神经细胞体外培养方法及应用.ppt

神经细胞体外培养方法及应用,田东萍 汕大医学院病理教研室,神经细胞体外培养的历史,神经组织的体外培养方法是由Harrison，于1907年首创的。 由于该方法具有简化细胞生化环境、明确生长条件、便于施加实验因素及容易获得活体直接观测结果等优点，因而已成为研究神经系统结构和功能的有效手段。 九十余年来，这项技术已从组织块（或植块）培养（explant culture）发展到分离细胞培养(dissociated cell culture)，并逐渐与多种现代技术结合起来，在神经科学各领域发挥了重大作用。,组织块培养分离细胞培养甚至单一型细胞培养,神经组织的植块培养法,悬滴培养方法 单盖玻方法 双盖玻方法 1925 改良双盖玻方法 培养物： CNS灰质、白质、外周神经节或神经小段 突起 非神经元外伸,优点,所需培养液量少，可反应组织代谢中 微量生化改变 保留了植块内组织特征,不足,培养空间小，O2 CO2供少 培养空间湿度难以控制，水分会蒸发 密封手续繁杂，不利更换培养液，难 以观察单个神经元生长。,神经元的分离细胞培养方法,1956年，Nakai首创了神经组织的分离培养方法 材料来源：胚胎动物神经组织 神经元增殖发生于胚胎期 形态学分化和化学分化程度低，体外存活强，成熟后则相反，且神经元会受到大的普遍损伤。 部位：灰质、PNS神经节，神经元集中，密度大,神经元的体外培养液,天然合成成分 血清 血浆 胚胎撮液 人工培养基 无血清培养基 化学限定性培养基 常用的：DMEM + 添加剂 F12,葡萄糖 为神经元能量代谢主要来源 33mm CO2 NaHCO3缓冲系统重要 HEPESO2耗量更高 K+ 神经元生理活动的重要离子，K+是神经元存活所必需的，K+ 24.5mM 能提高神经元存活，促分化 非神经元成分的抑制 有 2-3天,神经元无血清限定培养液,人工合成的培养基虽然具备了细胞生长的基本营养物质和无机盐类，但仍无法满足不同类型细胞的特殊需要。大多数神经元在基础培养液中即使能够存活也为期不长，更难以分裂。因此可根据神经元的特性，给基础培养中再添加某些特殊物质。,选择添加剂的基本过程,限定连续细胞系的体外生长条件。 试定该细胞系来源的细胞的培养 液条件。,Bottenstein实验室经过长期研究发现如下添加剂比较好,人转铁蛋白、牛胰岛素、硒酸钠、孕酮、腐胺加入到F12与DMEM 1:1混液中，可以代替血清添加物，用来培养大鼠CNS的成神经细胞瘤细胞。删去其中任何一种添加物都可导致成神经细胞瘤细胞生长状况锐减。该实验室共列出了三种神经元限定性培养添加物的配方，代号分别为N1、N2、N3。,N1的配方为,胰岛素5g/ml 转铁蛋白5g/ml 孕酮20 nM 腐胺100Um 硒30nM,神经体外培养的生长基质,胶 元 多聚赖氨酸 LN,神经细胞培养操作程序表,脊髓后根节 大脑皮质 孕1820天大鼠胚胎 新生13天大鼠 在CMF-Hanks液中取出组织除去脑膜 与CMF-Hanks 液一起移至离心管 舍弃CMF-Hanks液，再加入5ml 0.25%胰蛋白酶和5滴0.2%Dnase液 ,370C，30min 舍弃胰蛋白酶，加入5ml培养液和10滴Dnase液 用巴斯德吸管吹打20次，再用套有微量加样器头的加样器吹打20次 若有组织残渣，将上清移至新试管再加3ml培养液反复吹打 将细胞悬液收集于离心管，离心1200r/min ，8min，舍去上清，向沉淀加培养液，离心1200r/min，8min ,加入培养液调整悬液中的细胞浓度，神经节细胞为1107 种入涂有poly-D-lysine的盖片上，每片50l 放入CO2孵箱中过夜 次日加3ml培养液 2天后（培养的第三天）换入有DNA合成阴断剂的培养液,神经元的分离培养过程,大鼠大脑皮层神经组织细胞培养 组织来源 新生大鼠1-2日龄，碘 酒 ，洒精消毒。 断头，取出大脑，分离脑 膜 ，夹取两侧大脑皮质放入接种培养液中，用D-Hanks冲洗二遍。 剪碎，0.5-1mm3,用D-Hanks充分洗去残血 加入5-10倍量0.25%胰蛋白酶，移入离心管中放到水370C浴箱中消化20-25分钟。 终止消化离心洗涤 2000转/分 ，5分钟弃上清。吹打制成细胞悬液。 台盼兰染色计数后接种于事先涂好鼠尾胶的24孔板中。 370C 5%CO2培养2天后换生长培养液,大鼠海马神经细胞培养方法,神经元体外生长特征 接种密度与体外存活率 当96孔 每孔2000-3000个 或 7000-10000个/cm2几乎无神经元存活 当8000-12000个/96孔 或 2.8万-4万个/cm2 存活率最大。 3天后不到接种的一半，故研究某一生长因子前3天加药最好,神经元的体外存活时间,短1-2W 长 4个月,体外分化标志,破伤风毒素 NSE NF200,NF160,神经细胞的特殊染色鉴定方法,尼氏体染色 焦油紫 甲苯胺蓝 硫瑾等组化染色 镀银染色 NADPH-d特异性神经组织化学法,神经细胞培养的应用,应用领域 研究各种因素对神经的影响 1. 化学物质，物理因素，生物因素，环境中化学因子， 自由基，外伤、高温等因素，病毒感染。 2. 药物，细胞因子，对神经细胞的作用，各种药物，如 中药，脑活素，神经生长因子，成纤维细胞生长因子 （bFGF），神经营养因子 3. 细胞间相互作用：巨噬细胞，雪旺细胞等。 4. 各种生理病理状态下神经元状态改变,实验方法,研究手段及测量指标 1. 形态学观察： 光镜，相差显微镜：细胞数目，形态，大体结构，突触 电镜：超微结构。 2. 激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope, LCSM) ：研究细胞内成分变化，离子改变等，三维重建 3. 膜片钳技术，细胞表面通道和离子流动，电变化。,研究手段及测量指标,4. 聚丙烯酰胺凝胶电泳：细胞内蛋白，核酸变化 5. 染色：苏木素-伊红（HE）染色及尼氏（Nissl)染色，免疫组化染色。 6. 显微测量：胞体平均直径和胞体椭圆率，突起长度及胞径。 7. 荧光光度分析仪：MTT法测定细胞的OD值,培养神经细胞的观察和鉴定,1. 神经细胞培养存活的标志：种植24小时后贴壁，渐长出几十微米的突起，神经细胞大多都能存活。 2. 特殊培养阶段：培养的9到12天之间，有较多神经元死亡，以后存活下的细胞突起长而多，互