刺梨叶衰老过程中维生素C含量和部分抗氧化酶活性的变化.pdf

园? 艺? 学? 报?2005,32 ( 6):994 997 ActaHorticulturae Sinica 收稿日期:2004- 12- 17 ; 修回日期:2005- 01- 28 基金项目: 贵州省自然科学基金资助项目( 20033019 ,20043025) 刺梨叶衰老过程中维生素 C含量和部分抗氧化酶 活性的变化 安华明 1 , 2 ? 陈力耕 1 ? 樊卫国 2 ? 刘庆林 2 ( 1浙江大学园艺系, 杭州 310029;2 贵州大学喀斯特山地果树资源研究所, 贵阳 550025) 摘? 要: 以 ?贵农 5号? 刺梨为试材, 研究了其叶片在自然衰老过程中部分相关生理指标的变化。结 果表明, 随着叶片的逐渐衰老, 叶内 O? 2产生速率、MDA 含量、细胞质膜透性显著升高; 而光合色素、维 生素 C含量和 POD、 CAT 活性则显著降低。可溶性蛋白质含量在衰老过程中的降解较为缓慢。其中 O? 2 产 生速率与 MDA含量和细胞质膜透性分别呈显著正相关, 而与维生素 C含量则呈显著负相关。 POD及 CAT 活 性与细胞质膜透性间呈显著负相关关系, 说明两种酶在减缓叶片衰老过程中膜系统伤害方面具有重要作用。 关键词: 刺梨; 叶片; 衰老;O? 2; 维生素 C; POD;CAT 中图分类号:S 66? ? 文献标识码:A? ? 文章编号:0513?353X ( 2005) 06?0994?04 Ascorbate Contents and Activities of Some Antioxidant Enzy mes during Se? nescence ofRosa roxburghii Leaves An Huam ing 1 , 2, Chen L igeng 1, FanWeiguo 2, and L iu Q inglin 2 ( 1D epart ment of H orticulture, Zhejiang University, H angzhou 310029 , China; 2Research Institute for FruitResources of Karst M ountain Region, Guizhou University, Guiyang 550025, China) Abstract : Rosa roxburghii Tratt ?Guinong 5?was used to investigate changes in ascorbate content and activities of some antioxidant enzymes in leaves during senescence .The results showed that O ? 2generation rate , MDA content and plasm amembrane permeability increased , while photosynthetic pigment and ascorbate conten, t POD and CAT activities decreased ,significantly ,together w ith a slow decrease in soluble protein conten, t w ith a progress in the leaf senescence . The change of O ? 2generation rate was correlated significantly and positively w ithMDA content and plasmamembrane per meability ,but significantly and negatively correla? ted w ith ascorbate conten. t The significantly negative correlation between the POD and CAT activities and the plasmam e mbrane per m eability suggests that the two enzymes played i mportant roles in alleviating membrane damage caused by senescence . Key words : Rosa roxburghii Trat; tLea; fSenescence ;O ? 