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刺葡萄籽中原花青素的提取与成分分析 马玉美 1 , 王辉宪 1 , 谢聃 1 , 王仁才 2 , 熊兴耀 2 (1 .湖南农业大学理学院, 湖南长沙4 1 0 1 2 8;2 .湖南农业大学园艺园林学院, 湖南长沙4 1 0 1 2 8) 摘要: 对刺葡萄籽中原花青素的提取和纯化工艺做了初步的研究。采用传统的溶剂提取法, 对影响提取效果的4个主要因素提取剂浓度、 料液比、 提取温度和提取时间进行了研究, 通 过正交分析得出最佳提取工艺: 提取剂为7 0 %乙醇, 料液比 (w / v) 为1 7, 提取温度为6 0 , 提取 时间为2 h。并用有机溶剂萃取法初步分离出低聚原花青素和高聚原花青素。通过H P L C对原花 青素低聚物进行了成分分析, 结果表明, 所提取的产品与原花青素标准品成分基本一致。 关键词: 综合利用; 刺葡萄籽; 原花青素; 提取工艺; 成分分析。 中图分类号:T S 2 6 2 . 6;S 6 6 3 . 1;X 7 9 7文献标识码:B文章编号:1 0 0 1 - 9 2 8 6(2 0 0 7)0 6 - 0 1 1 7 - 0 4 E x t r a c t i o no f P r o c y a n i d i n s f r o mG r a p e S e e d 2 . C o l l e g e o f H o r t i c u l t u r e a n d F o r e s t r y S c i e n c e s , H u n a n A g r i c u l t u r a l U n i v e r s i t y , C h a n g s h a , H u n a n 4 1 0 1 2 8 , C h i n a ) A b s t r a c t : T h e e x t r a c t i o n a n d t h e p u r i f i c a t i o n t e c h n i q u e s o f p r o c y a n i d i n s f r o mg r a p e(V i t i s d a v i d i i F o !x)s e e d w e r e s t u d i e d . T h e f o u r m a i nf a c t o r s i n f l u e n c i n gt r a d i t i o n a l s o l v e n t e x t r a c t i o ni n c l u d i n ge x t r a c t i n gr e a g e n t c o n c e n t r a t i o n , p r o p o r t i o no f m a t e r i a l a n d e x t r a c t i n g r e a g e n t , e x t r a c t i n g t e m p e r a t u r e a n d t i m e w e r e i n v e s t i g a t e d . T h e o p t i m u mt e c h n i c a l c o n d i t i o n s w e r e s u m m e d u p a s f o l l o w s t h r o u g h o r t h o g o n a l e x p e r i m e n t s : e x t r a c t i n g r e a g e n t w a s 7 0%a q u e o u s e t h a n o l s o l u t i o n , p r o p o r t i o n o f m a t e r i a l a n d e x t r a c t i n g r e a g e n t w a s 1 7 , t e m p e r a t u r e w a s a t 6 0 , a n d e x t r a c t i n g t i m e w a s 2 . 