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4-氨基吡啶对鼠胃肠道功能的影响 王庆徽, 董德利, 杨宝峰 (哈尔滨医科大学药理学教研室, 黑龙江省生物医药工程重点实验室, 黑龙江 哈尔滨 150086) 收稿日期: 2005 -07 -16, 修回日期: 2005 -09 -29 基金项目: 黑龙江省自然科学基金资助项目 (no d0246) 作者简介: 王庆徽 (1980 - ) , 男, 硕士生, 研究方向: 离子通道药理 学, tel: e-mail: wangqinghui126. com; 董德利 (1970 - ) , 男, 硕士生导师, 研究方向: 心血管药理 学, 通讯作者, tel: e-mail: dldong tom. com 中国图书分类号: r-332; r 322. 4; r 333; r 333. 2; r 333. 3 文献标识码: a 文章编号: 1001 -1978 (2005) 12 -1470 -04 摘要: 目的 观察钾通道阻滞剂 4-氨基吡啶 (4-ap) 对于鼠 胃肠道功能的影响。方法 水溶性炭末法检测小鼠胃肠蠕 动; 多通道生理记录仪记录大鼠胃肠纵形肌条张力参数; 胃 酸分泌实验检测大鼠胃酸分泌。结果 4-ap (5 mgkg -1, ig) 抑制小鼠胃肠推进, 4-ap (5 mmoll -1) 能增加大鼠十二 指肠最大收缩力和最小舒张力, 使收缩幅度减小、 频率降低; 4-ap (2. 5 mgkg -1, ip) 促进大鼠胃酸分泌。结论 4-ap 对 鼠类胃肠运动功能有抑制作用, 对大鼠胃酸分泌功能有促进 作用。 关键词: 4-氨基吡啶; 胃肠功能; 鼠类 胃肠道的不同部位存在着多种类型的钾通道, 如高电导和低电导钙激活的钾通道、 内向整流钾通 道、 atp 敏感钾通道等等。在胃肠道平滑肌上, 如豚 鼠的结肠、 负鼠的食道、 小鼠的结肠等部位发现了 a 型钾通道 1。ohya 等2发现在大鼠的胃窦和胃底 部的平滑肌细胞中有 erg1/ kcne2 (钾通道编码基 因) 的转录, 而 kcnq1/ kcne1 却只是在胃窦有转 录, erg1/ kcne2 蛋白在胃窦和胃底部均有表达, kcne1 蛋白只在胃窦有表达。epperson 等 3报道 在犬类的胃肠道平滑肌细胞中有多达 18 种不同的 钾通道的基因表达。这些研究表明在胃肠道平滑肌 上, 各个部位的电生理活动多样性可能源于不同部 位所表达的钾通道不同所致。4-氨基吡啶是经典的 钾通道阻滞剂。在离体的豚鼠结肠和负鼠的食管细 胞上, 4-氨基吡啶抑制 a 型钾电流, 使静息膜电位上 升并且增加动作电位上升支的速率; 在小鼠结肠上, 4-氨基吡啶可以消除慢波之间的静止期并导致轻微 的除极。snetkov 等 4报道即使在相同组织 (如人支 气管平滑肌细胞) , 某些细胞有 4-氨基吡啶敏感的 非钙依赖性延迟整流钾通道, 而其它细胞具有四乙 铵敏感的钙依赖性延迟整流钾通道 4。在家兔的 回肠平滑肌细胞上, 1 mmoll -1四乙铵可以抑制延 迟整流钾电流, 但 1 mmoll -1 4-氨基吡啶却无此 作用; 在家兔的肺动脉平滑肌细胞上同样的电流可 以被 1 mmoll -1 4-氨基吡啶抑制, 但 10 mmol l -1四乙铵却无作用5。由于在胃肠道的不同区域 内, 钾通道的表达存在着质或量的差异, 因此在胃、 小肠以及结肠等部位的静息膜电位、 频率和波形都 存在着一定的区别。4-氨基吡啶对不同钾通道存在 不同的选择性, 提示其对胃肠道不同区域的作用也 存在差异。因此, 本文对 4-氨基吡啶在胃肠道的运 动和分泌功能的影响进行了体内和体外两方面的研 究。 1 材料与方法 1. 1 动物 昆明种小白鼠 (20 2)g 和 wistar 大 鼠 (200 20)g, -各半, 由哈尔滨医科大学实验 动物中心提供。 1. 2 药品和试剂 4-氨基吡啶、 维拉帕米、 阿托品 等均购自 sigma 公司, 其余试剂均为国产分析纯。 kreb 液 (nacl 118. 5 mmoll -1, nahco 325 mmol l -1, kh 2po41. 2 mmoll -1, kcl 4. 8 mmoll-1, mgso47h2o 1. 2 mmoll -1, glucose 11 mmol l -1, 37, ph 7. 3 7. 4) 。 1. 3 仪器和软件 恒温平滑肌槽 (hw-400se, 成 都泰盟科技) ; 张力换能器 (tr2000, france) ; ph 计:(p-240, corning company,german) 。