时优于其它神经兴奋性药物的机制. 因 此， 继续研究 ca2 + i 升高模式是否与下游信号激活 及产生的不同生物学效应有关联， 将有助于理解 ca2 + i 变化对细胞产生各种各样的效应所起的重要 作用. 参考文献 1andreani a，leoni a，locatelli a，et al. 4 - aminopyridine derivatives with antiamnesic activity j .eur j med chem， 2000， 35 （1） ： 77. 2smith kj，felts pa，john gr. effects of 4 - aminopyridine on demyelinat- ed axons，synapses and muscle tension j .brain， 2000， 123 （1） ： 171. 3campbell dl，qu y，rasmusson rl，et al. the calcium - independent transient outward potassium current in isolated ferret right ventricular my- ocytes. ii. closed state reverse use- dependent block by 4 - aminopyridine j .j gen physiol， 1993， 101 （4） ： 603. 4lipskaia l，lompre am. alteration in temporal kinetics of ca2 + signaling and control of growth and proliferation j .biol cell， 2004， 96 （1） ： 55. 5grimaldi m，atzori m，ray p，alkon dl. mobilization of calcium from in- tracellular stores，potentiation of neurotransmitter - induced calcium tran- sients，and capacitative calci