2;Ascorbate ;POD;CAT 植物衰老是复杂的生理过程, 其中活性氧自由基 ( activated oxygen species) 的产生被认为是导致 这一过程的重要原因 1 。事实上, 植物在正常或非正常代谢进程中可通过多种途径产生活性氧自由 基, 同时它们又存在着清除这些自由基的机制,包括保护酶系统,如过氧化物酶 ( POD)、过氧化氢 酶( CAT)、超氧化物歧化酶 ( SOD) 等和非保护酶系统,如维生素 C (AsA)、类胡萝卜素 ( Car . )、 维生素 E等 2 。前人的相关研究多集中在小麦等农作物上 3 ,而对衰老过程中果树维生素 C和抗氧 化酶的响应及调节机理则少有报道。本试验以高维生素 C果树刺梨为试材,研究其叶片在自然衰老 过程中 AsA、自由基及部分抗氧化酶活性的变化及其之间的相互关系,为揭示其抗衰老机理提供理论 依据。 1? 材料与方法 供试叶样取自 3年生刺梨优良无性系 ?贵农 5号 ?(Rosa roxburghii T ratt ?Guinong 5? ),种植 ?6期安华明等: 刺梨叶衰老过程中维生素 C含量和部分抗氧化酶活性的变化? 于贵州大学园艺系刺梨种质资源圃。于 2004年 5月挂牌标记植株新生枝条 20枝,观察记录其新 生叶片的时间,并于 8月份分别取标记枝条中上部叶龄 30 40 d的完全展开叶( 简称展叶 )、中 下部叶龄 60 70 d的成熟叶 ( 简称成叶 ) 和基部叶龄 100 d以上的衰老叶(简称老叶 ) 各 20 g。 部分样品立刻用于质膜透性测定,剩余样品经液氮处理后,转入 - 20? 下低温保存,用于测定其 它生理指标。 质膜透性采用相对电导法测定 4。按文献 5 的方法浸提色素, 并用文献 4 的方法测定和 计算叶绿素 a ( Chl?a)、叶绿素 b ( Chl?b) 和类胡萝卜素 ( Car?) 含量。O ? 2产生速率参照王爱国等 的方法 6 测定。酶液制备时, 取 0?5 g叶片于预冷的研钵中, 加入 10mL的 50mmol? L- 1磷酸钾缓冲 液( pH 7?8) 研磨成匀浆并全部转入离心管中,于15 000 ? g离心 15 m in , 上清液即为酶液。以上操 作都在 4? 下进行。取上清液测定 POD 7 、CAT 7 、丙二醛 (MDA)8 和可溶性蛋白质含量 4 ,其中 POD和 CAT活性被定义为每分钟 OD值减少 1?00为 1个活力单位 (U? m in - 1 ? g - 1 FM )。AsA和脱氢 抗坏血酸 ( DHA) 用 5 %的偏磷酸提取, 然后用紫外分光光度计法 9 测定含量。 2? 结果与分析 2?1? 刺梨叶衰老过程中光合色素含量的变化 ? 从图 1可知,刺梨叶片在从完全展开到成熟 的过程中, 其 Chl?a 、Chl?b 、Chl? ( a+ b) 及 Car? 含量的变化较为平缓, 之后随着衰老过程的加剧, 它们的含量急剧降低, 植株基部老叶内的含量比 成熟叶分别降低了 68?0 %、 86?2% 、 73?0% 和 37?2% 。这与肉眼观察到的老叶的黄化现象相吻 合。 2?2? 刺梨叶衰老过程中 O ? 2产生速率、MDA含 量和细胞质膜透性的变化 刺梨叶在成熟和衰老过程中都有 O ? 2的产生, 但老叶的 O ? 2产生速率急剧增加,与展叶和成叶 分别呈显著( P 100 ? 0?63aA ? 55?84aA ? 0?55aA ? 成叶 M ature leaf 60 70 ? 0?52bAB ? 33?46bAB ? 0?45bAB ? 展叶 Fully expanding leaf 30 40 ? 0?46bB ? 21?69bB ? 0?39bB ? ? ? 注: 大小写字母分别表示 0?01和 0?05水平的显著性差异。 Note :Capita l letters and sma ll letters indicate significance atP 0 ?01 and P 0?05 respectively. 995 园? ? 艺? ? 学? ? 报32卷 2?3? 刺梨叶衰老过程中 AsA和 DHA含量的变化 ? 对刺梨不同叶龄叶片中还原型( AsA)、氧化 型( DHA) 及总维生素 C分析表明,其含量变化 的总趋势是随着叶片的成熟和衰老而逐渐降低。 叶片从展开到成熟, 其 AsA含量没有明显变化, 说明这期间的合成和降解基本平衡,但随着叶片 的逐渐衰老和 (抗 ) 氧化过程的进行,AsA也逐 渐被氧化降解, 直至在叶龄 100 d以上的衰老叶 中检测不到其含量。对 DHA和总维生素 C而言, 它们的含量都随叶片的成熟和衰老而显著降低, 但在叶龄约 1月的完全展开叶片中,DHA具有较 高的含量并占总维生素 C的 67 % 左右(图 2)。 