记录分析 软件: bl-420e 生物机能实验系统 (成都泰盟科 技) ; microsoft excel 2003。 1. 4 4-氨基吡啶对小鼠小肠炭末推进运动的影响 4-氨基吡啶 (5 mgkg -1, ig) , 阿托品 (1 mg kg -1, ig) 和生理盐水 (10 mlkg-1, ig) 分别灌胃给 予清醒小鼠, 20 min 后, 用 5%活性炭悬液和 10%的 阿拉伯胶制成水溶性炭末悬液, 以 0. 01 mlg -1的 剂量给小鼠灌胃。再 20 min 后处死小鼠, 将消化道 自贲门至直肠末端完整摘出, 测量炭末前端距贲门 的距离, 计算其与胃肠道全长的百分比。 1. 5 4-氨基吡啶对大鼠离体胃肠收缩功能的影响 取大鼠胃底部 1. 5 cm 的纵行肌条, 竖直悬挂于充 0741中国药理学通报 chinese pharmacological bulletin 2005 dec; 21 (12) : 1470 3 满 kreb 液的浴槽中(通空气, 37,ph 7. 4) , 给予 初始张力 1 g。用同样的方法制备十二指肠标本 (1. 5 cm) , 给予初始张力 2 g, 平衡 1 h 后开始实验。 采用多通道生理药理分析系统记录张力的变化。 1. 6 4-氨基吡啶对大鼠胃酸分泌功能的影响 用 胃灌注收集流出液的方法来获取胃酸。将大鼠全身 麻醉后, 插入导气管, 将导入管经由食道切口插入胃 内, 在十二指肠切口处插入导出管以收集胃液。以 12 mlh -1 的速度向胃内不间断输入生理盐水 (37, ph 7. 0) 。收集 2 h 的流出液进行分析。2 h 后腹腔内注射 4-氨基吡啶 (2. 5 mgkg -1) 。40 min 后再收集 2 h 胃液。以 1% 酚酞为指示剂, 用 0. 01 moll -1 naoh 滴定到 ph 8. 0, 计算胃酸的分泌量 并与用药前比较, 以分泌比率 (用药后胃酸分泌量 与正常胃酸分泌量的比值) 作统计分析。 1.7 统计分析 为具体描述用药后胃条与十二指 肠收缩形式的改变, 设置如下参数: 最大收缩力, 最 小舒张力、 收缩幅度以及收缩频率, 并用统计学的方 法计算出用药时以及用药后连续 20 个数值的平均 数。结果用-x s 表示, 采用 t-test。 2 结果 2. 1 4-氨基吡啶对小鼠小肠炭末推进运动的影响 4-氨基吡啶组 (5 mgkg -1, ig) 的小肠推进比率 为 0. 409 0. 075 (n = 22) , 明显小于生理盐水组 (0. 512 0. 082, n =20, p 0. 01) 。阿托品 (1 mg kg -1, ig) 作为阳性对照, 其推进百分比为 0. 378 0. 084(n =15,p 0. 01 vs 生理盐水) , 表现出对胃 肠推进的抑制作用。 2.2 4-氨基吡啶对大鼠离体胃收缩功能的影响 4-氨基吡啶 (5 mmoll -1) 对胃底纵行肌的最大张 力无明显影响, 对其收缩幅度和频率也无明显作用, 但收缩最小舒张力比率为 1. 5551 0. 189 (p 0. 05, vs 用药前) , 表现出增加最小舒张力的作用。 2. 3 4-氨基吡啶对大鼠离体十二指肠收缩功能的 影响 4-ap 对于大鼠离体十二指肠收缩功能的影 响是呈剂量依赖性的。4-氨基吡啶 (2. 5 mmol l -1) 作用于离体大鼠十二指肠, 40%表现为阴性反 应, 60%表现为阳性反应 (n = 25) ; 4-氨基吡啶 (10 mmoll -1)可使大鼠离体十二指肠的收缩幅度显 著上升 (n =7) 。4-氨基吡啶 (5 mmoll -1) 可明显 且稳定的改变离体大鼠十二指肠的收缩特征 (n = 11) , 洗脱后恢复正常 (fig 1a) 。进一步研究发现4- 氨基吡啶 (5 mmoll -1) 的这种作用可被维拉帕米 (5 moll -1) 所抑制 (fig 1b) , 表明4-氨基吡啶对 十二指肠的作用有 l-型钙通道的参与。4-氨基吡啶 对大鼠离体十二指肠收缩功能特征的影响见 tab 1。 4-氨基吡啶 (5 mmoll -1) 可增加十二指肠的最大 收缩力及最小舒张力, 使收缩的幅度减小、 频率降 低。 