黄曲霉素的检测方法王慧.ppt

黄曲霉素的检测方法,王慧,由于黄曲霉素在自然界的广泛存在和对人、畜等生物的巨 大危害性（主要为致癌性，WHO将其列为自然界最强的三大致癌物之一），国际上将其纳入到严格控制的有害生物名单之中。农产品黄曲霉素含量是国际上食品卫生和农产品贸易中的必检指标。在我国加入WTO后，黄曲霉素（Aflatoxin）也常常成为某些国家和组织限制我国农副产品出口的绿色壁垒，我国已连续多次因为黄曲霉素被检出而遭受农产品贸易损失。基于上述这些原因，我们必须加强农副产品及饲料产品中各型黄曲霉素检测的工作。,世界公认的三大致癌物：黄曲霉菌、三四苯并芘、亚硝酸盐,黄曲霉毒主要存在于发霉的粮、油、花生中，它是黄曲霉及寄生曲霉的代谢产物，毒性极强，可致肝癌，由于黄曲霉素是一种热稳定的化学物质，所以在烹调过程中不易破坏。预防措施主要是防霉。但如果食品已霉变产毒，则应采取适当去毒措施：如花生米可用排除霉粒法；大米可用碾轧法及水搓法；植物油可用加碱去毒法等。 目前已分离鉴定出18种，它们的化学结构类似，都是二氢呋喃香豆素的衍生物，主要是黄曲霉毒素B1、B2、G1、G2 以及由B1、B2在体内经过羟化而衍生成的代谢产物M1、M2 等，B1为毒性及致癌性最强的物质。其毒性为氰化钾的10倍、砒霜的68倍,被列入严管的特剧毒物质！,难溶于水易溶于油、甲醇、丙酮、氯仿等有机溶剂,中药材的采收、加工、销售、直到使用需要一段相当长的时间，如果储存环境不合理，会造成药材或饮片发霉变质，特别是含油脂比较丰富的种子类药材，更容易发生变质，产生大量黄曲霉素。 2010版中国药典，修改增加了很多项目，尤其是增加了安全性控制指标，其中首次增加黄曲霉素控制。,在药典一部中增加了僵蚕、酸枣仁、桃仁、胖大海、陈皮等五个品种的黄曲霉素检查。 2010版药典规定每1000g含黄曲霉素B1不得过5g，含黄曲霉素G2、黄曲霉素G1、黄曲霉素B2和黄曲霉素B1的总量不得过10g。,测定方法,测定黄曲霉毒素B1的方法有薄层色谱法、酶联免疫法、免疫亲和层析净化高效液相色谱法、免疫亲和层析净化荧光光度法等,薄层分析法( TLC),最经典、最常用，至今仍为一些检测机构所用，也是一种国标方法 原理是用适宜的萃取溶剂将黄曲霉素从试样中萃取出来，经柱层析（它利用吸附剂对不同物质吸附能力的差异，用溶剂将混合物的组分逐一洗脱分离的一种分离方法）净化后，再在薄板上展开后分离，利用黄曲霉素的荧光特性,根据荧光斑点的强弱与标准比较确定其含量，对于一些组分很复杂的试样要双向展开，才能获得较高的灵敏度 TLC法设备简单，检测费用低，但操作繁琐费时，萃取和净化效果不理想，灵敏度差，对操作人员的身体健康存在较大程度的危害,原理是根据抗体和抗原之间特异性的免疫学反应，最后用测定酶活力的方法来增加测定的灵敏度 ELISA法将已知的待测AFB1抗原(或抗体)吸附于固定载体的免疫吸附剂上，洗涤未吸附的其他抗原和杂质,加入酶标记的AFB1 抗体(或抗原)与样品中的待测物(抗原或抗体)发生特异免疫学反应，形成酶标记的抗原一抗体复合物，洗涤后，加入酶底物，进行显色反应，通过颜色的深浅来测定AFB1抗原或抗体的含量。,酶联免疫法(ELISA ),ELISA法具有特异性强、干扰小，样品的预处理简便，且快速、灵敏、高效等特点，而且回收率高，提取方法简单，可以进行定性和定量测定，并且对设备装置的投资比HPLC降低了许多，大大节约了测试的成本，因而ELISA已广泛用于食品中黄曲霉毒素的测定。,重复性差，假阳性概率较高,需要配置专门的酶标仪,且对一些富含盐和脂肪的试样需进行额外的处理.,药典检测方法(HPLC),柱后衍生：又称柱后反应。利用衍生反应使被测物与相应的试剂分析反应，以改变其物理或化学性质，使其被检测到。例如将发色基团或荧光基团键合到样品中去，多极放大检测灵敏度,免疫亲和层析净化高效液相色谱法 （IAC/HPLC),试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1，B2,G1，G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水或吐温-20/PBS将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，洗脱液通过带荧光检测器的高效液相色谱仪柱后碘溶液衍生测定黄曲霉毒素的含量。 将免疫亲和柱与高效液相色谱法结合应用是目前采用较多的一种方法，这些新方法新手段的快速应用，为黄曲霉毒素的检测提供了更广泛的选择余地，适应了不同的检测目的和要求 免疫亲和柱：基于抗原抗体反应，特异性抗体连接在柱体内，选择性吸附样品中的待检物，杂质不被吸附，流出柱外，柱上结合的目标物再被特定的洗脱液洗下来，可以用于液相色谱(HPLC)分析或者ELISA含量测定，是一种高效的前处理柱。,免疫亲和层析净化荧光光度法IAC/SFB,黄曲霉毒素速测仪 农业部油料及制品质检中心中国农业科学院油料作物研究所根据 GB/T18979-2003研制成042NYART型黄曲霉毒素速测仪 , 本仪器采用的是免疫亲和层析净化荧光光度法 该方法的原理是利用各种黄曲霉素的荧光特性差异用荧光光度计测定试样中黄曲霉素的含量。 试样经过甲醇一水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1，B2,G1，G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水将免疫亲和柱上杂质除去.以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素总量。 该方法对检测人员身体健康无危害