0 h o u r s . F u r t h e r m o r e , p r o - c y a n i d i n s l o wp o l y m e r a n d p r o c y a n i d i n s h i g h p o l y m e r w e r e s e p a r a t e d b y o r g a n i c r e a g e n t e x t r a c t i o n . T h e c o m p o s i t i o n a n a - l y s i s o f p r o c y a n i d i n s l o wp o l y m e r b y H P L Cs h o w e d t h a t t h e c o m p o s i t i o n s o f t h e e x t r a c t e d p r o d u c t w e r e t h e a l m o s t s a m e a s t h e c o m p o s i t i o n s o f s t a n d a r d p r o c y a n i d i n s . K e yw o r d s : c o m p r e h e n s i v e u t i l i z a t i o n ; g r a p e s e e d ; p r o c y a n i d i n s ; e x t r a c t i o n t e c h n i q u e s ; c o m p o s i t i o n a n a l y s i s 原花青素 (P r o c y a n i d i n s,简称P C,英文曾用名 P r o a n t h o c y a n i d i n s,P y c n o g e n o l,L e u c o a n - T h o c y a n i d i n)是 植物中广泛存在的一类属于双黄酮衍生物的天然多酚 化合物, 有人将其归为生物类黄酮 1 , 2 , 也有人将其归为 缩合鞣质 3 。这类化合物由不同数量的儿茶素或表儿茶 素结合而成, 最简单的是儿茶素、 表儿茶素或儿茶素与 表儿茶素形成的二聚体, 此外还有三聚体、 四聚体等直 至十聚体。 研究表明, 原花青素具有极强的抗氧化特性, 一般存在于植物的果实、 种子、 花和皮中, 在葡萄、 山楂、 花生、 银杏、 白桦树、 松树等植物中的含量都很丰富 4 。 原 花青素具有多种生物活性, 能防治多种疾病, 以其高效、 低毒、 高生物利用率而著称, 在植物中其主要作用是保 护植物中易被氧化的成分, 在人体内的抗氧化和清除自 由基的能力是VE的5 0倍、V c的2 0倍 5 , 6 , 并且还具有 保护心血管、 预防高血压、 抗肿瘤、 抗辐射、 抗突变及美 容等作用 7 。 我国葡萄资源丰富, 每年用于酿造酒和其他饮料的 鲜葡萄量很大, 据统计超过1 0万t。葡萄籽源于葡萄酒 的副产品, 占整粒葡萄的4 %6 %, 仅此每年我国生产 葡萄酒后的废渣中就有4 0 0 6 0 0万k g的葡萄籽 5 , 8 。葡 萄籽中含有大量的原花青素, 因此充分利用好酿酒后的 葡萄籽资源, 不仅物尽其用, 而且还会带来巨大的经济 效益。 湖南省怀化芷江地区的高山刺葡萄是湖南省农业 产业调整中优先发展的一种经济水果, 为了实现对其的 基金项目: 湖南省科技厅资助项目( 0 5 S K3 0 8 3 )。 收稿日期:2 0 0 7 - 0 3 - 2 7 作者简介：马玉美( 1 9 8 2 - ), 女, 河北廊坊人, 硕士研究生, 主要从事植物功能成分的纯化与应用研究。 通讯作者: 熊兴耀。 酿酒科技2 0 0 7年第6期( 总第1 5 6期) L I Q U O R - MA K I N GS C I E N C E 甲醇为色谱纯; 葡萄 籽为湖南省怀化芷江地区产高山刺葡萄籽; 原花青素对 照品(纯度9 5 %)为天津尖峰天然产物开发公司。 