tab 1 the normalized data of 4-ap on duodenum contraction of rats in vitro (-x s, n =11) maximal contractive force minimal relaxation force contractive amplitude contractive frequency saline1111 4-ap1.460 0.285*3.107 1.558*0.314 0.172*0.498 0.292* washout 0.989 0.421 1.150 0.8770.941 0.3881.051 0.216 *p 0. 05,*p 0. 01 vs saline 2. 4 4-氨基吡啶对大鼠胃酸分泌功能的影响 腹 腔注射 4-氨基吡啶 (2. 5 mgkg -1) 2 h 后, 胃酸分 泌比率为2. 1789 0. 860(n =6, p 0. 05) 。4-氨基 吡啶可以增加大鼠的胃酸分泌。 fig 1 effects of 4-ap on duodenum contraction of rats in vitro a: representative recording of duodenum contraction of rats after ap- plication of 4-ap and washout. the boxed sections of the original record- ing are magnified as the indication by arrow. b: representative recording of duodenum contraction of rats after application of 4-ap,verapamil (5 moll -1)and washout. scaling in a and b is same. *p 0. 05,*p 0. 01 vs saline 3 讨论 钾通道参与静息膜电位的形成、 节律性运动的 维持以及平滑肌对神经递质的反应。在胃肠道中已 发现多种钾离子通道, 先前报道证实钾离子通道阻 滞剂能够影响胃肠道的收缩, 但并没有对其引起的 收缩形式进行分析。本实验发现 4-氨基吡啶无论 是在离体还是在整体情况下, 都对胃肠道的运动表 现了相同的作用。我们最初的实验表明 4-氨基吡 啶能够有效抑制整体小鼠的胃肠推进, 此结果促使 1741中国药理学通报 chinese pharmacological bulletin 2005 dec; 21 (12) 我们通过离体的方法来研究其中的机制。进一步实 验证实 4-氨基吡啶能减小胃肠蠕动收缩的幅度和 频率, 而由 4-氨基吡啶引发的痉挛性收缩可以被钙 通道阻滞剂维拉帕米所抑制。 4-氨基吡啶对胃肠道作用的研究已有报道。 velasco 等 6。报道 4-氨基吡啶和 3, 4-二氨基吡啶 可使离体豚鼠回肠产生剂量依赖性收缩, 并且这种 作用可被钙通道阻滞剂所抑制。boev 等 7研究了 4-氨基吡啶对猫胃底和胃窦的电活动以及收缩活动 的作用, 发现 4-氨基吡啶可以通过增加神经递质的 释放 (低浓度) 或是直接作用于平滑肌细胞膜 (高浓 度) 来增加平滑肌的张力。cheng 等 8报道 4-氨基 吡啶能够诱导去甲肾上腺素能神经释放神经肽 y, 从而引发离体的兔空肠发生收缩, 并且这种收缩可 以被阿托品和河豚毒所阻断。 4-氨基吡啶所引起的肠基础张力增大可能与 4- 氨基吡啶对瞬时外向钾电流和延迟整流钾电流的抑 制有关。全细胞膜片钳实验发现, 细胞膜去极化后 可在内向钙电流之后记录到瞬时及持续的外向钾电 流。4-氨基吡啶对这些外向钾电流的抑制作用可使 细胞膜复极化过程受到抑制, 使膜电位持续在较高 水平, 相当于去极化。而胃肠平滑肌在静息膜电位 的情况下, 平滑肌有一定紧张性且紧张性的大小取 决于静息膜电位的高低, 故去极化可能是胃肠基础 张力升高的原因。该观点同样可以用来解释其他钾 通道阻滞剂的增加胃肠基础张力的现象。但由于 4-氨基吡啶药理作用的复杂性, 这种认识并不能完 全解释 4-氨基吡啶对胃肠道的全部作用。 实验中还发现 4-氨基吡啶能明显增加胃酸分 泌量, 此作用可能是由于 4-氨基吡啶对胃壁细胞的 直接作用或 4-氨基吡啶通过影响神经系统而产生 的间接作用。具体机制有待进一步研究。santicioli 等 9发现 4-氨基吡啶可减少鼠迷走神经刺激所致 的胃酸分泌, 与本文结果有一定程度的差异, 可能是 由模型差异造成的。 本研究在体实验选择小鼠、 离体实验选择大鼠 作为实验对象。由于采用小鼠胃、 肠样本在方法学 上给研究造成一定困难, 因此离体实验选择了大鼠。 小鼠和大鼠各方面生理功能相似, 种属相同, 因此实 验结果是可靠的。