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文档简介
实验六 微生物的简单染色及革兰氏染色,细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的 制片和简单染色 革兰氏染色法,细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的 制片和简单染色,一、实验目的 学习掌握微生物制片及简单染色的基本 技术 初步了解细菌、放线菌、酵母菌及 霉菌的形态特征和相互区别 巩固显微镜操作技术及无菌操作 技术,二、基本原理,染色前必须固定细菌 其目的有二: 一是杀死细菌并使菌体粘附于玻片上 二是增加其对染料的亲和力 常用的有加热和化学固定两种方法 固定时尽量维持细胞原有的形,常用碱性染料进行简单染色,原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷,而碱性染料在电离时,其分子的染色部分带正电荷,因此碱性染料的染色部分很容易与微生物细胞结合使其着色。常用作简单染色的染料有美蓝、结晶紫、碱性复红等。 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时,细菌所带 正电荷增加,此时可用伊红、酸性复红或刚果红 等酸性染料染色,三、实验器材与试剂,菌种:牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养的12-18小时枯草芽 胞杆菌和培养24h的金黄色葡萄球菌 溶液和试剂:草酸铵结晶紫染液、齐氏石炭酸复红染液、 吕氏碱性美蓝染液、革兰氏染色用碘液、 乳酸石炭酸棉蓝染液 仪器和其他用品:双层瓶、接种环、接种铲、接种针、 平皿、U型玻璃棒、解剖针、 解剖刀、 50%乙醇、20%甘油、高氏一号培养 基平板、马铃薯琼脂薄层平板等,四、操作步骤,安全警示 1.加热固定时要使用载玻片夹子,以免烫伤。不要将 载玻片在火焰上烧烤时间过长,以免载玻片破裂 2.使用燃料时避免粘到衣服上 3.放线菌和霉菌制片要减少空气流动,避免吸入孢子 4.实验完毕后洗手,金黄色葡萄球菌为条件致病菌, 二甲苯为有毒物质。,细菌制片及简单染色 涂片:将玻片分成两个区域,各滴上一小滴蒸馏水,再用无菌操 作的方法挑菌少许枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌于玻 片的水中,并充分混匀涂成薄膜 干燥:将涂片置火焰高处微热烘干或自然干燥 固定:涂面朝上,通过微火2-3次 染色:玻片泠却后加结晶紫滴于涂片上,覆盖涂面染色1分钟 水洗:倾去染色液,用水自玻片一端轻轻冲洗至洗出水变无色为止 (注:勿冲去菌体) 干燥:自然干燥,或用吸水纸吸干 镜检:显微镜下观察并记录,四、实验步骤,1、菌落形态观察: 2、细菌简单染色: 3、细菌革兰氏染色。,注意:菌落颜色、湿度、形状、大小、透明度、颜色、边缘是否规则等特征。,染色过程: 涂片干燥固定染色(1min)水洗干燥镜检 注意事项: 涂片:取菌量不能太大 干燥:自然干燥 水洗:水流不能直接冲在涂菌处,放线菌革兰染色,青霉的显微结构,曲霉的显微的显微结构,毛霉显微结构,根霉显微形态,电镜下的酵母,革兰氏染色法,一、目的要求 学习掌握革兰氏染色法 了解革兰氏染色原理 巩固显微镜操作技术及无菌操 作技术,二、基本原理(革兰氏染色),革兰氏染色法是1884年由丹麦病理 ChristainGram氏创立的,可将细菌区分为革 兰氏阳性菌(G+)和革兰氏阴性菌(G-) 革兰氏染色法是细菌学中最重要的鉴别染色法 革兰氏染色法所以能将细菌分为革兰氏阳性和 革兰氏阴性,是由这两类细菌细 胞壁的结构和组成不同决定的,三、实验器材与试剂 菌种:大肠杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 金黄色葡萄球菌 16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物 溶液和试剂:革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘 液、95%乙醇、番红复染液等 仪器和其它用品:显微镜、双层瓶、接种环、载玻片夹 子、无菌生理盐水等,本实验为什么采用上述生物?,四、操作步骤,革兰氏染色法的基本步骤是: 制片初染(结晶紫)媒染(碘液) 脱色(95%乙醇或丙酮)复染 (番红) 镜检(油镜)混合涂片染色 经此方法染色后,细胞保留初染剂蓝紫色的 细菌为革兰氏阳性菌;细菌染上复染剂的颜 色(红色),该菌属于革兰氏阴性菌,染色结果,金黄色葡萄球菌革兰氏染色结果,染色结果,大肠杆菌革兰氏染色结果,染色结果,金黄色葡萄球菌和大肠杆菌混合菌样的革兰氏染色结果,附:油镜的使用,双目显微镜,单目显微镜,2.油镜的原理,油镜的透镜很小,从载玻片透过的光线通过空气时,因介质折光率不同,
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