仪器:食品粉碎机,组合恒温磁力搅拌器,R E - 5 2 A A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂);S H B - 循环 水式多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司),D L S B - 5 / 1 0型低温冷却液循环泵(郑州长城科工贸有限公司); L X J - 离心沉淀机(上海医用分析仪器厂);D 2 - 2 B C型 真空干燥箱(天津泰斯特仪器有限公司);E S - 1 1 0 0电子 天平(长沙湘平科技发展有限公司);V I S - 7 2 2 0紫外分光 光度计(北京瑞利分析仪器厂);L C - 1 0 AV P高效液相色 谱仪。 1 . 2提取方法及影响因素 1 . 2 . 1原花青素的提取工艺流程 葡萄籽 ( 粉碎)超临界C O2法脱去葡萄籽中的油脂 N a C l溶液处理去除蛋白质葡萄籽渣提取剂提取离心分 离( 上清液)减压浓缩乙酸乙酯萃取减压浓缩真空干 燥粗产品 1 . 2 . 2原料处理 1 . 2 . 2 . 1葡萄籽粉碎 新鲜的葡萄经处理后, 收集葡萄籽, 自然风干。 将干 燥好的葡萄籽用粉碎机粉碎至3 0 4 0目。 1 . 2 . 2 . 2超临界C O2法脱脂 为了实现对葡萄籽进行综合利用,首先用超临界 C O2法提取葡萄籽油( 提取工艺条件和所得葡萄籽油成 分分析已有另一论文发表) 。 1 . 2 . 2 . 3盐析法去除蛋白质 将脱脂后的葡萄籽粉阴干,用5 %N a C l溶液以1 5 料液比于室温下搅拌提取1 h以去除其中的蛋白质, 抽 滤, 蒸馏水洗涤葡萄籽渣, 滤渣阴干备用。 1 . 2 . 3提取剂种类对提取的影响 原花青素为极性物质,能溶于水和多种有机溶剂。 选取乙醇和丙酮作为提取剂。称取1 0 0 g上述处理好的 滤渣1 0份, 置于1 0 0 0 m L三口烧瓶内, 分别加入5 0 %、 6 0 %、7 0 %、8 0 %和9 0 %的乙醇水溶液和5 0 %、6 0 %、 7 0 %、8 0 %和9 0 %的丙酮水溶液各7 0 0 m L, 用6 0 恒 温水浴加热, 搅拌提取2 h, 冷却后在3 6 0 0 r / m i n条件下 离心2 0 m i n。将上清液减压蒸馏(4 5 ) 至无馏分馏 出, 离心分离。将上清液用铁盐催化比色法 9 在5 4 6 n m 波长下测定其吸光度。 1 . 2 . 4提取次数对提取的影响 称取1 0 0 g上述处理好的滤渣1份,置于1 0 0 0 m L 三口烧瓶内, 加入7 0 %乙醇提取液7 0 0 m L, 用6 0 恒 温水浴加热, 搅拌提取2 h, 冷却后在3 6 0 0 r / m i n条件下 离心2 0 m i n。将上清液减压蒸馏(4 5 ) 至无馏分馏 出, 离心分离。把已提取过的葡萄籽再进行第二次提取 和第三次提取, 后续处理同前。 分别将3次提取离心分离所得上清液用铁盐催化 比色法在5 4 6 n m波长下测定其吸光度。 1 . 2 . 5正交实验 通过对上述实验结果进行初步分析, 认为影响葡萄 籽中原花青素提取的主要因素有乙醇水溶液浓度、 料液 比、 提取温度和提取时间。为此设计了四因素四水平正 交实验L 1 6( 4 4 ), 以优化提取条件, 设计方案见表1。 根据正交实验结果, 确定提取刺葡萄籽中原花青素 的最佳工艺条件。 1 . 3高聚、 低聚原花青素的初步分离 准确称取处理好的葡萄籽1 0 0 g在最佳条件下提 取, 提取液用旋转蒸发仪减压蒸馏(4 5 ) 至无馏分 馏出, 离心分离。上清液用4倍体积的乙酸乙酯分4次 萃取, 合并乙酸乙酯相, 减压蒸馏( 3 5 )至有少量沉 淀析出后置于真空干燥箱干燥( 3 0 ) 2 h。 得低聚原花 青素粗产品, 称重为0 . 4 6 0 8 g, 计算得率为0 . 4 6 0 8 %。将 乙酸乙酯萃取后的水相用3倍体积的正丁醇分5次萃 取, 合并萃取液, 减压浓缩后置于真空干燥箱中真空干 燥( 4 0 ) 2 h, 得高聚原花青素粗产品。称重为0 . 3 2 6 1 g, 计算得率为0 . 3 2 6 1 %。 1 . 4原花青素的H P L C检测 1 . 4 . 1色谱条件 色谱柱,V P - O D S不锈钢柱 (4 . 5 m m I D 1 5 0 m m) ; 流动相,甲醇/水( 1 8 / 8 6 , v / v ) (水为二次蒸馏水); 流速为 0 . 