郑礼等 10建立了大鼠胃平滑肌 细胞收缩模型并研究了药物对此模型的作用, 证明 了该模型的可靠性, 因此我们将利用该模型进行下 一步的平滑肌细胞分子机制的研究。 参考文献: 1 amberg gc,baker sa,koh sd et al. characterization of the a- type potassium current in murine gastric antrum j . j physiol, 2002, 544: 417 -28. 2 ohya s,asakura k,muraki k et al. molecular and functional characterization of erg,kcnq,and kcne subtypes in rat stom- ach smooth muscle j . am j physiol gastrointest liver physiol, 2002, 282: g277 -87. 3 epperson a,bonner hp,ward sm et al. molecular diversity of kv - and -subunit expression in canine gastrointestinal smooth muscles j . am j physiol gastrointest liver physiol, 1999, 277: g127 -36. 4 snetkov va,hirst sj,twort ch et al. potassium currents in hu- man freshly isolated bronchial smooth muscle cells j . br j phar- macol, 1995, 115: 1117 -25. 5 ohya y, terada k, kitamura k et al. membrane currents recorded from a fragment of rabbit intestinal smooth muscle cells j . am j physiol cell physiol, 1986, 251: c335 -46. 6 velasco a,maroto m,duenas a et al. effect of 4-aminopyridine and 3, 4-diaminopyridine on guinea-pig isolated ileum j . j auton pharmacol, 1997 , 17 (1) : 53 -7. 7 boev k,bonev a,papasova m. 4-aminopyridine-induced chan- ges in the electrical and contractile activities of the gastric smooth muscle j . gen physiol biophys, 1985 ; 4 (6) : 589 -95. 8 cheng jt,hsu sy,shen cl. 4-aminopyridine induces the re- lease of neuropeptide y(npy)to produce an atropine- and tetro- dotoxin-resistant contraction in rabbit isolated jejunum j . eur j pharmacol, 1989, 174 (1) : 1 -7. 9 santicioli p,evangelista s,valoti m et al. 4-aminopyridine re- duces vagal-stimulated gastric acid secretion in the rat j . phar- macol res commun, 1988, 20 (5) : 417 -8. 10郑 礼, 崔艳英, 李宝刚 et al. 大鼠胃平滑肌细胞收缩模型及 其药物研究 j . 