图 2? 刺梨叶衰老过程中维生素 C含量的变化 Fig .2?Changes of ascorbate contents in R.roxburghii Tratt leaf during senescence ? 以往的研究表明, 作为高等植物中抗氧化系统的重要组分,AsA可以直接清除 O ? 2等自由基 11 。 对刺梨叶片 O ? 2产生速率和 AsA的相关性分析表明,它们之间存在着显著负相关( r= - 0?9723 * ), 说明 AsA在抑制 O ? 2产生和减缓氧伤害过程中起着非常重要的作用。 2?4? 刺梨叶衰老过程中 POD、CAT及可溶性蛋白质含量的变化 POD和 CAT都是抗氧化酶类,是植物体内活性氧的清除剂。图 3表明,POD和 CAT活性都随叶 片的成熟和衰老逐渐降低,但在展叶和成叶之间并无显著差异,只分别降低了 28?5 % 和 17?7 %。随 着叶片的衰老,两种酶活性急剧降低, 与成叶相比,老叶中 POD和 CAT 活性分别降低了 62?2 % 和 40?5 %,差异达到显著水平(P 0?05)。相关性分析表明,POD和 CAT与质膜透性间均存在显著负 相关 (相关系数分别为 - 0?9998 * 和 - 0?9995 * ), 说明它们在保护膜系统结构方面具有非常重要的作 用。 图 4表明, 刺梨叶在成熟和衰老进程中可溶性蛋白质降解较为缓慢, 但各叶龄间的含量没有显著 差异。 3? 讨论 活性氧自由基产生和清除的平衡被打破及活性氧自由基积累被认为是导致植物衰老的主要原因, 该过程及其伴随的 MDA的产生可以使叶绿素和蛋白质发生降解, 并对质膜产生伤害 2。刺梨叶在衰 老过程中 O ? 2产生速率、MDA含量、质膜透性均显著增高,而叶绿素及可溶性蛋白质含量、POD和 CAT活性则显著降低,这些生理指标的变化与该理论基本一致。 996 ?6期安华明等: 刺梨叶衰老过程中维生素 C含量和部分抗氧化酶活性的变化? 近年来的研究表明,作为植物非保护酶系统的重要组分,AsA在清除活性氧自由基及抗氧化方面 具有非常重要的生理功能。它可以直接清除 1O 2、O ? 2及? OH 等活性氧自由基 11, 还能维持另一重要 抗氧化剂维生素 E 的还原态 12 ,并通过抗坏血酸 - 谷光甘肽循环( AsA? GSH cycle) 间接清除 H2O2 13 等。图 2显示, 随着刺梨叶片的衰老,AsA含量急剧降低直至检测不到其含量。这可能是因 为: 一方面 AsA在参与清除自由基的同时自身被氧化成 DHA (后者可被进一步降解为不具活性的 2?3- 二酮古洛糖酸 ),AsA含量与 O ? 2产生速率的显著负相关性可作为部分证据; 另一方面,衰老使 合成 AsA的必需酶失去活性,如在老叶中已检测不到 AsA生物合成关键酶半乳糖内酯脱氢酶的活性 (数据未显示 )。至于有关维生素 C特别是 DHA在刺梨叶衰老过程中的具体代谢循环过程仍有待进一 步研究。 参考文献: 1? Thompson J E,Ledge R L,Barber R F. The role of free radicals in senescence and wounding . New Phytolog ist , 1987, 105: 317 344 2? 白宝璋, 韦宏恩, 靳占忠. 植物生理学. 北京: 中国科学技术出版社,1995. 237 256 Bai B Z, W eiH E,Jin Z Z. P lant physio logy. Beijing: China Science and Technology Press , 1995. 237 256 ( in Chinese) 3? 肖? 凯, 王殿武, 张荣铣, 方? 敏. 小麦叶片衰老生理变化的研究. 国外农学 - 麦类作物,1994 ,1 :46 48 X iao K, W ang D W, Zhang R X, FangM. Study on physiological changes in leaf senescence ofwheat . Agriculture Overseas- wheat Crop , 1994, 1 :46 48 ( in Chinese) 4? 邹? 崎. 植物生理生化实验指导. 北京: 中国农业出版社,1995 . 4 99 Zou Q. Experi mental guidance of plant physiology and biochem istry. 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