9 m L / m i n ;检测波长2 8 0 n m; 进样量2 0 L。 1 . 4 . 2样品的制备 准确称取0 . 1 0 0 0 g原花青素标准品(纯度9 5 %, 天 津尖峰天然产物开发公司), 用色谱纯甲醇定容于1 0 m L 容量瓶, 所得标准品浓度为1 0 m g / m L。准确称取按最佳 ! “#$%3!2!2! 9! 34567! 84!9:!2;3!9!4!2!;!8!;!9:;72! =!;!;!;!7!9:;?! ?!8!;!7!2!9:82=! 8! 29!;!8!7!;!9:7?! 22!8!8!;!8!9:=72! 2;!7!8!8!2!9:=?! 28!2!7!;!2!9:=?! 27!;!7!8!8!9:78! 2!8!7!2!;!9:77! 2=!7!7!7!7!9:;2! A!“#$%&!“#(!“#&!“#)&“! *!“#$%&!“#&$%!“#()!“#)$“! *!“#$%&!#()%!“#&“*!“#)$(! +!“#$%!“#&$!“#(%!“#()*! !+#(%! +#)%$!+#)&)%!+#(&,&! !+#),$! +#%“&!+#(&(+!+#(“+%! !+#($“&! +#$&,$!+#(%*&!+#)*$&! !+#)&+! +#(+!+#)$!+#)$*&! -.!+#+&()! +#)%$,!+#“%,$!+#“%&+! /012!3!“!“!“! 1 1 9 酿酒科技2 0 0 7年第6期( 总第1 5 6期) L I Q U O R - MA K I N GS C I E N C E&T E C H N O L O G Y 2 0 0 7N o . 6 ( T o l . 1 5 6) 图3提取原花青素色谱图 可得到4个明显的谱带, 而我们按照最佳提取条件所提 取的低聚原花青素粗产品在相同检测条件下可得到3 个与标准品相匹配的谱带(见图3 ), 由此可以看出, 我们 所提取的原花青素与原花青素标准品成分基本一致, 这 也为原花青素的进一步分离纯化打下了基础。 3结论 3 . 1原花青素遇热不稳定,在提取的系列操作中容易 被氧化, 应尽量在低温、 真空的环境下完成。 3 . 2以刺葡萄籽为原料,对其原花青素的提取条件进 行了探讨, 结果表明, 乙醇是一种经济、 安全、 提取效率 较高的提取剂。 3 . 3根据正交实验结果得原花青素最佳提取方案: 提 取温度为6 0 , 提取时间为2 h, 提取剂为7 0 %乙醇, 料液比(w / v) 为1 7, 提取次数为2次。 3 . 4根据H P L C分析结果,可知在最佳提取条件下提 取的低聚原花青素粗产品与原花青素标准品的成分基 本一致, 为我们进一步分离、 纯化低聚原花青素提供了 参考。 参考文献: 1 王宪楷.天然药物化学 M .北京: 人民卫生出版社, 1 9 8 5 . 2 吕丽爽,曹栋.薄层色谱法分离葡萄籽中的低聚原花青素 J . 无锡轻工大学学报, 2 0 0 1 , 2 0 ( 1 ):6 5 - 6 7 . 3 北京医学院.中草药成分化学 M .北京: 人民卫生出版社, 1 9 8 0 . 4 由倍安.葡萄籽原花青素药理研究进展 J .国外医学老年医 学分册, 2 0 0 3 , 2 4 ( 3 ):1 2 3 - 1 2 7 . 5 王洪新,汤坚,吴晓燕,等.葡萄籽中抗氧化剂的精制及抗氧活 性的测定 J .中国油脂, 1 9 9 0 , 1 5 ( 4 ):9 - 1 4 . 6 万本屹,李宏,董海洲.葡萄籽原花青素提取及其应用研究进 展 J .粮食与油脂, 2 0 0 2,( 2 ):4 3 - 4 5 . 7 向阳,马龙,苏德奇.比色法测定葡萄皮和葡萄籽中原花青素 的含量 J .中国公共卫生, 2 0 0 3 , 1 9 ( 1 0 ):1 2 2 8 - 1 2 2 9 . 8 吕丽爽,曹栋.葡萄籽中低聚原花青素的研制 J .中国油脂, 2 0 0 1 , 2 6 ( 1 ):3 8 - 4 9 . 9 傅武胜,蔡一新,林丽玉, 等.铁盐催化比色法测定葡萄籽提取 物中的原花青素 J .食品与发酵工业, 2 0 0 1 , 2 7 ( 1 0 ):5 7 - 6 1 . 1 0