实时荧光定量PCR技术.ppt

,实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR),北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20,天为时代核酸系列讲座之 华中科技大学同济医学院,讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR 原理 实时原理,常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测,实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR原理 定量原理,介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线,实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板量,实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,实时荧光定量PCR原理 绝对定量,讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan 3、Molecular Beacon 4、Amplisensor,实时荧光定量PCR 原理 - DNA 产物的荧光标记,实时荧光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法,SYBR Green,SYBR Green 法 工作机理,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),Tm,SYBR Green 法 融解曲线分析,Cycle number,SYBR Green 法 定量原理,模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少 Log浓度与循环数呈线性关系，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,SYBR Green 法 -PCR反应的建立,反应体系的建立及优化: SYBR Green 使用浓度:太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱，不易检测 Primer：引物的特异性高，否则扩增有杂带，定量不准 MgCl2的浓度:可以降低到1.5mM,以减少非特异性产物 反应Buffer 体系的优化 反应温度和时间参数:由酶和引物决定 其他与常规PCR相同,天为时代公司利用SYBR Green 法定量检测样品DNA,SYBR Green 法 应用范围,起始模板的测定 基因型的分析 融解曲线分析：可以优化PCR反应的条件，对常规PCR有指导意义，如对primer的评价；可以区分单一引物、引物二聚体、变异产物、多种产物。,SYBR Green 法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan法 工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan 法 PCR反应的建立,1、引物、探针的设计： 探针Tm为68-70 ，30 bp, 5不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段400 bp，引物Tm为59-60 2、反应参数的确定： 一般为：94 ，10-20S 60，30-60S（Taq酶53外切核酸酶活性在60 最高） 也可通过温度梯度优化退火温度 72 ，45 S， 3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：50-900nM 探针浓度：50-250nM 4、其他与常规PCR相同,已肝病人血液中HBV的绝对定量 目的：利用核酸检测，缩短检验时间，提高灵敏度，为诊断用药提供依据 方法：从血液中提取病毒DNA，扩增病毒基因，以TaqMan探针进行检测 设置对照：浓度为106、105 、104 103 的标准样品各一个，设阴性和空白对照 实验步骤：提取HBV DNA 设计特异引物 设计TaqMan探针并标记探针 扩增程序 结果：获取血液样品中HBV DNA的精确copy数,天为时代公司利用TaqMan法 检测血液中的HBV,数据分析,分析结果： HBV DNA的精确copy数为3.7X105,天为时代公司利用TaqMan法 检测血液中的HBV,TaqMan法 应用范围,起始模板的定量 基因型分析 目的基因定量 产物鉴定 SNP分析,TaqMan法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法 3- Molecular beacon 法(分子信标),标记荧光的发夹探针 环与目标序列互补 茎由互补配对序列组成,发夹型杂交探针,Molecular beacon (分子信标) 工作原理,荧光共振能量转移（FRET） 探针与DNA杂交时产生荧光 -变性过程：产生非特异性荧光 -延伸过程：不产生荧光 -退火过程：产生特异性荧光，检测荧光信号,Molecular beacon (分子信标) 应用范围,起始模板的定量 基因型分析 产物鉴定 SNP（单核苷酸多态性）分析,Molecular beacon (分子信标) 优缺点,讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR法 标准样品,相对定量中的内标 内标通常是-actin、GAPDH基因等看家基因 在细胞中的表达量或在基因组中的拷贝数恒定，受环境因素影响小 内标定量结果代表了样本中所含细胞或基因组数量,绝对定量的标准样品： 已知拷贝数的质粒DNA和体外转入的RNA,实时荧光定量PCR法 标准样品DNA拷贝数,用于生成标准曲线的样品如何设定？ 