中国药理学通报, 2003, 19 (6) : 675 -8. effects of 4-aminopyridine on the gastrointestinal function of murine wang qing-hui, dong de-li, yang bao-feng (dept of pharmacology, harbin medical university, bio-pharmaceutical key laboratory of heilongjiang province, harbin 150086, china) abstract: aim to investigate the effects of 4-amin- opyridine(4-ap) , k + channel blocker,on the gastro- intestinal function of murine. methods charcoal sus- pension was used to detect the effects of 4-ap on gas- trointestinal motility of mice in vivo,contraction of iso- lated fundus longitudinal strips and duodenum of rats 2741中国药理学通报 chinese pharmacological bulletin 2005 dec; 21 (12) were studied in vitro, gastric acid secretion was meas- ured by gastric secretion test. results 4-ap (5 mg kg -1, ig)inhibited the gastrointestinal motility of mice. 4-ap (5 mmoll -1)increased the maximum contractive force and minimum relaxation force,de- creased the amplitude and frequency of the isolated du- odenum peristaltic contraction. 4-ap (2. 5 mgkg -1, ip) significantly enhanced gastric acid secretion of rats. conclusion 4-ap inhibited gastrointestinal mo- tility and enhanced gastric acid secretion in murine. key words:4-aminopyridine; gastrointestinal func- tion;murine 大黄素对大鼠体外颅骨成骨细胞的影响 刘钰瑜1, 姚卫民3, 艾春媚2, 许碧连1, 邹丽宜1, 吴 铁1, 崔 燎1 (1. 广东医学院药理学教研室, 2. 广东天然药物研究与开发重点实验室, 广东 湛江 524023; 3. 广东医学院附属医院呼吸内科, 广东 湛江 524001) 中国图书分类号: r-332; r 282. 71; r 284. 1; r 322. 71; r 329. 24; r 329. 28; r 681. 053 文献标识码: a 文章编号: 1001 -1978 (2005) 12 -1473 -05 摘要: 目的 观察大黄素对体外大鼠颅骨成骨细胞细胞周 期、 骨钙素含量、 骨结节数目和面积、 型胶原 mrna 表达 的影响。方法 在成骨细胞体系中加入不同浓度的大黄素, 应用流式细胞术、 放射免疫测定法、 茜素红染色法及 rt-pcr 的方法观察大黄素对大鼠颅骨成骨细胞的增殖、 骨钙素含 量、 骨结节数目和面积、 型胶原 mrna 表达的影响。结果 大黄素可刺激成骨细胞分泌骨钙素。低浓度的大黄素可 上调型胶原基因的表达, 高浓度时则降低型胶原的基因 表达。结论 大黄素可以刺激成骨细胞分泌骨钙素和增加 型胶原 mrna 的表达。 关键词: 大黄素; 成骨细胞; 细胞周期; 胶原; 骨钙素; 矿化; 骨 质疏松 大黄素 (emodin) 化学名为 1, 3, 8-三羟基-6-甲 基蒽醌 (1, 3, 8-trihydroxy-6- methylan-thraquinone) 。 其作用极为广泛, 与骨代谢有关的作用有以下几方 面, 首先大黄素具有雌激素样作用, 可使去势-大鼠 迅速恢复性周期, 临床试用有卵泡激素样功效, 口服 对痛经、 子宫内膜炎等病人有类似雌激素的效用, 并 且与雌激素受体有高度的亲和力, 激动受体产生生 物效应 1, 2。其次, 大黄素有抗超氧负离子自由基 收稿日期: 2005 -07 -08, 修回日期: 2005 -09 -29 基金项目

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