含有和待测样品相同扩增片段的克隆质粒 含有和待测样品相同扩增片段的cDNA 紫外分光光度计或荧光酶标测定浓度 根据质粒或cDNA分子量换算成拷贝数，做系列稀释,实时荧光定量PCR法 定量方法,绝对定量检测起始模板数的精确拷贝数，通常用到标准曲线 相对定量确定经过不同处理的样本目标转录本之间基因的表达差异（不同时相） 2-C（t） 双标准曲线法,实时荧光定量PCR法 TaqMan法举例,TaqMan法研究ERBB2 在乳腺肿瘤 组织标本中的表达差异,TaqMan法举例 标记探针,使用 TaqMan 探针进行双通道荧光定量,Fam标记目标基因探针 VIC标记看家基因探针,TaqMan法举例 材料准备,从正常乳腺组织中提取的总 RNA 从乳腺癌组织中提取的 总RNA 含 ERBB2 and GAPDH 的质粒用于生成标准曲线 单双通道同时进行，独立分析 Controls no RNA：阴性对照 RNA + no reverse transcriptase：基因组对照,TaqMan法举例 反应程序,RT-qPCR 反应程序：,TaqMan法举例 癌症标记物表达,Color 2 - VIC detection for GAPDH,Color 1 FAM detection for ERBB2,TaqMan法举例 实验结果 单双通道相互验证,TaqMan法举例 实验结果 定量,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法举例 实验结果 定量分析,ERBB2 copies / GAPDH copies,1095 / 95500 = 0.011 1052 / 85730 = 0.012,2130/136000 = 0.017 2492/130800 = 0.019,Healthy RNA,Tumor RNA,0.0115,0.018,Copies ng/ l Total RNA,TaqMan法举例 实验结果 表达差异,Healthy Tissue,Carc. Tissue,Relative Expression,ERBB2的表达差异,TaqMan法举例 实验结果 讨论,通过RT-qPCR成功检测了ERBB2基因在不同组织的 表达差异；在乳腺癌组织中，ERBB2的表达量是正常水平的1.8倍,实时荧光定量PCR法 SYBR Green I法举例,利用SYBR Green 1进行GMO定量 (SGI) for GMO soy detection,SYBR Green I法 GMO概念,转基因生物又称遗传修饰生物（Genetically Modified Organisms，GMO），是经基因工程技术改变基因组构成的生物，包括转基因植物、转基因微生物和转基因动物。,SYBR Green I法 GMO概念,1983年：首例转基因植物转基因烟草 1986年：转基因植物首次进入田间实验 1994年：首例转基因植物产品Flavr Savr 延熟保鲜转基因番茄进入市场 1996年至今：转基因作物迅猛发展期,SYBR Green I法 检测方法,转基因生物包括了特异的核酸序列，调控序列、目标基因、报告基因 通过内源基因来对每个样品DNA进行定量（Normalization) 利用插入基因的定量来进行GMO含量检测,SYBR Green I法 材料准备,Roundup Ready 大豆（RTC公司，IRMM-41050-56） 普通非转基因大豆 从超级市场买来的下列食物用来作为测试样品： 大豆饼,豆制甜点 和两个牌子的大豆粉,SYBR Green I法 样品制备,标准品的制备:转基因成分含量分别为 0%, 0.1%, 0.5%, 1%, 2% 和 5% 转基因大豆 实验样本 从含大豆成分的样本中提取DNA,SYBR Green I法 引物设计,Lectin 扩增片段长度为318bp 其引物为： 正向：5-GAC-GCT-ATT-GTG-ACC-TCC-TC-3， 反向：5-GAA-AGT-GTC-AAG-CTT-AAC-AGC-GAC-G-3 EPSPS 扩增片段长度为356bp 其引物为： 正向：5-TGG-CGC-CCA-AAG-CTT-GCA-TGG-C-3 反向：5-CCC-CAA-GTT-CCT-AAA-TCT-TCA-AGT-3,SYBR Green I法 C（t）定量,log A/B = logA- logB A: EPSPS GMO B: Lectin all bean A/B: %GMO,SYBR Green I法测GMO 数据收集与分析,标准曲线log%GMO对应C（t）获得 熔解曲线分析，检测扩增产物,数据处理： C（t）EPSPS-C（t）lectin=C（t） 处理条件： 假定两对引物有相同的扩增效率并且相互独立扩增。,SYBR Green I法测GMO 熔解曲线分析,Tm = 92oC,Tm = 88.5oC,SYBR Green I法测GMO 实验结果